COX-2和PPARγ在肝纤维化中的研究进展

肝纤维化是多种慢性肝病转为肝硬化的中间过程,其特征为肝脏细胞外基质(ECM)的合成超过降解。而肝星状细胞(HSC)是细胞外基质的主要来源,激活并不断增殖成为肝纤维化发生、发展中的核心环节。多种细胞因子与肝纤维化存在着密切关系,其中环加氧酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶,有COX-1、COX-2与COX-3三种异构体,其中C0X-2属诱导型酶,在多种因素刺激下表达上调,促进HSC活化、增殖及ECM生成、增加,诱导肝纤维化的进展。过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARs)属于核激素核受体超家族,有PPARα、PPARβ、PPARγ三种亚型,其中PPARγ抑制HSC活化、增殖及ECM生成、增加,在肝纤维化进展过程中起重要作用。该文就COX-2、PPARγ在肝纤维化疾病中研究的进展予以综述。     

野生型PTEN过表达对体外活化大鼠肝星状细胞ERK信号转导的影响

【摘要】 目的 探讨野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）过表达对体外活化大鼠肝星状细胞（HSC）的细胞外信号调节激酶（ERK）信号转导的影响。方法〓利用瞬时转染技术,以腺病毒为载体,将野生型PTEN基因转染体外培养的活化大鼠 HSC;采用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测HSC 的PTEN、ERK1蛋白及mRNA表达;并应用Western blot技术检测HSC 的磷酸化ERK（p ERK）表达。 结果 外源性野生型PTEN基因在活化HSC大量表达,并显著下调HSC的p ERK 表达 (P＜005),而对HSC的ERK1蛋白及mRNA表达均无影响（P＞050）。结论〓野生型PTEN过表达通过抑制ERK的磷酸化负性调控体外活化大鼠HSC的ERK信号转导。     

野生型PTEN 过表达对体外活化肝星状细胞内钙离子浓度的影响

目的 探讨野生型第10 号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）过表达对体外活化肝星状细胞（HSC）内钙离子浓度的影响。方法 体外培养活化大鼠肝星状细胞系（HSC-T6）,利用腺病毒载体,将野生型PTEN 基因转染活化HSC ;Western blot 及实时荧光定量聚合酶链反应（qrt-PCR）检测HSC 的PTEN 蛋白及mRNA 表达;采用钙离子荧光探针Rhod-2/AM,于激光扫描共聚焦显微镜下检测HSC 内钙离子浓度变化。实验分组：① Control 组：腺病毒转染时以DMEM 代替病毒液;② Ad-GFP 组：转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照空病毒Ad-GFP ;③ Ad-PTEN 组：转染携带野生型PTEN 基因并表达GFP 的重组腺病毒Ad-PTEN。结果 野生型PTEN 在活化大鼠HSC 大量表达,3 组HSC 内钙离子浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）,Ad-PTEN 组HSC 内钙离子浓度（251.60±90.88）低于Control 组（1 953.95±132.99）及Ad-GFP 组（1 937.57±115.17）,而Control 组与Ad-GFP 组之间HSC 内钙离子浓度比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 野生型PTEN 过表达可降低体外活化大鼠HSC 内钙离子浓度。     

PPAR-γ调控的自噬通路在染料木黄酮抑制肝星状细胞激活过程中的作用

目的探讨染料木黄酮在体外抑制肝星状细胞（HSC）活化的效应以及PPAR-γ调控的自噬通路在其中发挥的作用。方法 将体外培养的HSC细胞分别给予不同浓度的染料木黄酮作用48 h后,用Western blot法测定HSC激活标志蛋白α-SMA、α1（I） collagen的表达以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ\p62和PPAR-γ的表达;利用自噬抑制剂和PPAR-γ抑制剂验证自噬在染料木黄酮抑制 HSC激活过程中的作用以及PPAR-γ对自噬的调控作用。结果染料木黄酮作用于HSC细胞后,HSC活化标志蛋白α-SMA、α1 （I）collagen的水平明显降低（P<0.05）,而自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达明显升高、泛素结合蛋白p62水平明显降低,同时PPAR-γ 表达明显增加（P<0.05）;与单纯染料木黄酮刺激组相比,用3-MA处理后HSC活化标志蛋白α-SMA、α1（I）collagen的表达明显 升高;并且加入PPAR-γ抑制剂后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达明显降低、泛素结合蛋白p62 水平明显增加（P<0.05）。结论 PPAR-γ调控的自噬通路在染料木黄酮抑制HSC细胞激活的过程中发挥着重要作用。     

整合素α5β1与大鼠肝纤维化发生的实验研究

[目的]肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化的病理基础,本研究旨在探讨整合素受体在HSC活化及肝纤维化过程中的作用。[方法]制作大鼠肝硬化模型,同时进行体外细胞株HSC—T6实验。用免疫组化法观察仅平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、整合素α5β1及纤维连接蛋白（FN）的表达。HSC细胞株在FN包被的皿上培养,测定细胞活化、α-SMA、整合素α5β1蛋白表达。[结果]（1）模型组肝组织FN、α-SMA和α5β1蛋白表达增多。（2）FN包被明星促进HSC—T6的活化、α—SMA及α5β1的表达。[结论]FN促进整合素α5β1表达是活化HSC、促进肝纤维化的重要途径。     

复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响

【目的】观察复方肝毒清对铁超载肝星状细胞（HSC）活化和凋亡的影响【方法】体外培养HSC—T6细胞,分为正常对照组、模型组、中药组（给药浓度为0．08g/L）。以柠檬酸铁胺（FAC）与HSC—T6细胞共同温育,建立HSC铁超载模型。采用免疫组化法检测HSC—T6细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,半定量聚合酶链反应（PCR）法检测细胞转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA的表达,TUNEL法检测HSC—T6细胞的凋亡,电镜观察HSC—T6细胞超微结构。【结果】正常对照组和模型组HSC-T6细胞α-SMA大量表达,未见或仅见有较少细胞发生凋亡,而中药组HSC细胞α-SMA表达明显减少,TGF-β1 mRNA表达显著降低（P〈0．05）,且出现明显细胞凋亡。【结论】中药复方肝毒清可能通过调节细胞铁的代谢,抑制HSC活化并诱导其发生凋亡,从而在体外发挥抗肝纤维化作用。     

LPS诱导HSC增殖与提高其胶原表达水平的细胞模型研究

目的建立较为全面反映肝星状细胞活化效应的细胞模型。方法应用脂多糖刺激体外培养的大鼠HSC。MTT法测定HSC增殖率。免疫组化法显示HSC表达Ⅰ、Ⅲ型胶原水平，并进行图像分析。结果LPS明显刺激HSC的增殖和提高其Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平，与对照组比较有非常显著性差异（P〈0．01）。结论LPS诱导HSC活化模型能够相对全面反映HSC活化效应。     

牛磺酸在大鼠肝星状细胞中的抗氧化作用

目的：探讨牛磺酸在体外培养的大鼠肝星状细胞（HSC）的抗氧化作用。 方法：将新鲜分离的大鼠HSC分别在普通培养基、含25及50 mmol•L^-1牛磺酸的培养基中孵育培养,检测三种培养基上清中脂质过氧化物(LPO)、羟脯氨酸的表达水平及三种培养基培养的HSC表达转化生长因子β1（TGF-β1）的水平。利用BrdU法检测牛磺酸对HSC增殖的影响。结果：HSC活化后,各培养液上清中LPO浓度均较活化前明显上升（P<0.05）;在含25及50 mmol•L^-1牛磺酸培养基中培养的HSC与普通培养基培养的HSC相比, LPO及羟脯氨酸的分泌水平明显下降（P<0.05）;与普通培养基相比,两组牛磺酸培养基培养的HSC表达TGF-β1明显减少（P<0.05）; 50 mmol•L^-1牛磺酸可以明显抑制HSC的增殖（P<0.05）。 结论：牛磺酸在体外实验中可以有效抑制大鼠肝星状细胞的LPO及羟脯氨酸的合成,并显示出显著的抑制HSC增殖的作用,提示牛磺酸可能在抗肝纤维化治疗中作为抗氧化剂具有重要的治疗价值。     

还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞增殖及活化的影响

目的探讨还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞（HSC）=T6增殖及活化的影响。方法选择脂多糖（LPS）活化HSC—T6的最适作用浓度及作用时间;分别采不同浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）作用于经LPS活化的大鼠HSC—T6,24h后进行如下实验：噻唑兰（MTT）比色法检测HSC—T6增殖;化学发光免疫法检测细胞上清液中透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原的含量;免疫细胞化学染色图像分析HSC—T6中a—SMA的表达。结果0．1gg／mlLPS在作用24h时HSC—T6活化明显;GSH能够抑制HSC—T6的增殖及活化（P〈O．05）,减少其细胞外基质（ECM）HA和Ⅳ型胶原的表达（P〈0．05）,作用呈剂量依赖性。结论GSH可能通过抑制HSC—T6的增殖及活化,减少其ECM的产生,进而减缓肝纤维化的进展。     

川芎嗪抑制H_2O_2诱导肝星状细胞活化的研究

目的建立体外氧化应激诱导肝星状细胞(HSC)活化模型,探讨活血化瘀中药活性成分川芎嗪对该HSC活化模型的作用及潜在机制。方法原代大鼠HSC体外给予不同剂量过氧化氢(H2O2)处理并检测HSC活化标志物,筛选出H2O2诱导HSC活化的有效浓度;以MTS法和流式细胞术检测川芎嗪对H2O2刺激下HSC增殖与凋亡的影响;以Real-time PCR和Western blot检测H2O2刺激下HSC中肝纤维化标志物的基因与蛋白表达。结果体外H2O2在5μmol/L剂量下能够显著促进HSC增殖和活化标志物的表达。川芎嗪能够剂量依赖性地抑制H2O2诱导的HSC增殖,诱导其发生凋亡,并降低肝纤维化标志物的基因与蛋白表达;此外,川芎嗪还可抑制基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1(TIMP-1)的蛋白表达,从而调控ECM的降解平衡。结论川芎嗪能抑制H2O2诱导的氧化应激状态下的HSC活化,可作为抗肝纤维化潜在药物进一步研究其作用机理。     

PPARγ在慢性乙型病毒型肝炎患者肝组织中的表达及意义

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在慢性乙型病毒型肝炎患者肝组织中的表达,并探讨其临床意义.方法:采用半定量RT-PCR法和免疫组化的方法检测慢性乙型肝炎患者肝组织中PPARγ表达情况,创伤意外肝破裂来源的正常肝组织作为正常对照.结果:肝组织中PPARγ水平与肝组织炎症无明显相关性(γ=0.457,P＞0.05);而正常肝组织和纤维化SO期等肝组织中PPARγ呈明显阳性,而纤维化S3、s4期肝组织中PPARγ表达呈弱阳性,强度明显低于正常肝组织(P＜0.05).PPARγ基因表达水平随着肝纤维化程度的增加而不断下降.结论:PPARγ在明显肝纤维化肝组织中表达下调,可能参与了慢性乙型肝炎肝纤维化的发病机制.     

巨噬细胞游走抑制因子参与肝星状细胞活化的实验研究

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC)活化过程中表达巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的变化,以及MIF特异的反义寡核苷酸(MIF-ASONs)对活化的原代HSC表达MIF和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。 方法 检测分离培养不同时间(1、3、5、7和10 d)的HSC,以及转染MIF-ASONs后的HSC中MIF和α-SMA的表达。基因表达用RT-PCR,蛋白表达用酶联免疫吸附(ELISA)、免疫荧光(IF)或免疫细胞化学(ICC)检测。 结果 随着培养时间延长,原代HSC形态逐渐改变,脂滴减少消失,自行激活;MIF基因和蛋白表达逐渐增加(P<0.05),且MIF与α-SMA mRNA表达正相关(r=0.944,P<0.01);活化的原代HSC转染MIF-ASONs后MIF与α-SMA基因表达和MIF蛋白表达均比对照组低(P<0.05)。 结论 HSC活化过程中,MIF表达逐渐增加并与α-SMA正相关;MIF-ASONs可抑制HSC活化,提示MIF是HSC活化过程中一种重要的细胞因子,可能参与肝纤维化的发生。     

川芎嗪对内毒素刺激肝星状细胞增殖和胶原表达的影响

目的 观察川芎嗪对内毒素刺激的大鼠肝星状细胞（HSC）增殖和胶原表达的影响,探讨川芎嗪抗肝纤维化的作用机制.方法 于内毒素中刺激大鼠HSC的基础上加川芎嗪分组培养;并采用MTT法检测川芎嗪对HSC生长增殖的抑制作用,免疫细胞化学染色法观察HSC α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,同时采用ELISA法检测其上清液Ⅰ、Ⅲ型胶原水平.结果 川芎嗪对内毒素刺激的HSC增殖有抑制作用,能下调活化HSC α-SMA的表达,对HSC Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌也有明显抑制作用,并呈剂量依赖性.结论 川芎嗪能抑制内毒素刺激的HSC活化增殖和分泌胶原,为探索川芎嗪抗肝纤维化的分子机制提供了实验依据.     

粉防己碱抑制肝星状细胞活化与转化生长因子-β信号转导关系

目的观察不同剂量粉防己碱对静止期大鼠肝星状细胞（HSC）活化的影响,以及该作用与转化生长因子-β（TGF-β）信号转导的关系.方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离正常大鼠HSC,培养48h后并给予不同浓度粉防己碱（0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L）处理.观察HSC形态学变化.采用免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达并进行图像分析;放射免疫法检测上清层粘连蛋白（LN）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TGF-β1、Smad 7 mRNA表达;Western blot法检测给予粉防己碱1.0mg/L处理的Smad 7表达.结果粉防己碱0.25～2.0 mg/L能抑制体外培养静止期HSC形态向成纤维细胞样转化;降低α-SMA、LN和PCⅢ表达;RT-PCR显示粉防己碱抑制HSC TGF-β1 mRNA表达,抑制率最高达87.85%（P＜0.01）,同时上调Smad 7 mRNA表达,达对照组的2.4～5.8倍（P＜0.01）,两者呈显著负相关（r=-0.755,P＜0.01）.Western blot也显示,与对照组相比,粉防己碱（1.0 mg/L）显著上调Smad 7蛋白表达.结论粉防己碱能直接抑制体外培养的静止期HSC活化,该作用可能是上调Smad 7、影响TGF-β1信号通路并抑制TGF-β1表达的结果.     

肝纤维化早期肠源性内毒素血症对肝星形细胞活化的影响

目的探讨早期肝纤维化时肠源性内毒素血症（IETM）对肝星形细胞（HSC）的活化有无影响。方法采用复合因子方法复制肝纤维化模型，同时加甘氨酸治疗组。饲养3周后，透射电镜下观察肝星形细胞在不同组间的活化情况，测定各组的血浆内毒素水平，同时也测定了肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。结果透射电镜下3周末观察到了HSC的活化，且肝纤维化组和甘氨酸组间HSC的活化程度不同，有IETM发生，且肝纤维化组和甘氨酸组间的内毒素含量有差异。结论早期肝纤维化发生时肝星形细胞的活化可能与肠源性内毒素血症有关。     

过氧化物酶增殖物激活受体γ抑制大鼠肝星状细胞中转化生长因子-β1诱导的结缔组织生长因子表达

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)对大鼠肝星状细胞(HSC)中转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的结缔组织生长因子(CTGF)表达的抑制作用.方法 常规培养大鼠HSC,预先给予或不给予PPARγ特异性拮抗剂GW9662处理,再经系列浓度的PPARγ天然配体(15-d-PGJ2)或合成配体(GW7845)及TGF-β1序贯作用后,通过半定量RT-PCR及Western-blotting分析CTGF表达状况,透射电镜观察HSC形态学变化.结果 15-d-PGJ2和GW7845可显著抑制HSC中TGF-β1诱导的CTGF表达(同时在转录和转录后水平),且PPARγ配体对CTGF表达的抑制作用可被GW9662部分或完全逆转,说明此种抑制效应确由PPARγ所介导;电镜观察亦显示HSC由活化态向静息态的形态学转变.结论 PPARγ活化可显著抑制HSC中TGF-β1诱导的CTGF表达,提示PPARγ可作为逆转肝纤维化治疗的新的有效靶点.

Abstract：

Objective To investigate the effect of peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)activation on transforming growth factor betal(TGF-β1)-induced connective tissue growth factor(CTGF)expression in rat hepatic stellate cells(HSCs).Methods Cultured HSCs with or without PPARγ-specific antagonist GW9662 treatment prior to the addition of an increasing amount of PPARγ natural ligand(15-d-PGJ2)or synthetic ligand(GW7845)were stimulated with TGF-β1.The mRNA and protein levels of CTGF expression were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting,respectively.The morphological changes of the HSC were obgerved by electron microscope.Results 15-d-PGJ2 and GW7845 significantly inhibited TGF-β1-induced CTGF expression at both mRNA and protein levels in HSCs, and the inhibitory effect was dramatically,if not completely,abolished by pretreatment with GW9662,suggesting that the inhibition was mediated by PPARγ. Morphological observation revealed that PPARγactivation caused obvious changes of HSCs from activated to quiescent phenotypes.Conclusion PPARγ ligand shows potent inhibitory effect on TGF-β1-induced CTGF expression in rat HSCs,suggesting its potential as a candidate agent for treatment and prevention of hepatic fibrosis.     

实验性肝纤维化大鼠原代肝星状细胞中CTGF的表达及意义

目的：通过检测肝纤维化大鼠原代肝星状细胞（HSC）中结缔组织生长因子（CTGF）的表达,探讨HSC与CTGF间的相关生物学作用机制。方法：皮下注射四氯化碳（CCl4）制备大鼠肝纤维化模型,于注射CCl4后1、4、8周分批分离HSC后,采用免疫组化、RT-PCR方法检测原代HSC中CTGF的表达变化。结果：CCl4注射后第1、4、8周大鼠HSC平均得率分别为：（3.15&#177;0.38）&#215;107/只、（4.21&#177;0.76）&#215;107/只、（5.11&#177;0.73）&#215;107/只,均高于正常大鼠HSC平均得率[（2.31&#177;0.47）&#215;107/只]（P〈0.05）。细胞爬片免疫组化结果显示,活化的HSC胞质中可见CTGF阳性表达。RT-PCR检测结果显示,与正常对照组相比,注射CCl4后1、4、8周大鼠HSC中CTGF mRNA的表达显著增强（P〈0.05,P〈0.01）。结论：CTGF在肝纤维化发生、发展中对HSC的活化起促进作用。     

还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞TIMP—1表达的影响

目的 研究还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate,cells,HSC)中金属蛋白酶1组织抑制因子（TIMP－2）表达的影响。从分子和蛋白水平探讨还原型谷胱甘肽对大鼠肝纤维化的作用和可能机制。方法 采用50％CCl4制备大鼠肝纤维化模型，在造模过程中给予还原型谷胱甘肽进行干预。应用RT－PCR才Western Blot技术，在分子和蛋白水平检测体外分离大鼠HSC中的TIMP－1的表达情况。结果 还原型谷胱甘肽干预组与模型组和正常对照组相比，HSC中TIMP的表达降低（P＜0．05）。结论 还原型谷胱甘肽的干预可下调大鼠HSC中TIMP－1的表达，对实验性肝纤维化起到减轻作用。     

酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展

肝星状细胞（HSC）活化是各种病因所致肝纤维化过程中的关键环节。在酒精性肝病的发展过程中,乙醇和代谢产物乙醛可改变机体氧化还原状态,活化枯否细胞,释放大量细胞因子,诱导HSC活化、增殖和胶原合成,形成肝纤维化。本文将对酒精性肝纤维化中HSC活化的机制和相关靶点加以综述,为开发抗肝纤维化药物和临床治疗提供新的思路。     

大黄蛰虫丸对大鼠肝星状细胞活化增殖的影响

【目的】观察大黄蛰虫丸对经旁分泌和自分泌途径激活大鼠肝星状细胞活化增殖情况的影响。【方法】采用Nycodenz分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）。在制备正常鼠血清和DHZCW药物血清的基础上,将它们分别加入KC和HSC培养板内作用后制备成正常鼠KC条件培养液（NKCCM）、损伤鼠KC条件培养液（KCCM）以及正常鼠HSC条件培养液（HSCCM）。将上述条件培养液分别干预HSC24h、48h和72h,然后采用MTT法和3H—TdR掺入法分别检测比较各组HSC细胞活化增殖情况。【结果】损伤鼠不含药组和正常KC对照组比较,HSC活化增殖情况显著性增高（P〈0．01）,损伤鼠含药组HSC活化增殖则显著降低（P〈0．01,P〈0．05）,且其抑制效应随着含药血清浓度的升高逐渐增强;而正常鼠HSC不含药组和正常鼠HSC含药组各组间比较均无显著性差异（均P〉0．05）。【结论】DHZCW对经旁分泌途径激活大鼠HSC活化增殖有明显的抑制作用,且作用效应与血清药物浓度间存在剂量依赖关系,但对经自分泌途径激活大鼠HSC活化增殖未见明显抑制作用。