Tiam1基因过表达对结直肠癌细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨Tiaml（T lymphoma invasion and metastasis1）基因转染对结直肠癌细胞增殖、转移能力的影响。方法采用裸鼠皮下接种结直肠癌细胞的方法观察Tiaml基因对结直肠癌细胞体内增殖能力的影响,利用外科原位移植技术观察Tiaml对体内增殖、转移能力的影响。结果接种HT29／Tiaml细胞（转染Tiaml基因）的裸鼠皮下肿瘤生长明显加快,肿瘤体积自皮下注射后的第7天起与接种HT29／mock细胞（转染对照）的裸鼠皮下肿瘤比差异有统计学意义,接种HT29／Tiaml细胞的裸鼠皮下肿瘤第20天的平均体积是接种HT29／mock细胞组的2．5倍。进行结直肠癌细胞外科原位移植6周后,接种HT29／Tiaml细胞的裸鼠结肠原位肿瘤重量明显大于接种HT29／mock细胞的裸鼠（t=-14．916,P〈0．01）。采用外科原位移植的方法比较HT29／mock和HT29／Tiaml细胞的体内转移能力。在HT29／Tiaml细胞组,7只裸鼠全都发生了腹腔转移,4只发生了肝转移,其中有1只裸鼠发生了广泛转移,包括脾、肺及淋巴结等转移。在HT29／mock细胞组,7只中只有2只裸鼠发生了腹腔转移,没有一只裸鼠发生远处转移。结论Tiaml基因是结直肠癌增殖、转移的促进基因,Tiaml表达可作为结直肠癌增殖、转移过程中一个有价值的指标。     

大肠肿瘤中Tiam1的表达及临床意义

目的探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphom a invasion and m etastasis induc ing factor 1,Tiam1)表达与大肠癌发生、发展和转移的关系。方法应用免疫组化方法检测大肠正常组织、大肠腺瘤、大肠癌和大肠淋巴结转移癌石蜡组织标本中Tiam1蛋白的表达情况。应用RT-PCR和免疫组化方法检测大肠癌细胞株中Tiam1 mRNA和蛋白的表达情况。结果Tiam1蛋白在大肠正常组织、腺瘤、癌及淋巴结转移癌中表达差异有显著性(2χ=23.561,P<0.01);两两比较发现,腺瘤Tiam1表达比大肠正常组织高(Z=-2.423,P<0.05),淋巴结转移癌组织Tiam1表达比大肠癌组织高(Z=-2.051,P<0.05),而大肠癌组织与腺瘤组织Tiam1表达差异无显著性(Z=-0.938,P>0.05)。在大肠癌组织中,伴发转移的大肠癌组织比未发生转移的大肠癌组织Tiam1表达明显增强,差异具有显著性(Z=-3.176,P<0.01)。RT-PCR结果显示Tiam1基因在高转移的LoVo和SW 620中呈高表达,在低转移的LS174T和HT29中呈低或不表达,在SW 480、HCT116等呈中度表达。结论Tiam1表达与大肠癌转移存在密切关系,Tiam1表达可作为大肠癌转移过程中一个有价值的指标。     

表达谱基因芯片筛选结直肠癌转移中Tiam1相关基因

目的：筛选在结直肠癌远处转移中T细胞淋巴瘤侵袭转移1(T-cell lymphoma invasion and metastasis 1, Tiam1)相关基因并鉴定其表达。方法腹腔注射二甲基肼( dimethylhydrazine, DMH)建立小鼠结直肠癌模型,收集Tiam1转基因小鼠和野生型小鼠的结直肠癌原发灶新鲜组织5对,应用Affymetrix小鼠全基因组表达谱芯片检测两组的差异表达基因,qRT-PCR技术验证部分差异基因以确定结果的可靠性。结果基因芯片检测结果显示差异在3倍以上的基因共794个,有远处转移的Ti-am1转基因小鼠结直肠癌组织中表达上调的基因共400个,下调基因共394个;通过生物信息学分析及GENEMANIA共表达网络构建,筛选3个(PIK3R5、FIGF、RPS6KA6)特异相关的差异基因进行qRT-PCR技术验证,验证结果与基因芯片结果检测相符。结论通过基因芯片技术筛选和鉴定结直肠癌转移中Tiam1相关基因,建立了特异性结直肠癌转移表达谱,为寻找结直肠癌远处转移的分子标志物提供依据。     

Tiaml在鼻咽癌细胞株中的表达及其与侵袭转移的关系

目的 探讨Tiam1对人鼻咽癌细胞株生物学特性的影响.方法 应用脂质体lipofectamine2000法对C666-1、CNE1两种人鼻咽癌细胞株转染Tiam1/C1199HA质粒.逆转录PCR、即时PCR、Western blot方法检测Tiam1转染组与空载体转染组细胞中Tiam1的表达,细胞黏附实验、划痕实验和基质胶侵袭实验检测不同转染组间细胞的黏附、迁移和侵袭能力.结果 C666-1、CNE1细胞Tiam1稳定转染组Tiam1的表达、细胞黏附、迁移及侵袭能力较空载体转染组均有明显增强(P<0.05).结论 Tiam1基因与人鼻咽癌C666-1、CNE1细胞株的侵袭转移有关.     

HLJ1高表达对结直肠癌细胞周期和侵袭能力的影响

目的构建并鉴定p CDNA3.0-HLJ1真核表达质粒,检测HLJ1基因表达上调对结直肠癌细胞周期和侵袭能力的影响。方法利用反转录PCR法钓取HLJ1基因片段并与p CDNA3.0载体连接,酶切及测序鉴定p CDNA3.0-HLJ1重组质粒。在结直肠癌细胞SW480和HT29中分别转染p CDNA3.0和p CDNA3.0-HLJ1,应用荧光定量PCR和Western blot法检测HLJ1的表达,分别应用流式细胞仪和细胞侵袭实验检测其对细胞周期和侵袭能力的影响。结果 p CDNA3.0-HLJ1重组质粒构建成功,并在结直肠癌细胞中成功表达。转染p CDNA3.0-HLJ1质粒入结直肠癌细胞后,肿瘤细胞G_1/G_0期比例明显增加(P0.05),侵袭能力明显减弱(P0.05)。结论 p CDNA3.0-HLJ1质粒为进一步研究HLJ1在结直肠癌中的作用提供实验基础。HLJ1将结直肠癌细胞阻滞在G_1期并抑制其侵袭能力。     

PRL-3基因对结直肠癌细胞形态及粘附、运动能力的影响

目的探讨PRL-3的过表达或敲低对结直肠癌细胞相应的生物学特性的影响。方法常规进行细胞培养,应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞结构;应用运动小室实验检测PRL-3对结直肠癌迁移能力的影响;应用细胞粘附实验测定细胞在I型胶原上的粘附性。结果粘附实验结果表明,与SW480/EGFP/mock和SW480/EGFP细胞相比,SW480-EGFP-PRL-3细胞的粘附能力增强,而SW480-PRL-3-KD1细胞的粘附能力减弱,差异有统计学意义（F=22.013,P〈0.01）。运动小室实验证明,SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/mock及SW480-PRL-3-KD1细胞的运动能力差异有统计学意义（F=21.368,P〈0.01）,说明PRL-3与结直肠癌细胞的运动迁移能力有关。结论 PRL-3基因是结直肠癌细胞粘附、迁移的促进基因。     

LASP-1稳定转染对人结肠癌细胞株SW480细胞增殖及成瘤能力的影响

目的 探讨LIM和SH3蛋白1(LASP-1)对人结直肠癌细胞株体内外增殖能力的影响.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测LASP-1在结直肠癌细胞株中的表达,筛选LASP-1不/低表达细胞株;将LASP-1 cDNA导入内源性低表达LASP-1基因的人结直肠癌细胞株SW480细胞中,同时构建带绿色荧光蛋白(CFP)的表达载体转染SW480细胞株,G418筛选抗性克降,经鉴定后利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测LASP-1对细胞体外增殖的影响,通过整体成像系统观察LASP-1对细胞在裸鼠体内成瘤能力及肿瘤生长能力的影响.结果 成功构建pcDNA3-LASP-1和pEGFP-LASP-1表达载体,将其稳定转染低表达LASP-1的SW480细胞中.通过7 d连续比较,LASP-1基因的导入明显促进结直肠癌细胞的体外增殖能力.裸鼠皮下注射携带GFP的稳定细胞系,整体成像观察过表达LASP-1的细胞成瘤能力和肿瘤生长速度均强于对照细胞.结论 LASP-1基因具有促进结直肠癌细胞增殖的能力,可能作为结直肠癌发生过程中一个有价值的指标.

Abstract：

Objective To investigate the effect of LIM and SH3 protein 1 (LASP-1)expression on the proliferative ability of human colorectal cancer cells in vitro and in vivo. Methods RT-PCR and Western blot were used to screen cells of the colorectal cancer cell line with no or with minimal endogenous LASP-1 expression. LASP-1 cDNA with or without GFP was transfected into SW480 colorectal cancer cells with minimal LASP-1 expression. Stable transfectants were established after G418 selection. Cell proliferative capacity was assessed by MTT assay. Tumor growth was visualized by whole-body imaging system. Results pcDNA3-LASP-1 and pEGFP-LASP-1 vectors were successfully constructed and transfected into the SW480 cells. After comparative study for 7 days, LASP-1 over-expression was found capable of enhancing signific antly the proliferation of colorectal cancer cells in vitro. Stable transfectants with GFP expression were inoculated subcutaneously into the nude mice. Tumorigenesis and proliferation ability of LASP-1-overexpressed transfectants were higher than those of the control cells. Conclusion LASP-1 gene expression enhances proliferation of colorectal cancer cells and may serve as a useful marker for colorectal cancer progression.     

沉默C20ORF32表达对结直肠癌LOVO细胞增殖与侵袭的影响

目的探讨沉默Crk相关底物家族成员C20ORF32基因表达后,对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响。方法应用蛋白印迹法(Western blot)检测4种结直肠癌细胞系(LOVO、SW620、HT-29和SW480)中C20ORF32的表达状况;用装载了C20ORF32 shRNA的慢病毒颗粒,感染高表达C20ORF32的结直肠癌细胞系LOVO后,运用免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹的方法检测其对C20ORF32基因的沉默效果,并通过MTT法和软琼脂克隆形成实验检测对细胞增殖能力的影响,用Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力。结果与其他3株细胞系相比,C20ORF32蛋白在LOVO细胞中明显高表达(t=15.33,P0.001)。下调C20ORF32表达后,LOVO细胞的增殖速度在24h以及48h显著降低(24hF=81.32,P0.001;48hF=13.33,P0.05),集落数目明显减少(F=74.21,P=0.0002),细胞侵袭能力明显减弱(F=144.38,P0.001)。结论 C20ORF32的高表达可能与结直肠癌细胞的快速增殖与侵袭有关,参与了结直肠癌的恶性进展过程。     

小分子干扰RNA 沉默RhoGDI2 基因表达对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及其机制

目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)沉默RhoGDI2 基因的表达,初步探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。方法:分别运用Western blot 和RT-qPCR 检测结肠癌细胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116 基因RhoGDI2 的表达情况。设计并合成RhoGDI2 siRNA 干扰序列,按照LipofectamineTM2000 转染方法将siRNA 干扰序列转染到目的细胞,设置实验干扰组、空白对照和阴性对照组;CCK-8 实验检测细胞增殖能力,细胞划痕试验和Transwell 实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果:人结肠癌细胞株RhoGDI2 表达量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116;RKO 细胞siRNA干扰后RhoGDI2 表达抑制率大于70%:实验干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞增殖率分别是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05;实验干扰组细胞迁移、侵袭速率较对照组均减慢。沉默RhoGDI2 基因的表达,实验组细胞E-Cadherin 较对照组表达量高,Vimentin 蛋白表达下降。结论:结肠癌RhoGDI2 基因沉默可能通过抑制EMT 进程阻止肿瘤恶性生物学行为。     

结直肠癌中miR-200家族启动子甲基化状态分析

目的 检测HCT116、HT29、LS174t、SW480、SW620和LoVo细胞中miR-200家族启动子甲基化状态,分析其与结直肠癌临床分期、分化程度及预后的相关性;同时进行miR-200家族甲基化程度与患者生存相关性分析.方法 重亚硫酸盐测序法(bisulfite genomic sequence PCR,BSP)检测6株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR-200家族启动子甲基化程度;分析其甲基化程度与细胞恶性程度、miR-200a表达量的相关性.甲基化特异性(methylationspecific PCR,MSP)技术检测138例结直肠癌组织中miR-200家族启动子甲基化程度.结果 6株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR-200家族启动子甲基化程度不同,且其甲基化程度与细胞恶性程度成反比,与细胞株中miR-200a表达量的检测结果一致.结直肠癌组织中miR-200家族启动子甲基化程度与患者年龄无关,与患者性别、肿瘤最大径、淋巴结转移及远处转移、患者术后生存时间相关.结论 miR-200家族的表达受甲基化修饰的调控,且该调控成为影响表达量的主要原因.miR-200家族甲基化程度与结直肠癌患者生存期密切相关,可作为预后指标.     

Methylation status of T-lymphoma invasion and metastasis 1 promoter and its overexpression in colorectal cancer

T-lymphoma invasion and metastasis 1 has been implicated in tumor invasion and metastasis. However, the regulatory mechanisms underlying aberrant T-lymphoma invasion and metastasis 1 expression in human colorectal cancer have not been well defined. To investigate the relationship between methylation status and expression levels of T-lymphoma invasion and metastasis 1 gene, methylation-specific polymerase chain reaction, and immunohistochemistry staining were performed in 232 matched samples of human colorectal cancer tissue and normal colorectal mucosa. Results showed that T-lymphoma invasion and metastasis 1 protein was overexpressed in colorectal cancer, especially in metastatic cases (P < .001). The degree of T-lymphoma invasion and metastasis 1 promoter methylation was a little lower in cancer tissues than in matched normal mucosa (P < .05), and the expression level of T-lymphoma invasion and metastasis 1 was inversely related to the methylation status in cancer tissues (P < .001). Colon cancer cell lines HT29 and LS174T were treated with demethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine, resulting in promoter hypomethylation accompanied by reexpression of T-lymphoma invasion and metastasis 1 mRNA and protein. In contrast, colon cancer cell lines SW620 and LoVo were treated with hypermethylation agent S-adenosylmethionine, resulting in T-lymphoma invasion and metastasis 1 promoter hypermethylation, accompanied by suppression of T-lymphoma invasion and metastasis 1 expression and inhibition of cell growth, plate colony formation, and migration. The present study demonstrates that overexpression of T-lymphoma invasion and metastasis 1 is associated with hypomethylation status of T-lymphoma invasion and metastasis 1 promoter region in colorectal cancer tissues. It suggests that promotor hypomethylation of T-lymphoma invasion and metastasis 1 may play a role in the progression and metastasis of colorectal cancer. Pharmacologic reversal of T-lymphoma invasion and metastasis 1 promoter hypomethylation may inhibit cell proliferation and migration.     

Metastatic potential of human colorectal carcinoma SW1222 cells transfected with cDNA encoding carcinoembryonic antigen

In order to examine a role of carcinoembryonic antigen (CEA) in metastasis, cDNA encoding CEA was introduced into a clone of human colorectal carcinoma SW1222 cells. Western blot analysis revealed that all transfectants express CEA of 180 kDa while the parent clone does not. In the transfectants, the level of CEA expression in clone 3 was higher than that of clone 1. Clone 3 formed aggregates rapidly after suspended by trypsinization while clone 1 did not. In experimental metastasis assay where tumor cells were injected intrasplenically, clone 3 exhibited a higher liver-metastatic activity than clone 1. Fab fragment of anti-CEA antibody significantly inhibited both the cell aggregation and the liver metastases caused by clone 3. These findings suggested that CEA expressed on the cell surface may play an important role in hepatic metastasis from colorectal carcinoma, possibly through its cell adhesion activity.     

CD44V6的表达对大肠癌细胞骨架的影响

目的研究ＣＤ４４Ｖ６在大肠癌细胞系ＨＴ２９、ＬｏＶｏ细胞中的表达及其对细胞骨架的影响,探讨ＣＤ４４Ｖ６影响肿瘤转移的作用机理。方法应用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法研究ＣＤ４４Ｖ６在人大肠癌细胞中的表达,应用免疫荧光及共聚焦三维图像重构分析的方法,研究ＣＤ４４Ｖ６对大肠癌细胞的细胞骨架的影响。结果ＣＤ４４Ｖ６在ＨＴ２９、ＬｏＶｏ细胞中均有表达,不管在ｍＲＮＡ水平还是在蛋白质水平,高转移能力的ＬｏＶｏ细胞表达ＣＤ４４Ｖ６均高于低转移能力的ＨＴ２９细胞。将ＨＴ２９、ＬｏＶｏ细胞用ＣＤ４４Ｖ６单抗封闭则发现ＣＤ４４Ｖ６能使ＨＴ２９、ＬｏＶｏ细胞的细胞骨架发生改变。结论ＣＤ４４Ｖ６的表达与大肠癌细胞的转移潜能有关。ＣＤ４４Ｖ６可能通过影响大肠癌细胞骨架的构像和分布,从而影响大肠癌细胞的运动能力,影响大肠癌转移     

蛋白酶激活受体-1促进肺癌细胞侵袭和转移功能的研究

目的研究蛋白酶激活受体1（PAR-1）对人类肺癌细胞侵袭和转移功能的影响。方法采用阳离子脂质体介导法,将正义和反义PAR-1重组质粒“pC／PARls”和“pC／PARlas”分别转染至人肺巨细胞癌低转移株（PLA801C）和高转移株（PLA801D）细胞中;采用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹检测转染后PAR-1基因和蛋白表达水平变化;通过MTT、软琼脂集落形成、流式细胞仪、细胞-基质黏附和Transwell细胞侵袭实验检测PAR-1对肺癌细胞转移相关功能的影响。结果转染正义和反义PAR-1分别明显上调和下调了PLA801C和PLA801D的PAR-1 mRNA和蛋白表达水平。转染正义PAR-1对细胞的生长和克隆形成具有促进作用;并可明显增强细胞对细胞外基质的黏附和侵袭能力（与空载体对照组比较均P〈0．01）。相反,转染反义PAR-1对细胞模型的生长和克隆形成具有抑制作用;能明显降低细胞的S期和G2／M期（与空载体对照组比较分别为P〈0．05、0．01）、升高G0／G1期所占比例（P〈0．01）;还可使细胞对细胞外基质的黏附力（P〈0．05）和侵袭力明显降低（P〈0．01）。结论正义和反义PAR-1基因能够分别上调和下调PAR-1的表达水平;PAR-1能够影响肺癌细胞的生长和增殖、黏附和侵袭特性。抑制PAR-1的表达可能是一种治疗肺癌的途径。     

Tiam1表达与胃癌侵袭转移关系的临床和实验研究

目的检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)在正常胃黏膜组织、胃癌组织以及胃癌细胞系中的表达,探讨其与胃癌侵袭转移的关系。方法(1)应用免疫组化SABC法检测60例胃癌及正常胃黏膜组织中Tiam1蛋白的表达并分析其与胃癌临床病理参数间的关系。(2)应用逆转录PCR和SABC免疫组化技术分别检测Tiam1mRNA与蛋白在胃癌MKN45细胞(MO)及其高(MH)、低(ML)侵袭转移亚株中的表达,分析其与胃癌细胞侵袭转移能力的关系。结果(1)Tiam1蛋白在正常胃黏膜组织中阴性表达显著低于癌组织(0vs78.3%),两者差异有统计学意义(P<0.01),且随胃癌组织分化程度的降低、浸润深度的增加、TNM分期的升高及伴有淋巴结转移,Tiam1蛋白染色阳性率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。但Tiam1蛋白表达水平与胃癌患者的性别、年龄、部位及癌肿大小无关,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Tiam1mRNA和蛋白在胃癌MKN45细胞高侵袭转移亚株中的表达均较其在MKN45细胞及低侵袭转移亚株中的表达为强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Tiam1表达与胃癌侵袭转移能力呈正相关,且其有可能成为反映胃癌恶性生物学行为的一种新型标志物。