国产降纤酶对缺血/再灌注大鼠脑组织TNF-α及IL-1β mRNA表达的影响

目的观察国产降纤酶对局灶性缺血/再灌注不同时程大鼠脑组织TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达的影响,探讨降纤酶减轻脑缺血/再灌注损伤的可能机制。方法应用RT-PCR技术,分析降纤酶治疗的脑缺血3h/再灌注3h、6h、24h和72h大鼠脑组织TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达水平。结果缺血3h/再灌注72h,降纤酶治疗组动物缺血侧脑组织TNF-αmRNA的表达水平明显低于生理盐水对照组(P<0.01);降纤酶治疗组动物缺血侧脑组织IL-1βmRNA的表达水平在缺血3h/再灌注3h和6h时显著低于生理盐水组(P<0.05)。结论降纤酶减轻脑的缺血/再灌注损伤与下调细胞因子TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达有一定的关系。     

丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP10表达的影响

目的研究丁苯酞干预对大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时点脑组织中热休克蛋白10(HSP10)表达的影响,并探讨丁苯酞对缺血性脑血管病保护作用的机制。方法采用夹闭双侧颈总动脉的方法制作大鼠前脑缺血再灌注模型;H&E染色和NSE免疫组化染色神经元,观察脑组织的形态变化和记数各组神经元数目;免疫组织化学检测对照组、缺血再灌注组及丁苯酞干预组大鼠脑组织HSP10的表达水平变化。结果脑缺血再灌注后丁苯酞干预组及缺血再灌注组HSP10表达水平于再灌注后6h开始上调,3d达到高峰,丁苯酞干预组各时间点HSP10阳性表达指数均高于缺血再灌注组,丁苯酞干预组脑组织的损伤程度明显轻于脑缺血再灌注组(P<0.05)。结论丁苯酞可能通过上调大鼠缺血再灌注损伤后脑组织HSP10的表达,从而抑制前脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡,减少神经元死亡,减轻缺血再灌注后脑组织的损伤。     

亚低温对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后脑组织半胱氨酸蛋白酶-12表达及神经元凋亡的影响

目的 观察亚低温对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后脑组织半胱氨酸蛋白酶( caspase) - 12表达及神经元凋亡的影响.方法 56只大鼠随机分为正常组、假手术组、缺血组和亚低温组;后两组再分为再灌注3h、6h、12h、24h、72 h及7d6个亚组.应用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血(2 h)再灌注模型;亚低温组于缺血30 min实施病灶侧头部亚低温4h.各组大鼠在相应时点处死前行神经功能缺损评分(NDS);脑组织切片行HE、免疫组化及原位末端标记法(TUNEL)染色观察病理改变、caspase-12表达及神经元凋亡.结果 正常组及假手术组脑组织均未见明显病理改变及caspase-12和TUNEL阳性细胞.缺血组可见明显的脑梗死灶,大量神经元坏死及消失;亚低温组梗死灶较小,可见神经元固缩.与缺血组比较,亚低温组各时间点亚组NDS明显降低,脑组织caspase-12及TUNEL阳性细胞数明显减少(均P＜0.05).结论 急性脑缺血再灌注损伤后亚低温治疗可抑制脑组织caspase-12表达,减少神经元凋亡及神经功能的损害.     

葛根素对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究葛根素对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制.方法采用4血管闭塞法建立SD大鼠全脑缺血再灌注模型,并给予葛根素干预,于缺血再灌注后6、24、72 h、5、7 d进行HE染色及免疫组织化学染色,分别检测大鼠脑组织海马CA1区神经元数目、形态变化和bc1-2表达.结果 (1)脑缺血再灌注后6、24 h海马CA1区神经元未见明显死亡,再灌注后72 h、5、7 d葛根素组神经元存活数目显著高于无药物干预的再灌注组;(2)葛根素组与再灌注组比较各时间点bc1-2表达均明显增多;(3)葛根素组与再灌注组神经元存活数目与bc1-2阳性细胞数均呈显著正相关.结论葛根素对脑缺血再灌注损伤有保护作用,可延缓迟发性神经元死亡的发生,其机制可能与葛根素上调抗调亡基因bc1-2表达有关.     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后IL—6水平变化与神经元损害关系的探讨

目的 探讨大鼠局灶脑缺血再灌注后白细胞介素－6（IL－6）水平变化与神经元损害的关系。方法 将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组。应用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注损型,采用免疫组织化学方法检测大鼠脑组织IL－6的变化,用HE染色观察神经细胞损伤与白细胞浸润情况,并与正常对照组及假手术组大鼠比较。结果 IL－6在正常对照组大鼠神经元与胶质细胞仅有少量表达,缺血再灌注6小时时IL－6表达较正常神经元稍增多但无统计学意义（P＞0．05）,12小时开始在梗死周围区增高,第3天显著增强,以后逐渐下降。结论 IL－6在缺血性脑损伤中过量表达参与了脑组织的损伤过程。     

脑组织TOLL样受体2的激活与大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的关系

目的 探讨TOLL样受体2(TLR2)的激活与脑组织缺血再灌注损伤的关系.方法 线栓法制造局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型,采用免疫组织化学法观察TLR2和核因子-κB(NF-κB)在不同再灌注时间点缺血脑组织的分布和表达量,同时应用酶联免疫方法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在不同再灌注时间点缺血脑组织内浓度,并分析其表达相关性.结果 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤过程中,TLR2蛋白在缺血半影区及皮质区、纹状体区有表达,且在灌注早期(即1h)即有增强表达,在3 h即达高峰;皮质区和纹状体区NF-κB表达从6 h开始逐渐增强,于再灌注24 h达高峰;缺血侧半球皮质内TNF-α变化规律与NF-κB相似,但表达高峰在再灌注12 h;TLR2蛋白的表达与NF-κB和TNF-α表达呈正相关.结论 TLR2在脑缺血再灌注过程中被激活,可能通过NF-κB导致炎性因子TNF-α等的大量表达介导参与了脑缺血再灌注损伤的过程.     

局灶性脑缺血/再灌注损伤后大鼠脑组织tPA表达变化与细胞凋亡研究

目的　探讨大鼠脑缺血 /再灌注后脑组织内组织型纤溶酶原激活物 (t PA)表达变化及与细胞凋亡的关系和意义。方法　采用大鼠局灶性脑缺血 /再灌注模型 ,应用免疫组化染色及原位杂交技术检测脑组织 t PA表达变化 ,TU NEL 染色观察神经元的凋亡及其发生规律。结果　 t PA蛋白及 m RNA在缺血再灌注早期即开始表达 ,主要见于皮质损伤区周围及海马区 ,阳性着色的神经元表达明显 ,血管表达较弱。再灌注 4 8h神经元表达明显增强 ,缺血灶及其周边的微血管内皮表达也明显增强。再灌注 72 h表达有所下降。凋亡细胞主要出现于大脑皮质及尾壳核病变中心区的周围 ,再灌注 4 8～ 72 h达高峰。结论　脑缺血 /再灌注损伤可诱导神经元及血管内皮细胞 t PA表达增加 ,t PA可能通过促进细胞凋亡而介导再灌注损伤。     

17β-雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响

目的观察雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织HSP70表达的影响。方法72只大鼠随机分为假手术组(8只)、实验对照组及雌二醇治疗组,后两组又进一步分为局灶性脑缺血2h再灌注及3h、6h、12h、24h再灌注组,每时间点8只。线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,采用石蜡切片HE及免疫组化染色法检测脑组织损伤及HSP70的表达情况。结果假手术组大鼠未见HSP70的表达;雌二醇治疗组的脑组织缺血半暗带区损伤程度较实验对照组明显减轻;随着再灌注时间的延长,治疗组半暗带区皮质HSP70的表达较对照组上调,且呈先上升后下降趋势,在12h为表达高峰;而纹状体区其表达呈进行性下调趋势。结论17β-雌二醇具有减少脑缺血/再灌注损伤的作用,而半暗带区皮质脑保护蛋白HSP70的表达升高可能其是重要机制之一。     

大鼠局灶性脑缺血与缺血再灌注损伤IL—8的研究

目的　探讨IL-8在脑缺血损伤及缺血再灌注损伤中的作用。方法　(1)采用改良ZeaLonga线栓法大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。(2)应用双抗体夹心间接ELISA法检测脑缺血组与缺血再灌注组大鼠受损脑组织和血清中IL-8的浓度。结果　(1)脑缺血再灌注组受损脑组织中IL-8含量比脑缺血组高(P<0.05)，二者IL-8含量的变化均呈时间依赖性。前者于再灌注22h达高峰之后很快下降；后者于缺血6h达高峰，之后缓慢下降。(2)脑缺血再灌注组血清IL-8浓度于再灌注1h达峰值（7.08±1.36）pg/mL，之后很快降至较低水平；而在脑缺血组3h最高，为(3.61±0.81)pg/mL，随后缓慢下降。结论　脑缺血和脑缺血再灌注损伤均有IL-8参与，IL-8在脑缺血再灌注损伤中所起的作用较在脑缺血损伤中大。     

γ-氨基丁酸转运体-1与局灶性脑缺血再灌注神经元损伤关系的实验研究

目的探讨γ氨基丁酸转运体1(GAT1)与脑缺血再灌注神经元损伤的关系。方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,分别在脑缺血再灌注3h、6h、12h、24h及3d取损伤侧脑组织进行免疫组化染色,测定标本中GAT1阳性神经元数目和光密度值,并与正常组和假手术组比较。结果脑缺血再灌注3hGAT1表达明显上调(P<0.05),6h达到高峰(P<0.01),12h开始下降,24h后与对照组比较差异无显著性。结论脑缺血再灌注早期GAT1阳性神经元明显增多,其在局灶性脑缺血再灌注中可能参与神经元损伤病理生理过程。     

重组人促红细胞生成素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨重组人促红细胞生成素(EPO)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤所致炎性反应的保护机制。方法采用线拴法制备大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型,应用TTC染色法、干湿重法、常规HE染色法观察EPO治疗前后再灌注24h脑梗死体积、脑组织含水量以及组织学变化,应用RT- PCR方法检测EPO治疗前后再灌注lh、3h、6h、12 h、24h、72 h缺血侧脑皮质IL-1β、TNF-α基因表达的变化。结果与假手术组相比,EPO可显著缩小缺血再灌注24h所致的脑梗死体积(P＜0.01),降低梗死侧脑组织含水量(P＜0.01),减轻病理学变化。缺血再灌注各时相点缺血侧皮层IL -lβ mRNA和TNF -α mRNA表达均显著上调(P＜0.01),12 h达高峰。EPO治疗后lh、3h、6h缺血侧皮层IL - 13 mRNA表达显著下降,与病理组相应时间点相比,分别降低了63％、55％和84％(P＜0.01)。EPO治疗后lh、3h、6h缺血侧皮层TNF -α mRNA表达亦显著下降,与病理组相应时间点相比,分别降低了75％、76％和95％（P＜0.01）。结论EPO可能通过抑制IL - 1β、TNF-α的基因表达,降低缺血再灌注的炎性反应损伤而改善脑组织的结构和功能。     

Expression of interleukin-6 is suppressed by inhibition of voltage-sensitive Na+/Ca2+ channels after cerebral ischemia

Expression of interleukin-6 (IL-6), a neurotrophic cytokine, is up-regulated after cerebral ischemia, but the underlying mechanism of the up-regulation remains unclear. NS-7 is a novel blocker of voltage-sensitive Ca2+ and Na+ channels and is known to reduce cerebral damage by ischemia. The present study was undertaken to examine the association between increases in intracellular Ca2+ concentration induced by membrane depolarization and IL-6 induction. IL-6 expression in rat brain was investigated by immunohistochemistry and Western blot analysis following 3.5-48 h of reperfusion after 1.5 h of occlusion of the middle cerebral artery. NS-7 (1 mg/kg; NS-7 group) or saline (saline group) was injected i.v. 5 min after the start of reperfusion. The saline group showed clear IL-6 expression in various cortical regions, which peaked at 24 h of reperfusion. By contrast, IL-6 expression was significantly suppressed in the NS-7 group throughout the reperfusion period. Microglia activation was also reduced in the NS-7 group. These findings suggest that IL-6 expression may be up-regulated by the increased intracellular Ca2+ concentration triggered by membrane depolarization after cerebral ischemia.     

小鼠局灶性脑缺血再灌注后IL-33及其受体的时程表达

目的检测白细胞介素-33(IL-33)及其膜受体ST2和可溶型受体sST2在小鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时程的表达特征。方法利用线栓法闭塞大脑中动脉(MCAO)30 min诱导建立小鼠可逆性局灶性脑缺血再灌注损伤模型,通过半定量RT-PCR检测脑缺血再灌注后6 h、24 h和3 d缺血脑组织中IL-33及其膜受体ST2、凋亡相关蛋白Caspase-8和Caspase-3的mRNA表达水平,并通过免疫组织化学染色观察了IL-33在不同缺血脑区(运动皮质、感觉皮质、海马和纹状体)的时程表达情况;ELISA法检测了小鼠MCAO模型再灌注后不同时间点血清中IL-33及其可溶型受体sST2的表达水平。结果 IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表达减少,但在24 h无明显改变;凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8在缺血后3个时间点均显著增高,且Caspase-3在6 h和3 d的mRNA表达水平较24 h高;ST2 mRNA在缺血后6 h无减少,但在24 h和3 d有明显减少;除了MCAO 24 h组运动皮质和纹状体阳性染色增加外,IL-33阳性细胞数在缺血后不同时程各脑区均有不同程度减少;缺血后外周血中IL-33的表达量无明显升高或降低,而sST2的表达水平在缺血后6 h即已显著升高。结论脑缺血再灌注后IL-33/ST2信号通路被下调,其与sST2表达增多的效应发挥和神经元凋亡有关。     

重组人促红细胞生成素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤所致NF - κB和IκB表达的影响

目的 探讨NF - κB和IκB在重组人促红细胞生成素(r- HuEPO)对大鼠局灶性脑缺血再灌注炎性反应损伤的保护机制中的作用.方法 采用栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO),应用免疫组化和Western blot分别检测缺血脑组织NF - κB和IκB的表达,IL-1β蛋白含量采用ELISA法确定.结果 与假手术组相比,脑缺血2h再灌注3h后缺血侧皮质IL- 1β含量显著升高至(86.2±25.2)pg/ml(P＜0.05),再灌注24 h IL- 1β含量达高峰(867.2±74.3)pg/ml(P＜0.01),72 h仍处于较高水平(185.5±24.4)pg/ml(P＜0.01).EPO治疗组缺血再灌注3h、6h、12 h(164.1±11.6)pg/ml和24h缺血侧皮质IL- 1β含量显著降低,与病理组相应时间点相比,分别降低了55％、33％、56％和50％(P＜0.01).脑缺血再灌注组各时相点NF - κB p65表达及活化明显增加,为Sham组的4～8倍(P＜0.01),12h表达最高(P＜0.01),是Sham组的13倍.EPO治疗组与病理组相应时相点相比,NF - κB p65表达显著减弱,EPO处理后1、3、6和12 h,NF - κB p65表达较相应的I/R组降低了33％ ～40％(P＜0.01).缺血2h再灌注1h后缺血侧皮质IκBα蛋白水平从248.6±4.2降低至195.3±4.8(P ＜0.01),6h降至最低(134.7±19.9,P＜0.01).EPO治疗组可显著增高缺血再灌注组缺血侧皮质IκBa蛋白水平(P＜0.01),各时相点分别增高了11％、34％、83％、40％、23％和20％.结论 EPO可能通过抑制NF - κB/IκB信号传导通路,减少炎性因子IL-1β的合成和分泌而达到保护脑损伤的作用.     

Folic acid deficiency exacerbates the inflammatory response of astrocytes after ischemia-reperfusion by enhancing the interaction between IL-6 and JAK-1/pSTAT3

Aim

To demonstrate the role of IL-6 and pSTAT3 in the inflammatory response to cerebral ischemia/reperfusion following folic acid deficiency (FD).

Methods

The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established in adult male Sprague-Dawley rats in vivo, and cultured primary astrocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R) to emulate ischemia/reperfusion injury in vitro.

Results

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression significantly increased in astrocytes of the brain cortex in the MCAO group compared to the SHAM group. Nevertheless, FD did not further promote GFAP expression in astrocytes of rat brain tissue after MCAO. This result was further confirmed in the OGD/R cellular model. In addition, FD did not promote the expressions of TNF-α and IL-1β but raised IL-6 (Peak at 12 h after MCAO) and pSTAT3 (Peak at 24 h after MCAO) levels in the affected cortices of MCAO rats. In the in vitro model, the levels of IL-6 and pSTAT3 in astrocytes were significantly reduced by treatment with Filgotinib (JAK-1 inhibitor) but not AG490 (JAK-2 inhibitor). Moreover, the suppression of IL-6 expression reduced FD-induced increases in pSTAT3 and pJAK-1. In turn, inhibited pSTAT3 expression also depressed the FD-mediated increase in IL-6 expression.

Conclusions

FD led to the overproduction of IL-6 and subsequently increased pSTAT3 levels via JAK-1 but not JAK-2, which further promoted increased IL-6 expression, thereby exacerbating the inflammatory response of primary astrocytes.     

沙土鼠脑缺血再灌注诱导线粒体通透性转换和氟桂嗪的影响

目的　进一步探讨盐酸氟桂嗪对缺血再灌注后神经细胞保护作用的机制。方法　制作沙土鼠全脑缺血 /再灌注模型 ,随机分为脑缺血组、氟桂嗪预处理组和对照组 ,分别于术后 1h、6h、1d分离前脑线粒体 ,用分光光度法检测线粒体通透性转换以及线粒体游离Ca2 + 的含量。结果　 (1)前脑线粒体游离Ca2 +浓度在缺血再灌注后 1h、6h、1d均高于氟桂嗪预处理和对照组 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 ) ,以缺血再灌注后 6h最明显 (P <0 .0 1) ;(2 )缺血再灌注后 1h、6h、1d前脑线粒体通透性转换开放程度较对照组和氟桂嗪预处理组均高 (P <0 .0 5 ) ;(3)氟桂嗪预处理组以缺血再灌注后 6h前脑线粒体通透性转换开放程度降低最为显著(P <0 .0 1)。结论　氟桂嗪抑制急性脑缺血再灌注诱导的线粒体通透性转换     

大鼠局灶性缺血再灌注后大脑皮质ADM及其mRNA的表达

目的探讨肾上腺髓质素（ADM）与脑缺血再灌注损伤的关系。方法采用线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，阻断血流2h进行再灌注。应用免疫组织化学法和RT—PCR法检测不同时间段大鼠局灶性脑缺血再灌注后大脑皮质ADM及其mRNA的表达，并进行动态观察。结果正常大鼠大脑皮质有ADM及其mR—NA的表达，假手术组ADM及其mRNA表达略高于正常组，P〉0．05；大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质ADM及其mRNA过表达，与正常对照组及假手术组相比差异显著，P〈0．05。动态观察发现，脑缺血2h再灌注2h，大脑皮质ADM及其mRNA即表达，再灌注22h达高峰，至1w仍明显多于正常对照组，P〈0．05。结论脑缺血再灌注后ADM及其mRNA呈现规律性过表达。     

大鼠脑缺血再灌注模型ICAM-1表达与白细胞浸润关系及亚低温干预治疗的研究

目的　研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时程脑组织中的细胞间粘附分子 1 (ICAM 1 )表达规律 ,及其与白细胞浸润的关系 ,并探讨亚低温的治疗作用。方法　采用大鼠大脑中动脉 (MCA)线拴闭塞 /再通法建立大鼠局灶性脑缺血 再灌注模型 ,常温组分别于脑缺血 3小时再灌注 2小时、8小时、2 4小时、48小时、72小时后断头取脑 ;假手术组及亚低温组于脑缺血 3小时再灌注 2 4小时断头取脑 ,行ICAM 1免疫组化及组织HE染色 ,测定ICAM 1表达阳性微血管数及白细胞计数。结果　⑴脑缺血再灌注后 2小时 ,脑缺血的坏死周边区的微血管内皮细胞表达ICAM 1出现增高趋势 ,并于 2 4小时达到高峰 ,各组之间及各组与假手术组间均有显著差异 (均P <0 0 5) ;⑵脑缺血再灌注 8小时出现白细胞浸润 ,且浸润高峰也在 2 4小时 (P <0 0 1 ) ;⑶ICAM 1的表达与白细胞浸润呈正相关 (r =0 .82 7,P <0 0 1 ) ;⑷缺血早期进行亚低温治疗能明显减轻缺血再灌注后ICAM 1的表达及减少白细胞浸润 (P <0 0 1 )。结论　脑缺血再灌注后ICAM 1可介导白细胞和内皮细胞的粘附 ,加速白细胞的浸润 ,提示ICAM 1是造成脑缺血损伤的重要因素之一 ;亚低温的干预治疗能明显减轻缺血再灌注后脑组织病理形态学的损害程度。     

Ontogeny and the effects of in utero brain ischemia on interleukin-1β and interleukin-6 protein expression in ovine cerebral cortex and white matter

Interleukin (IL)-1β and IL-6 have been implicated in brain development, injury progression, and fetal/maternal immune interactions. We examined IL-1β and IL-6 protein expression in cerebral cortex (CC) and white matter (WM) from non-ischemic ovine fetuses at 87–90, 122–127, and 135–137 days of gestation, pregnant ewes at 87–90 and 135–137 days of gestation, and fetuses exposed to 48 or 72 h of reperfusion after ischemia. Protein expression was determined by Western immunoblot. In non-ischemic CC, IL-1β was higher (P < 0.05) in adult sheep and fetuses at 135–137 than 87–90 and 122–127 days, and IL-6 higher at 122–127 than 87–90 days, and in adults than fetuses at 87–90, 122–127, and 135–137 days of gestation. In non-ischemic fetal WM, IL-6 was higher at 135–137 than 87–90 days, but IL-1β did not differ. In CC, IL-1β was higher in ewes at 135–137 than 87–90 days and IL-6 at 135–137 days and in non-pregnant adults than ewes at 87–90 days of gestation. In WM, IL-1β was higher in ewes at 135–137 than 87–90 days of gestation, but IL-6 did not differ. Forty-eight and 72 h after ischemia, CC IL-1β was higher than in non-ischemic fetuses. Seventy-two hours after ischemia, IL-1β and IL-6 were higher in WM than CC. In conclusion, IL-1β and IL-6 exhibit developmental regulation in fetal brain, change during gestation in brains of pregnant ewes, show regional differences in normal brains of fetuses and ewes, demonstrate differential responses after ischemia in CC and WM, and IL-1β but not IL-6 increases after ischemia in CC.