DNA拓扑异构酶在卵巢癌细胞拓扑替康耐药中的作用

目的 探讨DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)在卵巢癌拓扑替康(TPT)耐药细胞A2780/TPT中的作用.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测该细胞株对TPT、米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、顺铂(cDDP)的耐药指数.Western blot法检测Topo Ⅰ及TopoⅡ的蛋白含量,超螺旋DNA松解法检测Topo Ⅰ的酶活性.结果 A2780/TPT细胞对Topo Ⅰ抑制剂TPT及CPT的耐药指数分别为25.1及3.1,对MX的耐药指数为19.0,对cDDP及Topo Ⅱ抑制剂ADM、VP-16仍保持敏感.耐药株的Topo Ⅰ含量约为亲本细胞的40%,且Topo Ⅰ活性下降(P<0.05),而TopoⅡ含量约为亲本细胞的2.2倍(P<0.05).结论 Topo Ⅰ含量的下降及TopoⅡ含量的增加是卵巢癌TPT耐药细胞对Topo Ⅰ抑制剂及Topo Ⅱ抑制剂产生不同药敏情况的原因.     

拓扑替康对人卵巢癌顺铂耐药细胞株作用的研究

目的:探讨拓扑替康(TPT)在体外诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡的作用及其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法:应用TPT诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡,运用MTT法、透射电镜、DNA凝胶电泳检测和观察TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/杀伤效应、凋亡形态、生物特性。采用Westernblot印迹杂交法以检测TPT对凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响。结果:TPT可诱导细胞株A2780/DDP凋亡,经TPT作用后A2780/DDP细胞内bax蛋白增加,而bcl-2蛋白不表达,bax/bcl-2比值增加。结论:TPT可诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP凋亡,其机制可能与bax蛋白高表达及bax/bcl-2不表达有关。     

拓扑替康对人卵巢癌细胞株端粒酶活性表达的影响

目的 :探讨拓扑替康对卵巢癌细胞端粒酶活性表达的影响。方法 :用TRAP ELISA法检测浓度为 2 60 0 0 μg·L-1 的盐酸拓扑替康 (和美新 )作用于卵巢癌HO 8910细胞株不同时间后端粒酶活性的改变 ,并以流式细胞检测法同步检测细胞凋亡及细胞周期改变。结果 :随着拓扑替康作用时间的延长 ,HO -8910细胞株的凋亡率逐渐增加 ,而端粒酶活性逐渐降低。当作用达 60h后 ,细胞凋亡达 47.62 %时端粒酶活性呈阴性。结论 :端粒酶活性抑制不是拓扑替康诱导卵巢癌细胞凋亡的直接原因 ,但临床监测端粒酶活性表达有助于对盐酸拓扑替康抗卵巢癌的疗效进行客观评价。     

拓扑替康对COC1/DDP凋亡诱导作用及分子机制的初步探讨

目的探讨拓扑替康（TPT）对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的杀伤和诱导凋亡活性及其作用机制。方法MTT法与软琼脂克隆形成测定TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的杀伤效应;流式细胞仪研究TPT对靶细胞的早期凋亡诱导作用;透射电镜观察细胞的凋亡形态;采用Western Blot印迹杂交法以检测TPT对凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响。结果TPT对COC1/DDP细胞有明显细胞毒性作用,有明显的剂量依赖性;COC1/DDP细胞在TPT作用后出现特征性凋亡形态特征,且对早期凋亡的诱导作用呈剂量依赖性（P〈0.05）。经TPT作用后,COC1/DDP细胞内bax蛋白增加,而bcl-2蛋白不表达,bax/bcl-2比值增加。结论TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能与bax蛋白高表达及bcl-2蛋白不表达有关。     

拓扑替康对SKOV3细胞Survivin表达的调控

目的 :观察不同浓度拓扑替康 (TPT)对人卵巢癌细胞系SKOV3中Survivin表达的影响。方法 :采用免疫组化和RT PCR方法 ,检测体外不同浓度TPT(0 .2 4 4 μg/L ,3.90 6 μg/L ,6 2 .5 μg/L ,1mg/L ,1 6mg/L ,1 2 8mg/L)作用于SKOV348h后SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 :随TPT浓度的增加 ,SKOV3细胞中SurvivinmRNA及蛋白的表达明显减少 ,呈正性剂量效应关系 (P <0 .0 5 )。结论 :TPT能够抑制卵巢癌细胞SKOV3中SurvivinmRNA和蛋白的表达。     

Survivin反义核酸对拓扑替康诱导SKOV3细胞凋亡的影响

目的 :探讨Survivin反义核酸对拓扑替康 (TPT)诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡的影响。方法 :在光镜下观察Survivin反义核酸与TPT联合应用后SKOV3凋亡的形态学改变 ,通过DNA电泳检测SKOV3细胞凋亡的情况 ;应用MTT法检测SKOV3细胞对TPT的敏感性。结果 :Survivin反义核酸可明显促进TPT诱导的SKOV3凋亡 ,呈现出特征性的DNA梯状带 ;TPT对SKOV3、SKOV3/neo、SKOV3/SVVas细胞的IC50 值分别为 (1 6 0 .0 0± 6 .36 ) μg/L、(1 5 8.0 0±6 .32 ) μg/L、(4 2 .0 0± 2 .31 ) μg/L ,其差异具有统计学意义 (P <0 .0 1 )。 结论 :Survivin反义核酸可明显促进TPT诱导的卵巢癌细胞SKOV3凋亡 ,提高卵巢癌细胞对TPT的敏感性     

拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响

目的:研究bcl鄄2及fas在体外培养的卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP的表达及化疗药物拓扑替康(topotecan熏TPT)与顺铂穴cisplatinum熏cDDP雪对两种基因表达的影响。方法:用人卵巢上皮癌细胞系3AO及其cDDP耐药细胞系3AO/cDDP进行体外培养实验,用流式细胞仪(flowcytometry熏FCM)检测两种细胞系在化疗药物顺铂(cDDP)与拓扑替康治疗前后的fas和bcl鄄2表达。结果:与3AO相比,fas与bcl鄄2在3AO/cDDP中的表达明显降低(P<0.01);cDDP和TPT可使fas在3AO中的表达明显升高(P<0.01),bcl鄄2明显降低(P<0.01);cDDP和TPT对fas表达影响较为显著(P<0.01)熏对bcl鄄2无显著影响(P>0.05)。结论:fas可能在卵巢癌的化疗耐药中起作用,但bcl鄄2的作用尚不明确;cDDP及TPT可能通过fas介导的细胞凋亡机制促进细胞死亡。     

姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用

目的:探讨姜黄素(curcumin熏Cur)及其联合化疗对人卵巢癌细胞株3AO细胞体外生长的抑制作用。方法:将Cur单独应用或与临床上常用的卵巢上皮癌化疗药物顺铂(cDDP)、卡铂(CBP)、拓扑替康(TPT)联合应用,观察对3AO细胞生长抑制率的影响,药物敏感实验采用MTT法。结果:Cur抑制3AO细胞的生长,其半数抑制浓度(IC50)为23.4μmol/L;Cur与各种浓度的cDDP、CBP或TPT联用,可提高各种药物对3AO细胞的生长抑制率(P<0.05～0.01)。结论:Cur在体外对人卵巢癌3AO细胞具有抑制作用,与cDDP、CBP或TPT联合应用,可提高3种药物的化疗效果。     

拓扑替康治疗多发性骨髓瘤的实验研究

目的研究抗肿瘤植物药拓扑替康（TPT）对多发性骨髓瘤（MM）细胞株的作用,为其临床治疗MM提供实验依据。方法应用MTT等方法,检测TPT对多发性骨髓瘤细胞株增殖、凋亡及周期的影响。结果不同剂量TPT作用RPMI8226细胞48h,其半数抑制浓度为57ng／mL。不同浓度梯度TPT作用于RPMI8226细胞48h,其早期凋亡细胞百分数均分别高于空白对照组。TPT可使RPMI8226细胞阻滞于S期,减少或停止向G2／M期转化,表现为典型的细胞S期捕获。结论（1）TPT可直接抑制MM细胞株的生长,并促进其凋亡,且呈时间和浓度依赖性。（2）TPT可阻滞大部MM细胞株于S期。     

拓扑替康对HL-60细胞凋亡的影响

目的:探讨拓扑替康(TPT)对人髓系白血病细胞株HL-60细胞凋亡的影响.方法:取倍增期的HL-60细胞分组培养,实验组培养液中加入0.15 μmol/L的TPT,空白对照组继续常规培养.分组培养4 h、12 h后分别采用流式细胞仪Annexin V-FITC染色及TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果:分组培养4 h后,实验组细胞凋亡率为(28.57±3.16)%,高于空白对照组的(3.12±0.38)%,差异具有统计学意义(t=13.85,P=0.000 2).分组培养12 h后,实验组TUNEL阳性细胞数达38.33%,高于空白对照组的2.67%(χ2=117.08,P<0.05).结论:拓扑替康具有诱导HL-60细胞凋亡的作用.     

氯喹与拓扑替康联用协同抑制A549肺癌细胞株的增殖

目的观察氯喹(CQ)与拓扑替康(TPT)联用对A549肺癌细胞株的影响,为增敏化疗及氯喹在抗肿瘤方面的研究、开发和临床应用提供理论支持和实验依据。方法 MTT法检测细胞抑制率,取对数生长期的肺癌细胞A549种于96孔板内6,×103个/孔2,00μL/孔。实验分为对照组(注射用水)和实验组,实验组加入0.05～25.6μg/mL的TPT,分别培养48 h和72 h;实验组加入不同浓度的单药或以固定比例(TPT∶CQ=1∶10)联合药物,TPT/CQ为0.39/3.90、.78/7.8、1.56/15.6、3.13/31.3和6.25/62.5μg/mL;37℃放置4 h后,弃上清液,加入100μLDMSO,摇床上摇匀使紫色结晶充分溶解。用酶标仪测定波长为570 nm处的吸光度(OD)值,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。每组实验重复3次。结果应用浓度为0～25μg/mL TPT处理A549细胞48 h和72 h,通过MTT检测可发现TPT对A549细胞的生长抑制呈现时间及浓度依赖性,在72 hI,C50值为(1.769±0.288)μg/mL,CQ(0.39～6.25μg/mL)与TPT(3.9～62.5μg/mL)联用对A549细胞的增殖抑制作用,通过软件分析在上述浓度范围内,两药的联合指数(CI)均<1。结论 CQ能增强TPT对A549细胞的增殖抑制作用。     

酪氨酸激酶3对赫赛汀耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/H增殖和成瘤能力的影响

探索erb-b2受体酪氨酸激酶3（HER-3）对卵巢癌耐药细胞株SKOV3/H的体外增殖和体内成瘤能力的影响。方法采用赫赛汀浓度递增法构建SKOV3 耐药细胞株（赫赛汀起始浓度为5 mg/L,经5～8 次浓度递增,每次提高50%）。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HER-3在15 对非耐药卵巢癌组织和耐药卵巢癌组织中的表达（SKOV3 和SKOV3/H 细胞中的表达）。MTT 实验验证分别转染sh-HER-3 及其对照质粒vector对SKOV3/H细胞增殖能力的影响。将包含sh-HER-3的重组慢病毒质粒及其阴性对照慢病毒空载体质粒vector（均带egfp荧光标签）分别以病毒/细胞数量=15 的比例感染SKOV3/H 细胞,加入2.0μg/ml 的嘌呤霉素筛选,构建稳定转染sh-HER-3 或vector 的SKOV3/H 细胞,将2 株细胞分别注射到裸鼠皮下,复制卵巢癌裸鼠移植瘤模型,观察体内成瘤情况。结果成功构建卵巢癌SKOV3耐赫赛汀细胞株SKOV3/H,且SKOV3/H的群体倍增时间为SKOV3 细胞的1.4～1.9倍。HER-3在耐药卵巢癌组织中的表达水平高于非耐药癌组织（p <0.05）,且HER-3 在耐药细胞株SKOV3/H中的表达水平也高于非耐药卵巢癌细胞株SKOV3（p <0.05）。转染sh-HER-3后,SKOV3/H细胞的增殖能力低于阴性对照组（p <0.05）。转染sh-HER-3后,耐药细胞株SKOV3/H的裸鼠体内成瘤能力降低（p <0.05）。结论HER-3参与卵巢癌的赫赛汀耐药,并正向影响耐药细胞株SKOV3/H的增殖和体内成瘤能力。     

拓扑替康、顺铂和泰素对宫颈癌HeLa细胞的抑制及放射增敏作用

目的研究拓扑替康（TPT）对宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用和放射增敏作用,并与顺铂（DDP）和泰素（TAX）进行对比分析。方法采用MTT法检测TPT、DDP和TAX对宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响,细胞克隆形成法研究三种化疗药物的放射增敏作用,并应用单击多靶模型计算放射增敏比。结果TPT、DDP和TAX作用HeLa细胞24、48和72h半数抑制浓度分别为8．0、2．6和0．8μg／mL,2．4、0．7和0．1μg／mL,0．3、0．1和0．0μg／mL。三种化疗药物的放射增敏组肿瘤细胞凋亡率均明显高于单放射组和单独化疗组（P〈0．05）;放射增敏实验中,TPT作用24h和48h后放射增敏比分别为1．167和1．344,DDP为1．314和1．538。TAX为1．076和1．316。结论TPT、DDP和TAX对宫颈癌HeLa细胞具有明显抑制作用,且呈时间和浓度依赖性。三种化疗药物具有放射增敏作用,DDP的放射增敏作用最强,TAX最弱。     

微乳丹参酮逆转肿瘤多药耐药的作用

目的：观察中药新剂型微乳丹参酮对人白血病敏感细胞株（sensitive K562 cell line, KS）及其阿霉素(ADM)耐药株（ADM resistant K562 cell line,KA）的多药耐药性逆转效果,并探讨其可能机制。方法：用中药制剂微乳丹参酮作为逆转剂, 丹参酮和空白微乳体系作为对照,作用于耐药株,采用MTT法、流式细胞术、荧光强度法检测逆转前后相关指标变化。结果：微乳丹参酮、空白微乳体系及丹参酮均可显著降低KA的耐药性,微乳丹参酮的作用最强,逆转倍数显著高于空白微乳体系和丹参酮两组（P<0.05）。微乳丹参酮、空白微乳体系及丹参酮均可降低KA的P-gp和Bcl-2表达水平,使肿瘤细胞凋亡比率上升,微乳丹参酮的作用最强,使肿瘤细胞在ADM作用下的凋亡比率增加（P<0.05）。三者均可使细胞内ADM药 物浓度升高,微乳丹参酮作用后的KA细胞中ADM的浓度最高,与空白微乳体系和丹参酮组比较,差异有显著性（P<0.05）。结论： P-gp药物外排和Bcl-2高表达引起的凋亡抑制是多药耐药的发生机制之一。微乳丹参酮有很强的多药耐药逆转作用,可显著增加KA细胞内ADM药物浓度。     

酸性成纤维细胞生长因子在卵巢癌中的表达及其信号传导途径

目的　探讨酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)在卵巢癌发生发展中的作用及其信号传导机制。方法　应用逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和Western印迹方法对 40例上皮性卵巢癌组织aFGF及其受体FGFR1的表达进行了分析 ;并以不同浓度的aFGF和酪氨酸蛋白激酶 (TPK)抑制剂 genistein诱导卵巢癌细胞株CAOV3细胞 ,利用 [γ 32 P]ATP掺入外源性底物的方法 ,液体闪烁测定蛋白激酶C(PKC)及细胞外信号调节激酶 (ERK)的活性。结果　aFGFmRNA和FGFR1mRNA在上皮性卵巢癌组织中的半定量检测结果分别为 0 981± 0 1 30和 1 0 4 7± 0 1 4 8,与正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤相比 ,差异有显著意义 (P <0 0 5) ,且在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期 (P <0 0 5) ;Western印迹检测见上皮性卵巢癌组织中aFGF和FGFR1条带均深于正常卵巢组织 ;随着aFGF浓度的增加 ,CAOV3细胞PKC及ERK活性随之升高 ,与aFGF浓度呈剂量依赖效应 ;Genistein抑制细胞内PKC及ERK活性 ,与 genistein浓度亦呈剂量依赖效应。 结论　aFGF与上皮性卵巢癌的发生、发展、浸润呈正相关 ,其受体具有TPK活性 ,TPK激活后可进一步激活PKC和ERK ,进一步证明PKC及ERK确是TPK的下游信号分子     

汉防己甲素对肝癌耐药细胞抑制作用机制研究

目的:应用汉防己甲素(tetrandrine,TET)作用于肝癌耐药细胞系,探讨TET及其联合抗癌药物抑制肝癌耐药细胞系增殖的可能机制。方法:肝癌耐药细胞株BEL-7402/DOX经TET或联合多柔比星(doxorubicin,DOX)处理后,MTT法检测肝癌耐药细胞抑制率,荧光分光光度计测定的D值计算细胞内DOX的浓度,Fura-2/AM方法测细胞内Ca2+的浓度。结果:TET对BEL-7402/DOX细胞的增殖有一定的抑制作用,并可增加DOX对BEL-7402/DOX细胞的抑制作用,且呈剂量相关性。不同浓度的TET与DOX合用均可显著增加BEL-7402/DOX细胞内的DOX浓度(P<0.05～0.01)。浓度为5.0 mg/L、10.0 mg/L的TET均可显著降低BEL-7402/DOX细胞内的Ca2+浓度(P<0.05,P<0.01)。结论:TET及其联合抗癌药抑制肝癌耐药细胞系增殖的机制,可能与其降低细胞内Ca2+浓度,阻抑信息传递,提高细胞内DOX浓度有关。     

人卵巢上皮癌的体外培养及耐药株的诱导

目的研究人卵巢上皮癌体外培养的方法及其耐药株的诱导方法。方法取卵巢上皮癌患者的卵巢癌实体瘤、囊内液及腹水,分别用直接培养法,胰酶消化培养法和胶原酶消化培养法体外培养。检测细胞对顺铂和环磷酰胺的药物敏感性,选择适当的药物和浓度诱导卵巢上皮癌耐药株。并比较耐药株与诱导前的母株间克隆形成率和耐药蛋白表达的差异。结果腹水和囊内液直接培养较实体瘤培养易成功。实体瘤培养以胶原酶消化培养法获得细胞数最多,混杂细胞最少。取腹水来源的稳定传至30代的卵巢癌细胞用环磷酰胺诱导耐药株成功。检测其克隆形成率和耐药蛋白表达均高于诱导前。结论本实验探讨了人卵巢上皮癌体外培养的多种方法,成功培养一株卵巢黏液性囊腺癌细胞,达建系要求,并成功诱导其耐药株。可用于卵巢上皮癌发生及复发机制和治疗及预防方面的研究。     

下调PAK5抑制紫杉醇诱导卵巢癌细胞自噬现象的研究

目的 初步探讨下调PAK5的表达对化疗药物紫杉醇诱导CAOV-3卵巢癌细胞发生自噬和凋亡的影响.方法 通过RT-qPCR检测PAK5在卵巢癌细胞中的mRNA表达情况.在CAOV-3卵巢癌细胞中通过下调PAK5表达后,CCK8实验检测紫杉醇对肿瘤细胞毒性改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变,以及免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3B的表达变化.结果 PAK5在不同卵巢癌细胞中高表达;在CAOV-3卵巢癌细胞中,与阴性对照siRNA组比较,PAK5 siRNA组中无论是PAK5的mRNA水平还是蛋白表达水平均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);随着紫杉醇浓度的逐渐递增,紫杉醇对CAOV-3卵巢癌细胞毒性逐渐增加,而下调PAK5表达后,紫杉醇对卵巢癌细胞毒性增加更为明显,差异具有统计学意义(P<0.05);在紫杉醇处理的CAOV-3卵巢癌细胞中,下调PAK5的表达后可明显增加细胞的凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05);在紫杉醇处理的CAOV-3卵巢癌细胞中,下调PAK5的表达后可减少自噬相关蛋白LC3B蛋白的表达.结论 PAK5过表达于不同的卵巢癌细胞中,下调PAK5基因可以促使自噬相关蛋白LC3B表达减弱,可能是通过抑制CAOV-3卵巢癌细胞发生自噬,促进细胞凋亡,从而提高了CAOV-3卵巢癌细胞对紫杉醇化疗的敏感性,减少紫杉醇获得性耐药的发生.