通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

复合检测5种重要发热病原悬浮芯片筛查方法的建立

目的建立同时检测甲型流感病毒、人禽流感病毒、鼠疫耶尔森菌、SARS冠状病毒、结核分枝杆菌5种发热病原抗体蛋白悬浮芯片方法。方法分别用各病原体的诊断抗原耦联不同编码的微球作为反应载体,采用间接反应模式,建立蛋白悬浮芯片方法检测引起发热体征的5种病原的特异性抗体,在同一反应体系中对人血清中的流感、禽流感、鼠疫、SARS、肺结核等特异性抗体进行复合检测。结果建立的蛋白悬浮芯片5种病原抗体快速筛查系统具有较高的特异性和敏感性,同时检测鼠抗流感NPIgG、兔抗禽流感H5N1IgG、兔抗鼠疫F1IgG、兔抗SARSNIgG、兔抗结核分枝杆菌IgG的检测灵敏度分别为968.80ng/ml、69.40ng/ml、6.30ng/ml、15.50ng/ml、1.60ng/ml。结论重要发热病原悬浮芯片快速筛查系统能快速、敏感、特异、同时检测人血清中的5种病原抗体,对口岸出入境人员是否携带病原的快速筛查具有广阔的应用前景。     

烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立

目的 建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法.方法设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法.结果构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100％检出,对常见杆菌检测均为阴性.结论多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值.     

基于微流控纸芯片的病原体检测方法研究进展

正病原体的快速检测和准确鉴定在临床实验室检测、食品工业和环境监测方面至关重要,现有的细菌培养、核酸扩增和酶联免疫等病原体诊断方法或耗时费力,或需要复杂的仪器设备,不适合现场即时检测,因此,目前亟需一种快速有效检测病原体的新方法。微流控纸芯片逐渐成为检测病原体感染的新工具,纸基微流控芯片(paper-based microfluidics)或     

微流体芯片技术检测食源性致病菌的应用研究

[目的]通过应用微流体芯片(lab-on-chip)技术检测食源性致病菌,包括霍乱弧菌、沙门菌、副溶血性弧菌、志贺菌等细菌的灵敏度和精确度,从而建立突发公共卫生事件现场实验室的解决方案。[方法]分别采用Lab-on-chip平台食源性病原体微流检测芯片和荧光PCR方法对食源性病原菌样本进行检测,对比分析食源性微流芯片检测方法的特异性、敏感度、准确性和重复性。根据Lab-on-chip说明书以及荧光定量PCP试剂盒操作说明进行操作。[结果]Lab-on-chip方法的霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌检出限为5×103~103DNA Copies/mL。特异性、准确性和重复性都获得了良好的结果。[结论]Lab-on-chip方法具有快速、便捷、高效、准确等优点,可以在突发公共卫生事件中作为良好的检测工具和方法。     

悬浮芯片定量检测鼠疫菌的方法研究

目的利用编码微球悬浮芯片技术,探讨直接从"白色粉末"样品中检测鼠疫菌的可行性,为建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种生物恐怖因子的技术平台奠定基础。方法用抗体包被编码微球作为反应载体,双抗体夹心法为反应模式,建立鼠疫菌F1抗原悬浮芯片检测方法,对"白色粉末"中的鼠疫耶尔森菌进行检测。通过盲样和标准实验室检测评估对现场样品的适用性。结果建立的定量检测鼠疫菌F1抗原的悬浮芯片方法具有较高的特异性和敏感性,并在0.154～4514ng/ml浓度范围内具有良好的动力学响应特性,比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。结论定量检测鼠疫菌的悬浮芯片方法能快速、敏感、特异地定量检测"白色粉末"中鼠疫菌,在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

PCR检测沙门菌hilA基因的方法研究

目的:利用PCR技术,建立特异性引物PCR快速检测沙门菌的方法。方法:设计沙门菌h ilA基因的特异性引物,优化PCR反应条件,对沙门菌和非沙门菌进行特异性引物的PCR扩增,鉴定沙门菌。结果:所检测沙门菌株和模拟样品均出现特异性扩增条带,结果与实际相符。结论:该方法具有简单、迅速、特异性好和敏感性高的特点。     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

LAMP微流控芯片快速检测三种食源性致病菌

建立一种结合环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和微流控芯片技术检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌三种食源性致病菌的方法,实现对3种致病菌的快速检测。通过比对选取3种致病菌特异性基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(hlyA)基因、大肠杆菌O157脂多糖编码(rfbE)基因、金黄色葡萄球菌耐药基因FemA基因作为目的基因,设计LAMP引物,通过实时LAMP筛选合格引物。设计微流控芯片,将引物冻干后固化到芯片上,制成LAMP微流控芯片。选择合适的LAMP反应体系,添加显色剂,加入芯片中,反应结果通过肉眼或仪器判读。使用标准菌株检验芯片的特异性与敏感性,并使用人工污染样品进一步检验其在实际样品检测时的敏感性。结果表明:制成的LAMP微流控芯片具有较好的特异性,3种致病菌的检测敏感性均可达到100 cfu/ml,可用于食源性致病菌的现场快速检测。     

交叉引物恒温扩增技术结合核酸试纸条检测沙门菌方法的建立

目的 建立一种快速检测沙门菌的交叉引物恒温扩增技术(CPA)-核酸试纸条法。方法 收集不同来源的15株沙门菌和非沙门菌,作为实验用菌株,使用加热煮沸法提取细菌DNA核酸;对CPA方法进行敏感性和特异性研究,并与沙门菌荧光定量PCR法进行比较与评价。结果 特异性试验结果显示,本研究建立的CPA-核酸试纸条法对15种沙门菌的检测阳性率达100%,对15株非沙门菌检测结果全部为阴性。灵敏性试验结果显示,对沙门菌的纯菌液灵敏度检测极限为1.6 cfu/ml,模拟样本的检测限达到160 cfu/g,与荧光定量PCR法一致。结论 该方法检测沙门菌具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于沙门菌快速检测。     

沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法.方法:在65℃普通恒温水浴中、60 min扩增沙门菌invA基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌.分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测.结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致.结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用.     

沙门菌属stn基因LAMP快速检测方法的建立及应用

目的本研究以沙门菌属肠毒素基因(stn)为靶基因,运用环介导恒温扩增技术(LAMP),建立LAMP快速检测方法。方法对沙门菌属stn基因的6个特征区域设计4条引物,利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成,使目的基因高效扩增;对LAMP反应体系和反应条件进行优化,用沙门菌标准株和非沙门菌标准株检测方法的特异性和敏感性。与显色培养基法同时检测肉、蛋、奶、等样品共计100份,检测方法的实用性。结果以沙门菌属stn基因为靶基因建立的LAMP快速检测方法,沙门菌株阳性检出率100%,非沙门菌株检测均为阴性。100份检验样品检测结果与显色培养基检测结果对比,一致率100%。结论沙门菌属stn基因LAMP检测技术敏感性、特异性高,简便快速,是一种适合口岸及基层检验、检疫部门使用的沙门菌快速检测方法。     

沙门菌tHDA等温扩增检测方法的建立

目的建立基于依赖耐热解旋酶核酸等温扩增(t HDA)的沙门菌快速检测方法。方法从Gen Bank数据库下载沙门菌侵袭蛋白A(inv A)基因,比对确定保守区并设计t HDA引物,并对引物浓度、硫酸镁以及氯化钠浓度等反应条件进行优化。同时评价方法的特异性和灵敏度,并检测模拟样本和真实样本以验证方法的可靠性。结果建立的沙门菌t HDA检测体系经过优化,结果显示仅沙门菌菌株呈现特异性电泳条带,而志贺菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、霍乱弧菌等其他5种肠道细菌均为阴性,特异性好;t HDA法检测沙门菌纯培养物的灵敏度为19cfu/μl,检测模拟样本的灵敏度为260 cfu/μl。采用t HDA方法检测18份真实样本,共检出9份沙门菌阳性,与国标法检测结果一致。结论沙门菌t HDA检测方法快速、灵敏、特异,在食源性疾病检测及监测中具有重要的技术优势。     

鼠疫菌免疫胶体金快速检测方法的建立

目的利用免疫胶体金技术建立一种简便、快速并适用于基层人员使用的鼠疫菌抗原检测方法。方法将抗鼠疫菌F1抗原的抗体致敏硝酸纤维素膜,用于捕获鼠疫抗原,然后用免疫胶体金颗粒进行标记。结果应用鼠疫菌免疫胶体金快速检测法最低可检出不同鼠疫菌(EV和Evp株)1.56×105CFU/ml,检测鼠疫菌F1抗原最低可检出1ng/ml,与鼠疫反向间接血凝法的检测结果一致;并且不与假结核小肠结肠炎等耶尔森菌以及其他相关细菌发生交叉反应。结论鼠疫菌免疫胶体金快速检测法具有较好的特异性、敏感性和简便快速的特点。     

2种免疫层析技术用于4种传染病及其病原体检测的研究

[目的]寻求能够快速定性,定量检测4种传染病及其病原体的试验方法。[方法]应用双抗体夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测炭疽杆菌芽孢(以下简称炭疽芽孢)、鼠疫杆菌、肠出血性大肠埃希菌O_(157)：H_7(以下简称EHEC O_(157)),评价方法的灵敏性、特异性。通过分别检测模拟掺入3种菌/芽孢的“白色粉末”和检测3种细菌的强毒株,评价在实际环境样品检测中的应用。应用双抗原夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测鼠疫F1抗体、SARS病毒抗体,检测239份青海鼠疫疫区人员血清、1236份新疆鼠疫疫源地鼠血清,检测18份恢复期SARS病人血清和9份健康对照者血清,以及206份出入境健康人员血清,考核2种检测抗体的方法在实际样品检测中的应用。通过比较炭疽杆菌、鼠疫杆菌、大肠埃希菌O_(157)以及鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的胶体金免疫层析方法、UCP免疫层析方法,比较我们建立的2套系统与加拿大RAMP系统检测炭疽杆菌的能力。[结果]UCP免疫层析方法能在35min内完成检测,炭疽芽孢检测掺入“白色粉末”的样品灵敏性为1×10~4cfu/ test,炭疽芽孢最低检测限为1×10~5cfu/ml(原溶液芽孢浓度),多种不同的芽孢菌及其它细菌共38种54株检测说明该法特异性良好,仅与腊样芽孢杆菌有交叉反应,特异性为97％；鼠疫杆菌检测灵敏性为5×10~4cfu/ml,最低检测菌数为5×10~3cfu/test,在10~7cfu/ml水平上未发现与30余种细菌有交叉反应,包括最近缘假结核耶尔森菌；EHEC O_(157)检测灵敏性为1×10~3cfu/ml,仅与弗氏枸橼酸杆菌有交叉反应,特异性为98％。胶体金免疫层析方法能在10min内完成检测,炭疽芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)检测灵敏度分别为1×10~6cfu/ml、1×10~5cfu/ml、1×10~5cfu/ml,“白色粉末”等环境样品最低可检测敏感性为1×10~5cfu,1×10~4cfu,1×10~4cfu/test。胶体金免疫层析方法分别应用于炭疽、鼠疫强毒株的检测,检测限为5×10~4cfu/test和7×10~4cfu/test。在实际血清样品检测中,与间接血凝方法对比,鼠疫抗体UCP和胶体金免疫层析方法有更好的敏感性。血清样品检测显示,SARS抗体的胶体金和UCP免疫层析方法均有较好的特异性和敏感性。[结论]2种免疫层析方法都有快速、敏感、特异的特点：上转磷光免疫层析方法可实现定量检测,敏感性优于胶体金免疫层析法；炭疽检测与加拿大RAMP检测系统相当；胶体金免疫层析法具有简便、直观、易行的特点。2种免疫层析方法均适合于炭疽芽孢芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)、鼠疫杆菌抗体、SARS抗体的现场检测和筛查。     

微流控技术在口岸呼吸道传染病检测中的应用

目的呼吸道感染是全球关注的公共卫生问题,随着国际贸易的快速发展,在人流和物流集中的国境口岸传播风险极高。因此当务之急是口岸卫生检疫部门寻找一种多通量、检测速度快、特异性高和准确性好的呼吸道病原体检测技术。方法目前呼吸道病原体检测技术主要有微生物的分离培养、血清免疫学和核酸检测技术,但是存在检测时间长、通量小和不适合口岸现场检测等缺点,不能满足口岸现场检测要求。结果总结分析呼吸道病原体的检测技术,微流控技术应用在口岸呼吸道传染病检测具有很强的实用性。结论微流控技术具有通量大、便携性和准确性好等优点,可以满足口岸呼吸道传染病检测的方法要求。     

鼠疫菌聚合酶螺旋反应等温扩增方法的建立

目的用聚合酶螺旋反应(PSR)建立快速、灵敏、特异的鼠疫菌等温扩增方法。方法根据鼠疫菌F1基因设计引物,利用Bst DNA聚合酶链置换活性,通过添加pH指示剂和核酸荧光染料SYBR GreenⅠ,建立可视化PSR检测方法,并用于鼠脏器、血液、环境样本中鼠疫菌的检测。结果建立的PSR方法可在40 min内得到结果,最佳反应温度为64℃,最低检测限为100拷贝/μl,与14株非鼠疫菌无交叉反应。可成功检测模拟阳性样本。结论建立的PSR等温扩增反应为鼠疫菌的快速检测提供了新方法。     

食品中沙门菌变性高效液相色谱检测技术的研究与方法建立

目的:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中沙门菌的快速检测方法.方法:根据沙门菌fimY基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测.以沙门菌等89株参考菌株做特异性检测;沙门菌液体培养物稀释成不同梯度,做灵敏度检测.结果:试验结果表明该方法有很好的特异性,而其它非沙门菌均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限可达到45 cfu/ml.结论:该方法可以快速、准确检测食品中沙门菌,是食品中致病菌检测的新技术和新方法.     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。