日本血吸虫二价DNA疫苗的免疫保护效果研究

目的观察本课题组所构建日本血吸虫大陆株二价DNA疫苗VR101 2-SjGST-Sj31和VR1012-SjGST-Sj32的免疫保护效果.方法用纯化质粒免疫昆明鼠:60只小鼠分为5组,2个对照组的小鼠分别于股四头肌注射生理盐水100μl或空质粒VR1012 100μg,3个实验组的小鼠则同法分别注射VR1012-SjGST、VR1012-SjGST-Sj31和VR1012-SjGST-Sj32各100μg,每隔3周免疫1次,共免疫3次,以间接免疫荧光法观察VR1012-SjGST-Sj31、VR1012-SjGST-Sj32在肌肉组织中的表达后,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,45 d后剖杀计数各小鼠成虫数及肝卵数,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与生理盐水组比较,3个实验组的减虫率分别为33.90%、33.90%及27.14%(P＜0.01),减卵率分别为61.86%、74.88%及68.87%(均为P＜0.01),每雌肝减卵率分别为44.67%、59.40%、54.32%(P＜0.01).与VR1 012-SjGST组相比,VR1012-SjGST-Sj31和VR1012-SjGST-Sj32组的减卵率分别为34.19%(P＜0.01)、1 8.51%(P＜0.01),每雌肝减卵率为26.62%、17.46%(P＜0.01).结论DNA疫苗VR101 2-SjGST-Sj31和VR1012-SjGST-Sj32能在组织中正常表达,能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,二价疫苗的抗生殖免疫效果要大于单价疫苗.     

日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用.方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNA pcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异.多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均＜0.05).结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答.     

不同方式构建的日本血吸虫双价DNA疫苗保护力的比较

目的寻求高效抗血吸虫感染的双价核酸疫苗。方法以共表达和融合表达两种方式构建两种日本血吸虫双价核酸疫苗pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP,以鸡尾酒式混合获得混合双价疫苗(pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP与pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP)。大量制备质粒,50只BALB/c小鼠随机分为5组:混合疫苗组、双价共表达疫苗pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP组、双价融合表达疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP组、空质粒对照组及生理盐水对照组。免疫后4周攻击感染,感染后45天剖杀,计数各组小鼠成虫数、肝虫卵数和免疫保力超过50%实验组的虫卵肉芽肿面积。结果与对照组比较,实验组小鼠成虫数、虫卯数和虫卵肉芽肿面积有显著性差异(P<0.05);融合表达组和共表达组无显著性差异(P>0.05);混合DNA疫苗组免疫保护力优于单一双价组;与混合DNA疫苗组比较,pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP组的肝脏肉芽肿面积有显著性减小(P<0.05)。结论血吸虫混合双价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单一双价DNA疫苗。     

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA：pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗，重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB／c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组，每组14只。A组为自然感染组；B组（空质粒对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1；C组（空质粒＋混合蛋白对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μl福氏完全佐剂（FCA）；D组（混合DNA组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗；E组（混合DNA＋混合蛋白组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周，蛋白加强组末次免疫后2周，所有小鼠同时经腹部皮肤感染（40±1）条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠，计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血，分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a，并取小鼠脾脏制备单个脾细胞，检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17．70％、32．88％和45．35％，D组和E组的减虫率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率显著高于D组（P〈0．01）；C、D组和E组的减卵率分别为9．39％、36．20％和48．54％，D组和E组的减卵率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率也显著高于D组（P〈0．05）。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，?     

日本血吸虫Sj32DNA疫苗免疫效果的观察

目的：探讨血吸虫Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗抗血吸虫感染的免疫效果。方法：采用ＰＣＲ技术,人工合成引物,以重组ＤＮＡｐＳｊ３２为模板,扩增出编码３２ｋＤａ天冬酰胺肽链酶,即Ｓｊ３２全长ｃＤＮＡ和引入了起始密码子终止密码子的部分ｃＤＮＡ片段,将其分别克隆到ｐＫＢ－ＣＭＶ,构建真核表达载体ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１和ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２。采用脂质体介导的基因转移将两种重组ＤＮＡ导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,间接免疫荧光法证实Ｓｊ３２在真核细胞中表达。小批量制备纯化ＤＮＡ,进行动物免疫试验。将两种构建的真核表达载体分别直接ｉｍＢＡＬＢ／ｃ小鼠,共免疫３次,攻击感染后６ｗｋ剖杀小鼠。收集血清,ＥＬＩＳＡ法检测抗体水平,并计数成虫负荷及肝组织虫卵数。结果：ｐＢＫ－Ｓｊ３２－１组与ｐＢＫ－Ｓｊ３２－２组免疫小鼠后的减虫率分别为３８．６％和３０．９％,肝组织减卵率分别为５５．７％和５５．２％,与对照组比较,其间差别均具有极显著性意义（Ｐ＜０．０１）。各ＤＮＡ疫苗免疫组能诱导一定水平的抗血吸虫抗体。结论：Ｓｊ３２ＤＮＡ疫苗可诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫力,有可能作为血吸虫疫苗候选抗原分子。     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

日本血吸虫DNA疫苗的构建

血吸虫病是一种严重危害人类及家畜的寄生虫病 ,据ＷＨＯ估计患病人数达 2亿 ,每年死亡人数约 2 0万。血吸虫疫苗虽然种类较多 ,但由于保护性免疫力较差 ,至今未能实际应用。ＤＮＡ疫苗是新近发展起来的一种新型疫苗 ,由于它自身的特点使其在抗寄生虫感染中意义重大 ,与其它疫苗相比 ,ＤＮＡ疫苗简单方便易于组建多价疫苗[1] 。另外考虑到某种单一组分的保护性抗原对血吸虫宿主体内不同虫期很难产生完全的保护性免疫力。本研究期望组构含有多种抗原的ＤＮＡ疫苗 ,免疫小鼠后检测其产生抗体的水平。1　材料与方法1.1　重组质粒　　质粒 ｐＣ…     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

日本血吸虫DNA疫苗的研究进展

血吸虫病是严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病,疫苗是预防控制血吸虫病的重要手段。该文概述了日本血吸虫DNA疫苗的优点、候选抗原、联合免疫、免疫机制及DNA疫苗存在的问题和展望。     

日本血吸虫SjCTPI和SjC23 DNA疫苗联合免疫保护作用的研究

目的　探索 Sj CTPI和 Sj C2 3DNA疫苗联合应用保护性免疫的协同作用。方法　大量制备 pc DNA3.1- Sj CTPI和 pc DNA3.1- Sj C2 3的质粒 DNA。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为 4个组 (A、B、C、D组 )每组 12只。 A组每鼠经双侧股四头肌注射 10 0 μg pc DNA3.1的质粒 DNA,为对照组 ;B组为Sj C2 3组 ,每鼠肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;C组为 Sj CTPI组 ,每鼠肌注 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI的质粒 DNA;D组为联合免疫组 ,每组肌注 10 0μg pc DNA3.1- Sj C2 3和 10 0μgpc DNA3.1- Sj CTPI质粒 DNA的混和物。分别于 0、14、2 8d免疫 3次。末次免疫后 30 d,每鼠经腹部皮肤攻击感染 (45± 2 )条日本血吸虫尾蚴。攻击后 4 5 d,剖杀所有小鼠 ,灌冲 ,收集成虫并计数。每鼠肝脏称重后剪碎 ,置 5 % KOH中消化 ,并计数虫卵数。比较各组间的减虫率和减卵率。结果　与对照组相比 ,Sj C2 3组、Sj CTPI及联合组的减虫率分别为 2 8.1%、2 9.1%和 4 1.5 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,而联合组则又显著地高于单独 Sj C2 3组及单独 Sj CTPI组 (P均 <0 .0 5 )。三组的减卵率分别为 37.9%、4 4 .2 %和 6 1.4 % ,均非常显著地高于对照组 (P分别为 <0 .0 1,<0 .0 1,<0 .0 0 1) ,但     

日本血吸虫多价分子疫苗的保护性免疫力研究

本实验将从日本血吸虫成虫分离纯化出的２８ｋＤａ、３１／３２ｋＤａ及９７ｋＤａ蛋白混合组成多价分子疫苗免疫小鼠,再行攻击感染,观察其保护性免疫力。结果：疫苗加佐剂组成虫减虫率、肝组织减卵率及肠壁组织减卵率分别为５０．３％、７２．０％和８１．５％,均显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）;实验组肝虫卵肉芽肿较对照组炎症反应程度轻,虫卵肉芽肿周长及面积均低于对照组（Ｐ＜０．０１）。结果提示,由日本血吸虫成虫２８ｋＤａ、３１／３２ｋＤａ及９７ｋＤａ蛋白联合组成的多价分子疫苗,具有较高的减虫率、减卵率及抑制虫卵肉芽肿形成的作用,有一定的应用前景     

中国大陆日本血吸虫品系的研究——Ⅻ.五地隔离群血吸虫DNA杂交

以pSM889为探针,对分布于中国大陆安徽、湖北、广西、云南、四川5地日本血吸虫自然隔离群的雄虫DNA进行了杂交,分析其长度多态性差异。经限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切的杂交图谱分析,结果表明其强杂交带虽相同,但在EcoRI酶切的杂交图谱中,分子量分别在4.4-9.6kb和2.3-4.4kb的上述5地隔离群的弱杂交带上却呈现明显的差别。这表明5地自然隔离群日本血吸虫的DNA结构发生了某些变异,此结果进一步为中国大陆境内日本血吸虫存在品系差别提供了分子生物学的依据。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗抗生殖免疫的研究

目的 探讨日本血吸虫组织蛋白酶ＢＤＮＡ疫苗的保护。方法 分别用Ｓｊ３１ＢＩＮ免疫昆明鼠和ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,攻击感染后６Ｗ计数成虫负荷及粪便和组织内虫卵数结果 用构建的ｊ３１ＢＩＮ免疫小鼠成虫发育,肝组织减卵率为５９．３￣６５．０％,肠组织减卵率为５７．６￣６２．１％,粪便减卵率为８６．５％。结论Ｓｊ３１ＢＩＮ可诱导小鼠产生抑制雌虫生殖的免疫力。     

日本血吸虫成虫核糖核酸提取方法的研究

本文应用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从日本血吸虫成虫提取核糖核酸(RNA),并与胍盐/热酚法、胍盐/氯化铯超速离心法的提取结果进行比较。3种方法所分离的RNA,在纯度及完整性上均较满意,但其得率以异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法为高,此法简单易行,既经济又省时,对来源不易的少量组织,尤为相宜。     

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的　研究从噬菌体 12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。　方法　以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)作为靶分子 ,筛选噬菌体 12肽库。经过 3轮吸附 -洗脱 -扩增的淘筛过程 ,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取 42个扩增 ,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清 ,以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠 ,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检 ,计算减虫率和减卵率 ,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。　结果　在挑取的 42个阳性克隆中 ,有 9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合 (6.2 5 %～ 10 0 % )。除其中 1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外 ,其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了 2 9.3 %减虫率和 3 5 .9%减卵率。　结论　从噬菌体 12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性 ,并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。     

C-6膜粘附水中日本血吸虫尾蚴技术的研究

在实验室和现场水面,应用C-6膜多点抽样粘取方法检测水中尾蚴。获蚴率达40％,高于现用的尼龙绢条粘取沉淀法约20倍,在现场用现有方法未查获尾蚴的水面,调查钉螺阳性率为零或灭螺后的水面,本法可在一些环境查获尾蚴。本法操作简便,当天可有检测结果,费用仅约为哨鼠法的1％,利于广泛应用。     

日本血吸虫经胎盘传播的实验研究

目的 实验观察日本血吸虫的胎盘传播。方法 以家兔为动物模型，对母兔怀孕中期（器官发生期）和晚期（胎儿发育期），人工感染不同量的日本血吸虫尾蚴，观察仔兔日本血吸虫感染情况，同时对仔兔断阴后进行攻击性感染。结果 母兔 际中期和晚期人工感染300条尾，母免经胎传播率分别为75．0％和100．0％，仔兔经胎感染率分别为13．5％和46．7％。母兔怀孕晚期分别人工感染300、500、700条尾蚴，母兔经胎传播率均为100．0％，仔兔感染率分别为46．7％、61．9％、79．0％。仔兔感染强度分别为1－3、1－3条及2－14条血吸虫。新产仔兔断阴后攻击性感染20条尾蚴，实验组和对照组仔兔虫体回收差异无显著性（P＞0．05）。结论 仔兔日本血吸虫经胎盘感染率和感染强度与母兔怀孕不同时期，胚胎发育不同程度，尾蚴感染剂量等众多因素有关；仔兔经胎感染后，机体可能无保护性免疫作用。     

日本血吸虫副肌球蛋白小鼠免疫试验

应用生物化学方法从日本血吸虫成虫中提取虫体副肌球蛋白,并把它结合佐剂FCA/FIA或BCG免疫两批BALB/c小鼠,获得了32.18%—48.52%的减虫率,但统计学上大都无显著差异.两次实验结果还表明,应用虫体副肌球蛋白结合FCA/FIA进行肌肉注射,和应用等量抗原结合BCG皮内注射免疫的BALB/c小鼠,获得的减虫率相当.