北京市西城区2005-2007年志贺菌毒力相关基因的检测与分析

目的对西城区2005-2007年来收集的志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况,同时建立多重PCR方法检测志贺菌。方法利用志贺菌中四个主要毒力相关基因ipaH、ial、set1A、set1B的引物分别对所收集的志贺菌进行PCR方法检测与分析,并且建立了毒力相关基因多重PCR方法的反应条件。结果ipaH基因存在于所有志贺菌中,set1A、set1B基因仅存在福氏志贺菌中,ial基因在反复复苏的菌株中检出率有所下降,尤其以宋内缺失率高(49%);多重PCR方法检测志贺菌方便快捷,而且可以初步分型。结论志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同;多重PCR具有志贺菌的快速诊断价值。     

福氏志贺菌PFGE和MLVA分子分型方法的应用与评价

目的 比较和评价脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)和多位点可变数目串联重复序列分析技术(MLVA)在福建地区福氏志贺菌研究中的应用。方法 运用PFGE和MLVA技术对43株分离自福建地区的福氏志贺菌进行分子分型,结合流行病学资料分析比较分型效果。结果 43株福氏志贺菌经PFGE分型后相似度在61.70%~100%之间,按照100%的相似水平可分为36个PFGE型,没有优势PFGE型别,分辨系数为0.992 2,存在4个优势簇(G1~G4);福氏志贺菌经MLVA分型后,按照100%的相似水平可分为41个MLVA型别,遗传关联度介于6.207％～100％之间,没有优势MLVA型别,分辨系数为0.997 8,得到5个优势基因群(Cluster1~5)。在最小生成树上,部分F4c与Fx亲缘关系较近,并都由F2a和F1a分支而来,表现出一定的遗传关系。结论 两种分型方法的分辨率基本一致,PFGE分型结果与流行病学背景资料及血清型别基本吻合,MLVA在分析菌株种群进化关系上更具优势。     

福建省2005-2010年志贺菌分离株的毒力基因分析

目的 通过检测福建省志贺菌的毒力基因,了解我省不同志贺菌菌群及血清型的毒力基因分布情况以及流行模式,评估不同菌型的危害性,为菌痢防控工作提供科学的实验依据。方法 运用PCR扩增技术,对2005-2010年福建省腹泻病人中分离的104株志贺菌进行ipaH、set1（set1A和set1B）、sen、ial 四种毒力基因的检测,分析各毒力基因的阳检率以及毒力基因的分布模式。结果 ipaH、set1（set1A和set1B）、sen 、ial毒力基因的阳检率分别为100%、36.54%、 66.35%、64.42%,其中set1基因在B群（福氏志贺菌）和D群（宋内志贺菌）的阳检率分别为85%和6.25%;104株志贺分为8种毒力基因分布模式命名为I-VIII, IV型是B群志贺菌的优势基因携带模式（67.5%）,VI型是D群志贺菌优势基因携带模式（39.06%）,同时D群中I型、VII型和V型基因模式分布也较高。结论 ipaH可作为志贺菌属的鉴定基因,set1毒力基因主要存在于福氏志贺菌（B群）中;B群志贺菌有一个集中优势的基因流行模式IV型,D群有较多的相对优势基因流行模式;说明在志贺菌进化过程中存在复杂分化形式,同时毒力基因的插入和缺失在菌型的变异和分化中有一定的相关性。     

福氏志贺菌临床分离株毒力基因的研究

目的研究在一种快速、特异的mPCR方法在检出福氏志贺菌的同时对其毒力进行监测。方法选取福氏志贺菌三种毒力基因ipaH,ial,set1B作为扩增目标,在同一mPCR体系中对86株福氏志贺菌临床分离株进行了检测,并选取12株进行了噬斑形成试验,观察了扩增产物不同的福氏志贺菌对Hela细胞的毒力作用。结果86株福氏志贺菌临床分离株均检测到ipaH基因,阳性率为100%;45株检测到ial基因,阳性率为52%;69株检测到set1B基因,阳性率为80%。噬斑形成试验证明,mPCR结果不同的菌株对Hela细胞的感染能力存在明显差异。结论应用上述mPCR体系在检出福氏志贺菌的同时能够对菌株的毒力进行初步判别,对于临床诊断及治疗具有重要意义。     

福氏志贺菌痢疾80例分析

对2004年巴塘县一起暴发痢疾80例进行分析,在患者大便标本中查出福氏志贺菌Y变种,采取治疗患者、易感人群发放预防药、环境和饮用水消毒等措施,疫情得到控制。此为福氏志贺菌所引起的痢疾疫情。     

马鞍山市志贺菌福氏4c亚型毒力基因检测及分子分型研究

目的了解马鞍山市志贺菌福氏4 c(ShigellaF4c)分离株的毒力基因的流行模式及分子分型的特点,掌握Shi-gellaF4c在该市的流行状况。方法使用常规法进行菌株分离培养、使用全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定,鉴定为志贺菌的阳性菌株使用PCR检测ShigellaF4c的ipa H、ial、set、sen四种毒力基因及应用PFGE进行分子分型。结果 ipa H、ial、set、sen四种毒力基因在76株ShigellaF4c的携带率分别为100%、97.4%、96.1%、90.8%,其中67株ShigellaF4c四种毒力基因全为阳性,占88.2%;本地区ShigellaF4c携带毒力基因模式分成五大类型,Ⅰ型是主要毒力基因模式。PFGE电泳条带图谱显示,ShigellaF4c中100%相同的菌株数较少;100%相同的都为同一年代,91%相同的菌株出现跨年度;不同年代分离株无完全相同基因型,地域方面没有明显联系。结论马鞍山地区S.F4c分离株携带ipa H、ial、set、sen四种毒力基因普遍存在,毒力强是本地区ShigellaF4c主要特征之一;ShigellaF4c在本地区无显著的流行迹象,属于散在发病。     

福氏志贺菌主动外排基因acrA的克隆及原核表达

目的对福氏志贺菌外排基因acrA进行克隆和原核表达,为进一步研究其在志贺菌外排机制中的作用奠定基础。方法参考福氏志贺菌2aacrA基因序列设计一对特异引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列。以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增acrA基因并与pMD18-T载体连接,然后转化DH5α。提取重组质粒pMD18-acrA,经BamHI/SalI双酶切并与载体pET30a连接后转化宿主菌BL21(DE3)pLys,通过IPTG诱导表达目的蛋白。结果克隆的acrA基因长度为1122bp,核苷酸序列与GenBank上公布的序列完全相同。原核表达经SDS-PAGE及WesternBlotting检测和鉴定,结果表明重组载体pET-30a-acrA可成功地在大肠杆菌中表达AcrA蛋白。结论成功构建了福氏志贺菌acrA基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,该研究为了解AcrA蛋白的特性、功能以及对福氏志贺菌多药耐药机理的深入研究奠定了基础。     

福氏志贺菌对诺氟沙星耐药性及耐药机制的研究

目的研究福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药性及耐药机制。方法收集福氏志贺菌３０株,进行抗菌药物敏感试验,４株耐药菌,１株敏感菌和福氏志贺菌标准菌５１５７３的ｇｙｒＡ基因的Ｎ末端编码区进行ＰＣＲ扩增并克隆和测序。结果福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药率高达５３．３％,ｇｙｒＡ基因的序列分析结果揭示存在３个导致氨基酸改变的基因点突变：丝氨酸８３→亮氨酸,天冬氨酸８７→天冬酰氨,天冬氨酸８７→甘氨酸。结论福氏志贺菌对诺氟沙星已有较高的耐药性,ｇｙｒＡ基因点突变与福氏志贺菌对诺氟沙星的耐药性有关。     

2009～2011年无锡市副溶血性弧菌分离菌株的毒力检测及PFGE分析

目的了解无锡市2009～2011年副溶血性弧菌分离株携带的主要毒力因子的流行状况,并对同血清型菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。方法应用PCR方法检测分离的35株副溶血性弧菌耐热性溶血毒素基因(tdh)、耐热性溶血毒素相关的溶血毒素基因(trh)和不耐热溶血毒素基因(tlh)。根据美国CDC PulseNet实验方法,用限制性内切酶SfiⅠ对O3﹕K6血清型菌株的染色体进行酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 35株副溶血性弧菌tdh、trh及tlh基因的携带率分别为85.7%、8.6%和100%,77.1%的副溶血性弧菌携带的毒力基因为tdh+、trh-、tlh+。PFGE图谱显示,19株O3﹕K6血清型的副溶血性弧菌共有9种PFGE带型,带型100%相同的菌株几乎都出现在同一年代相近的时间点,但也出现了跨年代菌株。结论无锡市副溶血性弧菌致病性较强,具有潜在的O3﹕K6型副溶血性弧菌暴发流行可能,需进一步加强监测管理。     

龙岩市239株沙门菌毒力基因检测结果分析

目的 了解龙岩市沙门菌毒力基因携带与变迁情况,为沙门菌病的防制提供理论依据。方法 对1991-2017年间收集的分离自人体与食品样本的239株沙门菌进行复核鉴定,并用PCR方法检测invA、sopB、sifA、sscA、sseE、spvB、spvC、spvR、pefA等9个沙门菌毒力基因的片段。结果 龙岩市沙门菌以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主,占62.3%(149/239),属于SPI1的invA、sopB毒力基因检出率为100%,属于SPI2的sseE、sscA、sifA毒力基因的检出率分别为99.2%、95.0%、85.4%,毒力质粒基因spvC检出率71.1%,pefA、spvB、spvR检出率均为46.4%。并且其携带数量也随着时间的进程而显著增加;肠炎沙门菌质粒毒力基因携带率显著高于鼠伤寒沙门菌。肠炎沙门菌以检出全部9种毒力基因为主,占83.5%(76/91);鼠伤寒沙门菌以invA、sopB、sseE、sscA、sifA阳性,spvB、spvR、pefA阴性结果多见,占77.6%(45/58)。人体与食品样本来源的沙门菌所携带毒力基因数量没有差异。结论 龙岩市沙门菌携带毒力基因数量较多,毒力较强,质粒毒力基因随着时间的进程而累积,人源性与食源性沙门菌交叉污染严重,必须加强人、禽、畜沙门菌病的监测与管理。     

Epidemiological typing of Moraxella catarrhalis by pulsed field gel electrophoresis

Pulsed field gel electrophoresis (pfge) was used to compare 59 strains of Moraxella catarrhalis to evaluate pfge for the epidemiological typing of this organism. pfge-generated patterns were compared with those obtained by small fragment restriction enzyme analysis (rea) and species-specific probe hybridization. The strains used in the study were isolated from various geographic locations and included proven epidemiologically related strains. pfge yielded more unique patterns than dna-dna hybridization - 30 versus 18, respectively - but fewer than rea, which generated 45 unique patterns. Strains that demonstrated the same rea pattern or dna-dna hybridization pattern did not always demonstrate the same pfge pattern. For example, in 23 epidemiologically unrelated strains that shared six rea patterns, pfge differentiated the isolates into 12 patterns. Conversely, strains that demonstrated the same pfge pattern did not always demonstrate the same rea pattern or hybridization pattern. For example, in 42 strains that shared 13 pfge patterns, rea differentiated the isolates into 31 patterns and dna-dna hybridization differentiated them into 16 patterns. However, compared with rea, pfge yielded less complex patterns that were more easily comparable, and compared with dna-dna hybridization, pfge was technically easier.     

脉冲场凝胶电泳分子分型技术在一起肉毒中毒诊断中的应用

目的 实验室检测2例疑似肉毒毒素中毒病例的3份相关样本,探究中毒事件发生原因,为临床治疗提供参考。方法 参照GB 4789.12-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》对1份自制腐乳和2份病例的粪便样本进行前处理,应用实时荧光定量PCR法检测样本中肉毒毒素基因,以血琼脂平板和营养琼脂平板分离培养单菌落,将分离出的3株肉毒梭菌进行脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis）,通过BioNumerics(BN)软件对图谱进行聚类分析。结果 1份自制腐乳和2份病例粪便样本的肉毒毒素基因检测结果,均为A型肉毒梭菌核酸阳性,3份样本均分离出A型肉毒梭菌。3株肉毒梭菌通过脉冲场凝胶电泳分子分型检测,得到指纹图谱,经BN软件聚类分析同源性为100%。结论 本次事件是一起因食用受到A型肉毒梭菌污染的自制腐乳而引起的肉毒中毒,分离出的3株肉毒梭菌通过PFGE分子分型确定为同一来源。今后应加强大众预防肉毒中毒的宣传教育,减少此类中毒事件的发生。     

脉冲场凝胶电泳分子分型技术在一起肉毒中毒诊断中的应用

目的 实验室检测2例疑似肉毒毒素中毒病例的3份相关样本,探究中毒事件发生原因,为临床治疗提供参考。方法 参照GB 4789.12-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》对1份自制腐乳和2份病例的粪便样本进行前处理,应用实时荧光定量PCR法检测样本中肉毒毒素基因,以血琼脂平板和营养琼脂平板分离培养单菌落,将分离出的3株肉毒梭菌进行脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis）,通过BioNumerics(BN)软件对图谱进行聚类分析。结果 1份自制腐乳和2份病例粪便样本的肉毒毒素基因检测结果,均为A型肉毒梭菌核酸阳性,3份样本均分离出A型肉毒梭菌。3株肉毒梭菌通过脉冲场凝胶电泳分子分型检测,得到指纹图谱,经BN软件聚类分析同源性为100%。结论 本次事件是一起因食用受到A型肉毒梭菌污染的自制腐乳而引起的肉毒中毒,分离出的3株肉毒梭菌通过PFGE分子分型确定为同一来源。今后应加强大众预防肉毒中毒的宣传教育,减少此类中毒事件的发生。     

弓形虫不同株染色体DNA多态性PFGE分析

目的分析弓形虫不同分离株染色体DNA多态性。方法采用PFGE技术对弓形虫8个分离株进行分子核型分析。结果在2.0～6.0Mb范围内分离出7～8条染色体,各株PFGE电泳分子核型大体相似,但部分染色体DNA电泳迁移速度并不一致并存在共迁移现象,8个分离株分为3个类型。结论弓形虫不同分离株既存在一定的同源性,但同时又显示染色体DNA多态性。这可能同弓形虫不同分离株毒力等生物特性的差异有关。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

成都地区肉鸭屠宰链弯曲菌毒力基因分布及分子分型研究

目的 了解并分析肉鸭屠宰环节中弯曲菌分离株的9种毒力基因分布及分子分型特征。方法 利用特异性引物对弯曲菌9种与致病力相关的毒力基因进行PCR检测;参照美国PulseNet 脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准方法,对68株鸭源弯曲菌分离株进行PFGE分型。结果 毒力基因PCR检测结果显示空肠弯曲菌中cadF、iamA和cheY毒力基因携带率均为100%,flaA(97.1%)、cdtB(94.3%)、cdtC(94.3%)和ciaB(80%)毒力基因的携带率也较高,其余毒力基因cdtA(25.7%),virB11(2.9%)较低;结肠弯曲菌中除cadF(100%)毒力基因外,高于50%携带率的毒力基因有cheY(84.8%)、cdtB(72.7%)、iamA(66.7%)和cdtA(54.5%),另外4个毒力基因flaA(48.5%)、virB11(18.2%)、cdtC(36.4%)和ciaB(18.2%)携带率均较低。利用PFGE方法对弯曲菌分离株进行分子分型,结果显示35株空肠弯曲菌和33株结肠弯曲菌可分为15个和11个谱型,表现为较低的遗传多样性。结论 弯曲菌毒力基因分布广泛,且空肠弯曲菌携带率较高;PFGE基因谱型相似性表明该肉鸭屠宰场存在交叉感染和弯曲菌沿屠宰链传播的现象。     

无锡市腹泻病人沙门菌的病原学特征及分子分型研究

目的分析无锡市腹泻人群中分离的沙门菌的流行特征;同时比较主要血清型菌株间的脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型差异,为沙门菌感染的防控提供实验数据。方法收集2015年无锡市腹泻病人的粪便标本,分别进行沙门菌的分离鉴定、药敏试验、血清型分型以及PFGE分型分析。结果 756份粪便标本中共分离到32株沙门菌,阳性率为4.23%;检出时间主要集中在5~10月份,感染人群以老年人为主。药敏试验说明无锡地区的沙门菌对氨苄西林的耐药率最高,达56.25%;对环丙沙星和头孢他啶的耐药率最低,均为6.25%。32株沙门菌共鉴定出11种血清型,以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主,分别占31.25%和21.88%。对这2种血清型的沙门菌进行PFGE分析,显示肠炎沙门菌所有带型的相似度均在85%以上,鼠伤寒沙门菌的带型各不相同。结论无锡市沙门菌的感染具有明显季节和年龄分布差异性,流行的优势血清型为肠炎沙门菌。无锡市需同时加强对食品和环境中沙门菌的监测。     

吉林省小肠结肠炎耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的对小肠结肠炎耶尔森氏菌全DNA进行酶切，了解吉林省小肠结肠炎耶尔森氏菌在核酸水平的差异。方法用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法进行分析。结果用PFGE将33株小肠结肠炎耶尔森氏菌分成7个核型，其中0：3血清型分出5个核型；0：9血清型2个核型。结论提示脉冲场凝胶电泳分析可用于小肠结肠炎耶尔森氏菌遗传关系的研究，以及分析暴发流行和常规监测，追踪传染源。     

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

目的检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法采集病人静脉血,分别以试管凝集试验(SAT)、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定,19株为羊种,1株为牛种;羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后,共获得了8种不同带型,带型相似度在80%~100%之间,牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大,具有较好的分辨能力。结论河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别,AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段,为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。