Oligofectamine介导转录因子SP1诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究

目的确定SP1诱骗性寡核苷酸(Decoy Oligodeoxynucleotides,ODNs)在Oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系SV-40-PED的最佳转染条件和效果。方法以SV-40-PED为转染对象,在6孔培养板中,接种SV-40-PED细胞2×105/孔,将4μlOligofectamine和不同浓度的SP1ODNs(2.5、5.0、7.5、10.0和12.5μl)分别溶于100μl无血清、无抗生素的DMEM培养基,室温放置20min后转染细胞,SP1ODNs最终浓度分别为50、100、150、200和250nmol/L、转染26h检测不同浓度转染情况,确定最佳SP1ODNs与Oligofectamine的比率、转染时间;流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度及摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,观察细胞损伤情况。结果SV-40-PED在Oligofectamine的介导下可以摄取SP1ODNs。SP1ODNs终浓度为50、100、150nmol/L组细胞形态无明显变化,终浓度为200、250nmol/L组细胞收缩、变圆后逐渐恢复;SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染26h时细胞形态也无明显变化,48、72h时有细胞漂浮现象。荧光下观察,转染成功各组荧光物质分布于细胞核内,其中SP1ODNs终浓度为200、250nmol/L组可见清晰核仁,浓度越高,荧光强度越强,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核。SP1ODNs终浓度为250nmol/L时,转染72h组LDH浓度为137.12±3.92U/L,显著高于26h的49.61±17.13U/L和48h的120.26±8.42U/L,均有统计学意义(P<0.01);当转染时间为26h时,各浓度组上清液LDH值差异无统计学意义(P>0.05)。结论SP1ODNs终浓度为250nmol/L、转染26h时可以为SV-40-PED转染提供良好效果。     

转染人补体调节基因对猪血管内皮细胞的保护作用

供者血管内皮细胞(EC)是猪到人异种移植时引发超急性排斥反应的靶抗原的主要分布部位。利用转基因技术让猪的内皮细胞表达人补体调节基因(hDAF)，可能会增强其血管内皮细胞的防御能力，借以克服超急性排斥反应的发生，联合转染一种以上人补体调节蛋白基因可能效果更好。为此，我们进行了如下实验。     

f血管内皮生长因子受体介导的双自杀基因重组腺病毒联合Survivin反义寡核苷酸对血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系联合Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对血管内皮细胞的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV304细胞株,同时用Survivin ASODN转染同一细胞株,应用逆转录-聚合链反应(RT-PCR)和Western blot检测CDg- lyTK和Survivin基因的表达,观察两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果Sur- vivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并对两者的转染及感染效率无明显影响,CDglyTK可在ECV304细胞株高效表达,Survivin ASODN可明显降低Survivin蛋白表达。单独导入IC50的Survivin ASODN基因,细胞存活率为(55．90±3．61)％,与AdKDR-CDglyTK基因联用后,在GCV 60 mg／L、5-FC 500 mg／L时,细胞存活率明显低于单用AdKDR-CDglyTK或Survivin ASODN(P< 0．05),但在GCV 100mg／L、5-FC 2 000mg／L时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR- CDglyTK,两者间差异无统计学意义(P>0．05)。联合基因较单一基因对ECV304细胞具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的CDglyTK融合基因体系和Survivin ASODN基因联合,较单一基因具有更强的特异性杀伤血管内皮细胞的作用。     

人血清对猪血管内皮细胞的细胞毒效应研究

目的 探讨异种(猪/人）超急性排斥的发生机制。方法 人血清为天然抗体和补体源。用四唑盐法行补体依赖的细胞毒反应，建立体外超急性排斥模型。结果 正常人血清能溶解猪血管内皮细胞；而Clg缺乏及B因子缺乏的人血清对猪血管内皮细胞的溶解率较低(P＜0．01)；同种猪血清及灭活补体的人血清不溶解猪血管内皮细胞；将经典或旁路途径有缺陷的人血清等体积混合，其细胞毒作用恢复正常。结论 治疗猪/人之同的超急性排斥应考虑补体旁路途径激活的问题。     

流动激活血管内皮细胞中转录因子核因子-кB和激活蛋白-1的表达

目的比较血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)在不同流场中转录因子核因子-кB(nuclear factor-кB,NF-кB)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的表达规律,为力学信号对基因调控模式的影响提供依据。方法将培养的人脐静脉ECs加载于层流和湍流的离体流室模型中,以作用时程的不同分为6个时间点(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h和5 h),运用共聚焦显微镜,从蛋白水平观察ECs中NF-кB和AP-1在不同流室中表达的时间规律和空间规律。结果层流中NF-кB的表达高峰出现在1 h段(26.49±1.63,P<0.05),随后转行向下;湍流中NF-кB表达在3 h段升至峰值(34.41±6.43,P<0.05);层流中c-Jun/AP-1表达一过性增高,0.5 h到达峰值(18.95±5.38,P<0.05),随即下降至基线水平;湍流中c-Jun/AP-1表达呈持续缓慢上升趋势(P<0.05)。结论湍流流场对血管ECs中NF-кB和AP-1表达的影响不同于层流,湍流对NF-кB和AP-1的持续激活上调作用可能引起了ECs形态结构和功能行为的病理学改变。     

转录抑制因子ZHX1的研究进展

锌指结构和同源框1(zinc-fingers and homeoboxes 1,ZHX1)属于ZHX蛋白家族,ZHX蛋白家族还包括ZHX2、ZHX3。ZHX1开放阅读框编码873个氨基酸,其中包含2个锌指结构(C2-H2 zinc-fingers)和5个同源结构域。ZHX1可与其家族成员ZHX2和ZHX3结合形成异源二聚体,或自身结合形成同源二聚体,定位于细胞核中发挥调控转录作用。     

HLA-G1抑制人自然杀伤细胞杀伤猪血管内皮细胞的研究

目的　研究HLA G1基因抑制人自然杀伤细胞 (NK细胞 )对猪血管内皮细胞杀伤的作用。方法　利用脂质体介导的基因转染技术将 pcDNA3 HLA G1转入原代培养的猪血管内皮细胞 ,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测HLA G1分子在猪内皮细胞上的表达 ;以NK细胞系(NK92 )和外周血单个核细胞为效应细胞 ,用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测转染细胞对NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果　与未转染HLA G1的对照组相比 ,NK92和外周血单个核细胞对转有HLA G1的猪血管内皮细胞的杀伤效率均有明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　HLA G1分子可以明显抑制人NK细胞对猪血管内皮细胞的杀伤。     

贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤血管内皮细胞生长因子和核转录因子Sp1表达的影响

目的 观察贝伐单抗对裸鼠胃癌移植瘤生长以及对肿瘤血管内皮细胞生长因子（VEGF）和核转录因子Sp1表达的影响.方法 建立SGC-7901胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型,成瘤后分别使用贝伐单抗（BVZ组）和磷酸盐缓冲液（PBS组）治疗4周.绘制肿瘤生长曲线,免疫组织化学染色技术（IHC）检测移植瘤Ki-67、CD34、VEGF及Sp1表达情况,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 相比PBS组,BVZ组肿瘤生长速度明显减缓（P〈0.05）,肿瘤细胞增殖能力下降,凋亡指数明显增加[（5.3±1.8）％比（16.7±6.7）％,P＜0.01],肿瘤组织内微血管密度下降（4.0±1.0比16.3±1.5,P＜0.001）.贝伐单抗能减少肿瘤内VEGF表达,但对核转录因子Sp1表达水平没有明显影响.结论 贝伐单抗可有效抑制裸鼠胃癌移植瘤生长,减少肿瘤内微血管密度和VEGF表达,但不引起Sp1表达的明显改变.     

人衰变加速因子基因在猪血管内皮细胞中的表达

目的 通过转基因方法使猪的血管内皮细胞表达人DAF蛋白，抑制猪供人移植超急性排斥反应。方法 体外培养猪腹主动脉内皮细胞，用透射电镜方法进行鉴定。脂质体转染法将含有人DAF基因的真核表达载体PSFFV－DAV转染进猪的血管内皮细胞，经G418筛选（浓度为100mg/L)12d，获得具有抗性的克隆，进而增殖，传代，保种。通过流式细胞仪检测转染细胞DAF的表达情况。结果 转染了基因的细胞与未转染基因的细胞在流式细胞仪检测中其莹光强度分别为82.18和1.69。转染的细胞5代后其荧光强度为71.96。结论 转染了人DAF基因的细胞荧光强度明显高于对照组。导入的外源基因在细胞内能高效、稳定地表达，为转基因猪的建立奠定一定的基础。     

内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因治疗胃癌的作用及其机制

目的探讨新型内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因(hENDOVEGI151)治疗胃癌的作用机制.方法应用重复感染系数(MOI=100)的重组腺病毒Ad hENDOVEGI151转染胃癌SGC-7901、MKN-28细胞和血管内皮ECV-304细胞4 h后,继续培养6 d,噻唑蓝(MTT)比色法检测第1至6天3种细胞的存活率;流式细胞仪(FCM)丙化碘锭(PI)单染色法检测转染后48 h胃癌和内皮细胞凋亡的情况;应用DNA片断化试验分析转染后12、24、36、48 h时ECV-304凋亡情况;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测融合基因转染对SGC-7901表达促血管生成因子VEGF165的影响.结果AdhENDO-VEGI151治疗强烈抑制ECV-304增殖,72 h抑制率为55.18%,144 h抑制率89.86%;FCM检测出现明显凋亡峰,凋亡细胞约占(20.70±5.83)%,并且出现G1期阻滞(65.41±2.38)%和S期明显减少(21.81±1.52)%,与Ad LacZ组和对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);转染组细胞DNA出现典型的梯形条带,尤以转染后24～36 h最为明显,Ad LacZ组及对照组DNA无裂解.Ad hENDO-VEGI151转染对胃癌细胞无直接毒性作用,但明显下调胃癌细胞VEGF165的表达水平.结论Ad hENDO-VEGI151治疗一方面强烈抑制内皮细胞增殖,诱导凋亡;另一方面抑制胃癌细胞表达VEGF165,多角度联合抑制肿瘤新生血管形成,使肿瘤细胞因缺血而发生大量凋亡.     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制肝癌的血管形成

目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ODN）是否可以抑制人肝癌细胞系VEGF的蛋白表达,进而抑制肝癌的血管形成,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系7721能表达VEGF,其培养上清液对牛主动脉内皮细胞（BAEC）的生长有促进作用。采用人工合成反义、正义ODN分别加入7721细胞培养液,比较7721细胞VEGF的表达以及各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况,即可了解ODN通过抑制VEGF的表达抑制肝癌的血管形成情况。结果 VEGF反义ODN明显抑制了人肝癌细胞VEGF的表达（灰度值：反义组122．6,正义组101．3,对照组106．3,P＜0．01）,且抑制率与剂量呈性关系（当剂量为1、2、5、10μmol/L时抑制率分别为：63．2％、82．4％、210．0％、287．5％）。结论 VEGF反义ODN能够抑制肝癌的血管形成,其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗手段。     

补体在猪到猴异种心脏移植中的作用及机理

目的 探讨补体在异种大动物猪到猴心脏移植排斥反应中的作用及机理.方法 以梅山猪为供者,中国猕猴为受者,行异种腹腔异位心脏移植.随机将受者分为3组.A组(5只):为空白对照组,受者心脏移植后不作任何处理.B组(5只):为照射预处理组,受者于心脏移植前28 d、即1.5个月龄时接受60Coγ3 Gy全身剂量照射,其余同A组.C组(8只):为照射+胸腺注射预处理组,心脏移植前21 d,将供者的脾细胞(按照5×107个/只的数量)注入受者的两侧胸腺内,其余同B组.观察心脏移植术后各组移植心的存活时间;猪对猴单向混合淋巴细胞培养的刺激效应;采用双抗体夹心法检测补体C3和CD46的血清浓度;通过流式细胞术检测受者外周血细胞表面IgM、IgG阳性细胞百分比水平.结果 A、B、C三组移植心的存活时间分别为:(36.6±5.8)h、(65.6±6.5)h和(91.1±22.8)h,C组移植心的存活时间明显延长,与A组比较,P＜0.01,与B组比较,P＜0.05.C组在猪对猴单向混合淋巴细胞反应中的刺激效应较A、B组明显下降(P＜0.01).B、C组移植前补体水平(C3)无明显变化,但随着IgM、IgG水平的上升,发生排斥反应时C3和CD46水平显著降低.C组猕猴特异性抗猪抗体IgM及IgG的上升速度均较A、B组明显延缓.结论 对受者进行异种胸腺注射联合全身照射预处理在抑制T淋巴细胞免疫及体液免疫方面有重要作用,但无法抑制异种排斥反应中补体的激活,补体通过经典途径参与了延迟性异种排斥反应的发生.     

类风湿关节炎中巨噬细胞移动抑制因子对内皮细胞功能及血管内皮生长因子的影响

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对类风湿关节炎（RA）滑膜内皮血管生成的影响和作用机制。方法免疫组化检查MIF在RA滑膜组织中的表达;加入MIF或PBS溶液培养人微血管内皮细胞株（HMEC-1）,CCK8法观察细胞的生长差异,磷脂酰丝氨酸凋亡试剂盒（AnnexinV法）检测细胞凋亡,RT—QPCR检测细胞中MIF及VEGF的表达差异。结果MIF在5例RA组织中均阳性表达;加入MIF的细胞株增殖显著较加PBS溶液的快（F=216．93,P〈0．01）,细胞株的凋亡被MIF显著抑制（凋亡率从21．37％降为7．01％（t=13．88,P〈0．01）;处于分裂相的细胞数目较加入PBS的细胞株多（G2期＋S期细胞比例从37．89％升为54．05％,t=5．42,P〈0．01）,在加入MIF的细胞株中VEGF的表达4．62倍高于加入PBS的细胞株（t=7．34,P〈0．01）。结论MIF在RA滑膜组织中表达,并通过提高血管内皮细胞的VEGF而促进RA滑膜血管生成而发挥重要的生理作用。MIF或许是治疗RA进展的药物靶点,有望通过抑制RA患者中MIF的表达从而延缓疾病的进展,改善患者的生活质量。     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸在人膀胱癌EJ细胞中的转染率及稳定性

目的探讨端粒酶反义寡核苷酸（asODN）在脂质体介导下在入膀胱癌EJ细胞中的转染率、分布特点及稳定性。方法合成针对端粒酶RNA模板区的asODN，并行全硫代修饰或不修饰，5-FITC标记，脂质体介导转染人膀胱癌EJ细胞后分别于15、30min、1h以及以后每小时，在电镜下观察asODN在细胞中的表达，分布特点及稳定性。结果在脂质体介导下，未修饰型asODN转染细胞后15min开始表达，1～3h稳定表达于细胞中，表达率15％～20％，4h减退；修饰型asODN 15min开始表达，8h有56％～80％的高表达，12h开始消散。结论脂质体是一种有前途的膀胱癌非病毒基因治疗载体。     

新型血管生成抑制人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151治疗胃癌的实验研究

目的研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO-VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用.方法构建携带hENDO-VEGI151融合基因的重组腺病毒载体,脂质体介导法包装重组腺病毒Ad IL-3/hENDO-VEGI151.体外检测融合基因的表达及融合蛋白的生物学活性.应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型及荷人胃癌裸鼠模型,进一步观察融合蛋白对活体血管生成的影响和融合基因治疗活体胃癌的疗效.结果用TCID50法测定携带融合基因的重组腺病毒滴度为4.2×1011TCID50/ml;用聚合酶链反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR和免疫组织化学方法证实融合基因可被转导入SGC-7901细胞内并稳定高效地转录和表达;Western blot显示融合蛋白可被分泌到胞外发挥作用;融合蛋白可强烈抑制ECV-304细胞生长及鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成.Ad IL-3/hENDO-VEGI151治疗可强烈抑制裸鼠体内种植瘤生长,明显下调肿瘤微血管密度,促进胃癌细胞凋亡.结论 hENDO-VEGI151是一条新型强效的肿瘤血管生成抑制基因,其表达产物可能通过作用于肿瘤新生血管形成的不同环节强烈抑制新血管生成和肿瘤生长,值得进一步研究.     

核转录因子-圈套抑制血管内皮细胞炎性反应的实验研究

炎症介质过度释放贯穿全身炎症反应综合征(SIRS)、多脏器功能障碍综合征(MODS)始终，是病情恶化的首要原因。核转录因子KB(NF—KB)在炎症介质的调节中起主要作用。临床上多种手段可以抑制NF-kB的活性。但特异性差，副作用多。NF—kB能特异性识别并结合目的基因上的kB序列，利用这个特性，合成一包含kB序列的双链寡聚脱氧核苷酸(dsODNs)并转人靶细胞核，竞争性结合核内激活的NF—kB，     

细胞间粘附分子-1的反义寡核苷酸在异种心脏移植中的作用

目的探讨细胞间粘附分子1的反义寡核苷酸(ICAM1ASO)在小鼠→大鼠的异种心脏移植中对ICAM1表达以及排斥反应的作用。方法BALB/c小鼠和Lewis大鼠分别作为供者和受者,随机配对建立小鼠→大鼠的异种心脏移植模型。按照供者术前处理不同分为双蒸馏水对照组、寡核苷酸对照组和ICAM1ASO组。各组供者术前6h分别从右颈外静脉注射双蒸馏水、寡核苷酸和ICAM1ASO。术后48h各组取5只受者切取供心进行病理学检查;采用免疫组织化学方法对供心组织ICAM1的表达进行观察;半定量逆转录聚合酶链(RTPCR)法对ICAM1mRNA的表达进行定量分析。每组中余下5只受者继续观察直至供心停跳,记录供心存活时间。结果双蒸馏水对照组和寡核苷酸对照组在移植后48h可观察到供心心跳减慢,出现不同程度的心律不齐、心律紊乱,供心搏动无力;供心病理学检查显示心脏组织中广泛间质充血、水肿、出血及血栓形成,部分心肌髓样变性及溶解并伴有炎性细胞浸润;与移植前BALB/c小鼠心脏对比,内皮细胞和心肌细胞ICAM1表达明显增强;ICAM1mRNA表达也明显增加;供心存活时间分别为(53.6±3.58)h和(55.0±3.16)h。ICAM1ASO组供心ICAM1在蛋白水平和mRNA水平的表达均减弱;排斥反应程度也明显减轻;供心存活时间为(66.4±2.61)h;与寡核苷酸对照组和双蒸馏水对照组比较,差异有统计学意义。结论ICAM1ASO能明显抑制异种移植中供心ICAM1的表达,抑制异种移植后排斥反应的发生和发展,延长移植物的存活时间,其作用具有高度序列特异性。     

Bcl-2转录抑制因子1在肝癌组织中的表达及意义

背景与目的:已有研究显示,Bcl-2转录抑制因子1(Bit1)在多种肿瘤中异常表达并在肿瘤进展中发挥重要作用,Bit1在肝细胞癌(HCC)中的表达水平及临床意义值得探讨。本研究通过检测Bit1在HCC组织中的表达,分析其与HCC患者临床病理特征及预后的关系,从而探讨Bit1在HCC中的临床意义。方法:采用q RT-PCR、Westernblot检测34例HCC患者手术切除癌组织及对应癌旁组织Bit1m RNA及蛋白表达情况,用免疫组化法检测组织芯片中90例HCC患者癌组织与对应癌旁组织Bit1蛋白表达情况并分析其表达与HCC患者临床病理参数及预后的关系。结果:q RT-PCR与Westernblot检测结果显示,与癌旁组织比较,Bit1在HCC组织中的m RNA及蛋白表达水平均明显上调(P0.05)。免疫组化结果显示,Bit1蛋白定位于细胞质,其在癌组织中的高表达率明显高于癌旁组织(P0.05),且Bit1在HCC组织中的表达与HCC患者肿瘤的复发及病理分级明显有关(均P0.05),Kaplan-Meier分析显示,Bit1蛋白高表达患者总生存率和无病生存率低于Bit1蛋白低表达患者,但差异均未达统计学意义(P=0.547、0.414)。结论:Bit1在HCC组织中高表达,且Bit1表达与肿瘤的复发及病理分级密切相关,提示Bit1可能是影响肿瘤进展的重要分子,其有望成为HCC患者个体化治疗靶点。