几乎全长的CRISP90基因的扩增与克隆

以自行设计合成的一对引物（＃Ｐ５／＃７３１），应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ），从基因组ＤＮＡ中扩增了编码９０ＫＤａ的变异性表面特异蛋白的几乎全长的基因。ＰＣＲ产物被克隆到质粒中，并通过双脱氧链终止法将插入的基因片段进行了序列分析，推导出的氨基酸序列半胱氨酸含量为１１．８ｍｏｌ％，而且多数的半胱氨酸是以ＣＸＸＣ基序重复出现２６次，序列分析发现有２个天冬酰胺连接的糖基位点。基因序列显示出一个２０１９ｂｐ长的开放阅读框架。同源性比较发现它与编码７２ＫＤａ人的兰氏贾第鞭毛虫虫株的变异性表面蛋白基因，有相当强的同源性     

蓝氏贾第鞭毛虫承德株分子生物学研究

目的：探讨蓝氏贾第鞭毛虫大、小型包囊存在的原因。方法：用分子生物学技术对３株贾第虫（ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）进行ｔｉｍ基因扩增和序列测定。结果：经与ＧｅｎＢａｎｋ登记虫株比较和用ＤＮＡｓｔａｒ软件处理的结果表明,此３株贾第虫的基因型属２型（ＪＨ型）。结论：大、小型包裹在形态学上经过统计学处理显示有显著差异,但与基因型无关。     

广东地区GBV-C/HGV5'NCR区序列变异的研究

目的 了解广东地区ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ５＇ＮＣＲ区的序列变异情况。方法 以ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的５＇ＮＣＲ区安全同源的序列设计合成引物用于套式ＲＴ－ＰＣＲ。从广东地区的１０例ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染者血中扩增了１０个充列,分别克隆对ｐＵＣ１９、ｐＴ－Ａｄｖ载体。以３５Ｓ标记的双脱氧链末端终止法对这１０个序列分别进行正反两个方向的序列测定。结果 １０株充列相互间同源性最大为１００％,最小为８４．４％。与Ｇ     

铜绿假单胞菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因分析

目的明确临床分离的21株铜绿假单胞菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况。方法采用微量肉汤法测定临床分离的21株铜绿假单胞菌对15种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应分析AMEs基因型。结果该21株菌呈现多重耐药,对庆大霉素、妥布霉素的耐药率分别为33.3%、38.1%,其余13种的耐药率在23.8%~100%。7株(33.3%)检出氨基糖苷类修饰酶基因。结论临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药严重,AMEs基因携带率很高。     

人分泌型内皮抑素质粒的构建及序列测定

目的：旨在获得人内皮抑素(endostatin)分泌型基因片段。方法：合成含信号肽的上游引物，用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因，10g／L琼脂糖凝胶电泳后回收，将其重组入PGEM-T载体，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。结果：经Genbank分析证实，所获得的645bp基因片段序列属于信号肽及人内皮抑素功能区段基因，翻译为蛋白质序列正确。结论：本研究为应用内皮抑素基因进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。     

人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：从我国蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)中寻找贾第虫病毒。方法 对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养，将其总核酸电泳，并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT－PCR，将产物回收后连接到Pmd18-T载体上进行克隆并测序，通过BLAST对Gen Bank进行同源性搜索。在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约7．0kb的片段。该核酸不能被DNA酶（100μg/ml）降解。但可被RNA酶（10μg/ml）降解。经RT－PCR扩增后得到1条预计856bp的片段，所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为98％。结论 在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒，该病毒属于蓝氏贾第虫病毒。     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

人源性蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因的克隆及序列分析

目的克隆蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,并应用生物信息学方法进行分析。方法根据蓝氏贾第鞭毛虫Elp3已知基因序列的特点设计引物,利用PCR技术扩增获得Elp3的核苷酸序列,连接到pET28a载体并测定序列。应用生物信息学方法分析Elp3基因的序列同源性与结构特征。结果扩增片段长度为1767bp,测序结果与蓝氏贾第鞭毛虫WB株(GL50830)同源性100%。可构建生物进化树,进行同源结构建模发现,71-362aa具有一个保守的S-腺甙基蛋氨酸区域,458-584aa具有组蛋白乙酰基转移酶区域。结论成功克隆了蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,生物信息学分析发现,其在进化上与其它物种不属同一起源,具有SAM和HAT的结构和功能,这些发现为进一步研究其生物学功能提供了依据和线索。     

无精子症患者YRRM基因的研究

目的探索无精子症因子基因的候选基因之一ＹＲＲＭ基因在无精子症患者中的异常,了解中国人群的ＹＲＲＭ基因的形式。方法利用特异扩增ＹＲＲＭ基因的引物,进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。用睾丸提取的总ＲＮＡ进行反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）。对部分ＹＲＲＭ基因的片段进行ＤＮＡ序列分析。结果７４例无精子症患者中,４例未扩增出ＹＲＲＭ基因片段（５．４４％）,ＲＴ－ＰＣＲ显示仅睾丸出现５００ｂｐ的ＤＮＡ条带,序列分析结果表明中国汉族人群的ＹＲＲＭ的核酸序列同ＹＲＲＭ１型。结论ＹＲＲＭ基因的异常与无精子症密切相关,ＹＲＲＭ基因为睾丸特异表达,中国人群ＹＲＲＭ的形式为ＹＲＲＭ１型,其ＤＮＡ序列组成完全同ＹＲＲＭ１型。     

蠕形螨cDNA文库的构建及鉴定

目的构建蠕形螨cDNA文库,以便进一步研究蠕形螨相关的基因。方法采用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用TransZol Up试剂盒提取其总RNA,然后反转录合成第1链cDNA,通过LD-PCR获得第2链cDNA,将双链cDNA纯化去除小片段,收集大于500 bp的cDNA片段,与pGM-T载体连接,将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞TOP10建成蠕形螨cDNA文库,检验文库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入cDNA片段大小进行分析。结果 cDNA文库的库容量为2.56×106cfu,重组效率达98%,平均插入片段长度大于1 000 bp。结论构建的蠕形螨cDNA文库质量良好,为进一步对蠕形螨基因探索奠定基础。     

人甲状旁腺素N端34肽基因的合成,克隆及融合表达

选用大肠杆菌偏爱的密码子,用计算机辅助设计、合成长度分别为59 、59 及60 碱基的三段寡核苷酸。以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR 合成完整的hPTH(1 34) 基因,并克隆到pUC18 载体中。对克隆基因进行序列分析,结果与设计的完全一致。将该基因与表达载体pKA 连接构建表达质粒pKAT,转化大肠杆菌JM105 细胞,SDS PAGE 表明hPTH(1 34) 融合蛋白获得了表达,并且酸水解后融合蛋白被裂解为大小两个片段。     

苯丙氨酸羟化酶基因内点突变的检测与分析

目的　 为了检测江苏省地区苯丙酮尿症 ( phenylketonuria,PKU)患者血苯丙氨酸羟化酶 ( phenylanine hydroxylase,PAH)基因内突变点及其对 PKU致病的相关性 ,从分子水平上提高诊断率。　 方法 :采用了 4对引物 ,外显子 4、7、11( E4、E7、E11)及 STR,应用多聚酶链反应单链构象多态 ( PCR- SSCP)银染技术检测分析了 6个 PKU家系共 2 1个成员。　 结果 :2 1例检测样品中 1个家系 4位成员测出 E4存在基因突变 ,父母为不同的点突变的携带者 ,子女为遗传复合体。　 结论 :为该家系的产前诊断提供了遗传标志     

人类血小板抗原-1系统基因分型方法的建立及初步应用

目的建立人类血小板抗原-1系统的基因分型方法,并对本地区献血小板者进行血小板抗原-1基因分型。方法以人类基因组DNA为模板,设计特异性引物,扩增目的基因,用琼脂糖凝胶电泳观察;同时将PCR产物纯化后进行测序,将其结果进行同源性比较;再用已建立的方法对本地区的献血小板者进行人类血小板抗原-1基因分型。结果成功建立了人类血小板抗原-1基因分型方法;本地区的HPA-1a、HPA-1b基因频率分别为97.7%、2.3%。结论构建的人类血小板抗原系统-1基因分型方法结果准确,操作简单,为建立血小板血型库奠定基础。     

乙肝病毒e抗原系统与HBV DNA的相关性研究

目的：探讨乙肝病毒e抗原系统与HBVDNA的相关性。方法：应用PCR方法检测HBVDNA,ELISA法检测乙肝病毒e抗原系统。结果：HBeAg（＋）的乙肝病人HBVDNA阳性率89．19％,抗HBe（＋）的乙肝病人HBVDNA阳性率60％,HBeAg及抗HBe均阴性的乙肝病人HBVDNA阳性率43．75％,HBeAg（＋）的各型乙肝HBVDNA阳性率无明显差别（P＞0．05）,抗HBe（＋）的各型乙肝以慢性中重度乙型肝炎患者HBVDNA检出率最高（75％）。结论：HBVDNA阳性率与乙肝感染类型无关,而与e抗原系统存在状态有关,HBeAg和抗HBe均阴性的患者中也有43．75％的病人有DNA复制。     

肺癌p53基因突变与蛋白表达关系的研究

目的 以测序结果为标准,探讨免疫组织化学和聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）两种方法用于检测肺癌ｐ５３基因突变的敏感性及优缺点。方法 用免疫组织化学,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ产物直接测序检查３０例肺癌标本的Ｐ５３蛋白和基因改变,结果 ３０例肺癌标本经测序共检出２２例突变,突变位于第５外显子８例（３６％）,位于第６外显子２例（９％）,位于第７外显子７例（３２％）,位于第８外显子５例（２     

利用退火反应产生粘性末端的基因克隆新方法

目的通过引物设计和退火反应产生内切酶的粘性末端,旨在开发一种高效、简单、可靠的分子克隆方法。方法选定限制性内切酶（平末端或者粘性末端）设计3条或4条引物,同时进行两次独立的聚合酶链式反应（PCR）,随后把两次PCR产物回收后混在一起经过解链退火,再将其与双酶切的载体质粒进行连接反应,最后转化即可得到目的克隆。结果利用此方法成功一次性将若干靶基因（P90rsk、Nprl2、Mios、Ragc、S6k、Pkca）构建在经EcoRV和NotI双酶切后的pcDNA3.1(+)载体上,经酶切及测序验证。结论该方法无需考虑靶基因内部是否存在酶切位点,可省去PCR产物酶切及之后的纯化回收过程,可快速并准确地克隆目标基因。     

应用PCR检测石蜡包埋骨髓活检标本B淋巴细胞克隆性增生

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测慢性Ｂ细胞性白血病、多发性骨髓瘤及Ｂ细胞恶性淋巴瘤骨髓浸润的石蜡包埋骨髓活检标本克隆性免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排共１９例，其中１６例检测出ｌｇ基因单克隆性重排，总阳性率为８４％。非肿瘤大致正常骨髓标本和急性粒细胞白血病骨髓标本则出现多克隆性弥漫带或无扩增产物。以上结果表明：石蜡包埋骨髓活检标本来源的ＤＮＡ可用于ＰＣＲ检测单克隆性ＩｇＨ基因重排。     

肿瘤坏死因子-α-308基因多态性与儿童哮喘的相关性研究

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)-α-308基因多态性是否与湖北汉族儿童哮喘的易感性相关。方法 采用PCR-α-RFLP法对113例湖北汉族儿童哮喘者和126例湖北汉族健康儿童TNF-α-308位基因进行TNF1和TNF2基因型检测。结果 TNF的各基因型频率在湖北汉族儿童哮喘患者中分别为86．7％(TNF-1)、0％(TNF-2)和13．3％(杂合型),在健康儿童中分别为82．5％、0和17．5％,两组之间的基因型频率分布的比较无显著性差异(P=0．372);TNF1和TNF2的等位基因频率在儿童哮喘患者中分别为93．4％和6．6％,在健康儿童中分别为91．3％和8．7％,两组比较无显著性差异(P=0．602)。结论 TNF-α-308基因多态性与湖北汉族儿童哮喘不相关。     

成年型多囊肾病家系成员的症前基因诊断

目的：应用ＰＣＲ方法对常染色体显性遗传性多囊肾病（ＡＤＰＫＤ）家系进行症前基因方法：用ＰＣＲ扩增与ＰＫＤＩ位点连锁的高度多态性的微小卫星体ＤＮＡ（ＳＭ７,ＡＣ２．５,ＫＧ８,ＣＷ２）为遗传标记,对１０个ＡＤＰＫＤ家系的１０４个成员（包括２８个患者）找出染色体上与疾病连锁的单体型,进行连锁分析。结果：对９个无临床症状,且Ｂ超检查呈阴性结果的儿童做出了症前基因诊断。结论：能够应用ＰＣＲ方法对ＡＤＰ－Ｋ     

急性髓系白血病M2b型患者AML1与MTG8基因重排融合的研究

作者研究了４１例急性聚系白血病（ＡＭＬ）Ｍ２ｂ患者ＡＭＬ１和ＭＴＧ８基因重排融合情况。利用Ｓｏｕｒｔｅｒｎ印迷杂交技术，发现８０％（２４／３０）患者有ＡＭＬ１基因重排，７８．６％（２２／２８）患者有ＭＴＧ８重百。使用逆转录－多聚酶链反应，在３７例ＡＭＬ１－Ｍ２ｂ患者中均检出ＡＭＬ１／ＭＴＧ８融全基因。