前列腺特异性启动子rPB的改造及其载体质粒的构建和活性测定

目的构建一个前列腺特异性的、可启动针对雄激素非依赖性前列腺癌的基因治疗的改良启动子并测定其活性.方法选择前列腺特异性启动子rPB,通过两次PCR对其进行改造,用维甲酸反应元件(RARE)替代雄激素反应元件(ARE)或直接插入RARE,构建成为不同拷贝条件的rPB-DR,并与质粒连接.转染细胞后,进行荧光素酶活性测定.结果通过电泳鉴定及基因测序,证实构建成功.结论根据实验设计,构建出的rPB-DR应具有在维甲酸的调控下,针对雄激素非依赖性前列腺癌特异性启动基因治疗的功能,现构建成功不同拷贝条件的rPB-DR,证实实验设计构想,同时通过活性测定比较各种拷贝条件的rPB-DR启动子活性的优劣,为下一步与治疗基因的连接及功能测定奠定基础.     

前列腺特异启动子驱动的自杀基因对雄激素非依赖前列腺癌的杀伤作用

目的 将前列腺特异性启动子驱动的自杀基因导入到雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostale Cancer,ALPC)细胞,观察其对AIPC细胞的杀伤作用.方法 将rPB-DR(6)启动子驱动的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因融合分子插入到逆转录病毒载体pLNCX,构建pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PA317包装,获得重组逆转录病毒,后者感染前列腺癌细胞PC-3,获得CA18抗性细胞PC-3CD.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶,观察其对PC-3CD的杀伤作用.结果 经酶切和测序证实成功构建了pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PCR证实在PC-3CD基因组DNA中扩增出了CD基因,RT-PCR证实PC-3CD有CD mRNA表达.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶后,PC-3CD细胞大量死亡,生长显著被抑制.结论 前列腺特异性启动子驱动的自杀基因可杀伤雄激素非依赖性前列腺癌细胞,并显著抑制其生长.     

雄激素及其受体对maspin启动子的抑制作用

目的：检测雄激素及其受体对maspin基因启动子的作用。方法：构建含maspin基因5侧启动子区846(-759， 87)bpDNA的荧光素酶报告基因表达载体pGL3-mP，然后与雄激素受体表达载体(hAR)共转染雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC-3M，用或不用雄激素处理细胞，48h后应用双荧光素酶测定系统，检测荧光素酶的表达活性。结果：hAR可抑制maspin启动子的表达活性，其抑制作用是雄激素配体非依赖性的。结论：maspin启动子区可能含有与雄激素受体结合的负性调控元件。     

maspin基因启动区的初步鉴定

目的：研究maspin基因表达的调控机制。方法：利用PCR技术扩增maspin基因5’上游启动区860bp(-765～ 95bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin—LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性：并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用。结果：maspin基因启动区(-312～247bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在( 14～95bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件一结论：maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节。     

人同源盒基因NKX3.1内含子及5′上游10 kb调控区功能的初步分析

目的 检测人同源盒NKX3.1基因内含子及5'上游10 kb调控区对启动子活性的影响,分析其雄激素反应性和组织特异性,为进一步研究该基因表达调控机制奠定基础.方法 利用基因重组技术分别构建5'上游10 kb调控区/内含子-NKX3.1基本启动子-荧光素酶报告基因质粒.转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP后,检测荧光素酶表达活性,观察内含子及5'上游调控区对NKX3.1启动子活性的影响;加入雄激素类似物R1881刺激,进一步检测其雄激素反应性;通过转染不同细胞分析其组织特异性.结果 荧光素酶报告基因分析表明,NKX3.1基因5'上游-7 681 ～-6 483 bp可以增强其启动子活性2.6倍,但该增强作用并不具有组织特异性.内含子及5'上游10 kb其他区域对NKX3.1启动子活性未见明显的增强作用.R1881刺激并不能使内含子及5'上游10 kb调控区活性明显增强.结论 NKX3.1基因内含子及5 '上游10kb调控区不具备雄激素反应性,5'上游-7 681 ～-6483bp可以增强NKX3.1启动子活性,但其组织特异性增强元件并不存在于该片段.     

雄激素受体在雄激素非依赖性前列腺癌中的作用

前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤之一,绝大多数前列腺癌依赖雄激素的刺激,雄激素的作用通过雄激素受体(androgen receptor,AR)介导[1].晚期前列腺癌的治疗通常是通过手术或药物去势去除睾丸产生的雄激素,并使用AR拮抗剂(称为最大雄激素阻断疗法).雄激素去势治疗后复发的前列腺癌(被称为雄激素非依赖性前列腺癌)只有一小部分对再次激素治疗有反应,且这种反应通常很微弱,持续时间短.尽管如此,绝大多数雄激素非依赖性前列腺癌表达AR,AR呈现出转录活性且可能是肿瘤细胞生长所必需的[2].因此,尽管这些肿瘤在临床上表现为雄激素非依赖性,但是它们似乎保留了雄激素受体依赖性.现将对雄激素非依赖性前列腺癌中雄激素受体的作用及其机制进行综述.     

survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定

目的克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro,克隆入pGL3-Basic,分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro,脂质体转染前列腺癌细胞和Changliver肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,其中S2pro活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的三分之一。结论survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌雄激素受体表达水平的变化

目的:从雄激素受体表达水平变化的角度,探讨雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌转化的可能机理。方法:体外培养雄激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP细胞)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞株(PC-3细胞),应用流式细胞术测定两种细胞株在生理盐水和二氢睾酮(DHT)作用下雄激素受体(AR)的表达水平。结果:两种细胞株均有AR表达,两种条件下AR的表达水平分别为:LNCaP细胞生理盐水处理组85.99±4.97,DHT处理组93.74±3.63;PC-3细胞生理盐水处理组8.52±1.57,DHT处理组9.52±1.75,两种条件下LNCaP细胞的AR表达水平均高于相应条件下PC-3细胞的AR表达水平,两者有显著性差异(P<0.05)。DHT作用下LNCaP细胞的AR表达水平显著高于生理盐水作用下LNCaP细胞的AR表达水平(P<0.05);DHT作用下PC-3细胞的AR表达水平与生理盐水作用下PC-3细胞的AR表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:雄激素依赖性前列腺癌细胞过表达AR,并且二氢睾酮能促进其表达AR;雄激素非依赖性前列腺癌细胞AR表达较少,二氢睾酮对其AR表达无明显作用,雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌转化可能与前列腺癌雄激素受体表达水平下降有关。     

雄激素非依赖性前列腺癌的发生研究进展

前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。前列腺癌是一种雄激素依赖性恶性肿瘤,经抗雄激素治疗后部分患者病情好转,但部分患者在治疗12～18个月后逐渐对抗雄激素治疗失去反应,逐步发展为雄激素非依赖性前列腺癌。因此,揭示其发生机制是预防和治疗雄激素非依赖性前列腺癌的关键。近年来,对雄激素非依赖性前列腺癌的发生机制有了许多新的认识和进展。     

小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰的树突细胞诱发特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究

目的：研究小鼠结肠癌细胞CT-26RNA体外转染mIL-12基因修饰的树突细胞（DC），观察其诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能力。方法：小鼠骨髓细胞体外经rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养获取DC，流式细胞仪检测其纯度；293细胞扩增携带mIL-12基因的重组腺病毒，体外转染DC；Trizol法提取CT-26细胞总RNA，应用TransMessenger体外转染mIL-12基因修饰的DC；ELISA法检测细胞上清及小鼠血液中mIL-12，LDH释放法检测小鼠体内特异性CTL活性。结果：小鼠骨髓细胞经诱导培养后，获得大量高纯度的DC，流式细胞仪检测CD11c^＋的DC〉90％；携带mIL-12基因重组腺病毒转染的DC细胞高表达mIL-12；CT-26细胞总RNA体外转染mIL-12基因修饰的DC后，回输小鼠，能明显提高小鼠体内mIL-12的水平，并可诱导体内生成较高水平的CTL活性，而以该RNA转染Ad-LacZ修饰DC后的对照组及RNA转染DC的对照组，可诱导机体生成中等水平的特异性CTL活性，DC、PBS对照组则均无此作用。结论：小鼠肠癌CT-26细胞总RNA转染mIL-12基因修饰的DC后，免疫接种小鼠，可提高小鼠体内mIL-12的水平，并能有效诱导机体产生较高水平的特异性CTL活性。     

应用唑来膦酸联合最大限度雄激素阻断治疗前列腺癌骨转移

目的探讨唑来膦酸联合最大限度雄激素阻断治疗对晚期前列腺癌骨转移疼痛的治疗价值。方法分析30例因骨转移导致骨痛的晚期前列腺癌患者,应用唑来膦酸同时给予最大限度雄激素阻断治疗,观察治疗后止痛效果、生活质量、骨转移灶变化及不良反应。结果与治疗前相比止痛效果、生活质量及骨转移灶变化均有明显好转,治疗中未发现严重不良反应。结论唑来膦酸联合最大限度雄激素阻断治疗是缓解晚期前列腺癌骨转移的有效手段。     

Myc—Max作用序列启动在c—myc过表达细胞中的特异启动活性

目的 探讨由Ｍｙｃ－Ｍａｘ二聚体作用序列替代单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）胸腺嘧啶（ＴＫ）核苷激酶启动子第３区后，形成的嵌合结构在ｃ－ｍｙｃ过表达细胞中的特异启动活性。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物克隆一系列亚克隆技术，构建由Ｍｙｃ－Ｍａｘ作用序列与ＨＳＶ－ＴＫ启动子部分区域组成的嵌合启动子，将荧光素酶报告基因置于其控制之下，构建成荧光酶表达质粒，瞬时转染已经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证实的ｃ－ｍｙ     

胃癌形成过程中端粒酶反转录酶基因表达及启动子甲基化状态分析

目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组织样本中hTERT基因表达的阳性率;用亚硫酸氢盐修饰上述各组标本DNA,然后检测修饰后的hTERT序列:启动子区CpG位点,未发生甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U);在启动子区不含CpG位点的位置,进行引物设计,然后利用PCR进行扩增。扩增产物序列与原序列比对,观察启动子区甲基化情况。结果 hTERT基因在胃癌组表达的阳性率最高,在癌前病变组表达的阳性率明显降低,而在正常胃黏膜组中不表达,3组组织样本hTERT表达阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。hTERT启动子区甲基化程度在胃癌组中最高,在胃癌前病变组中明显降低,而在正常胃黏膜中甲基化程度最低,3组组织样本hTERT启动子区甲基化程度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERT启动子区甲基化程度在正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌中依次升高,故hTERT启动子区甲基化程度的变化可作为胃癌形成过程中肿瘤早期诊断的潜在分子生物学标志。     

反向前列腺特异性膜抗原增强子启动子调控重组质粒的构建及增强子调控活性的比较

目的 探讨前列腺特异性膜抗原（PSMA）启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,了解增强子增强转录效率的能力。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA增强子序列．将其按不同方向亚克隆到含有报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒载体pEGFP—PSMAPPro脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在所转染的细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP—PSMAE-P和pEGFP-PSMAE（r）-P,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的特异有效表达,增强子序列能使基因转录效率提高30倍,不同方向的增强子序列在增强转录效率方面具有同样效应。结论 反向PSMA增强子启动子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性,增强子具有增强启动子转录效率的功能且没有方向性。     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

特异点突变型p53 minigene对人肺癌PG细胞的转染效应

目的 观察一种编码密码子１７２＾Ａｒｇ→Ｌｅｕ的特异点突变型小鼠ｐ５３ ｍｉｎｉｇｅｎｅ对恶性肿瘤细胞的转染效应,并探讨该基因恶性肿瘤基因治疗中的潜在价值。