宫颈癌组织中HPV16 E7序列多态性分析

目的探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性.方法采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变.结果50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例.33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸.结论广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846.     

荧光偏振方法快速检测HPV16 E7第29位密码子点突变

目的:通过TDI-FP方法检测宫颈病变组织中HPV16 E7基因第29位密码子突变(A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性,同时建立一种HPV点突变检测的新方法. 方法:以53例HPV16阳性宫颈组织为研究对象.首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段,然后用TDI-FP方法检测荧光素碱基的掺入情况,判断所研究位点的基因型. 结果:宫颈浸润癌组织中HPV16 E7第29位密码子的突变率为43.48%(10/23),对照组为10.00%(2/20),病例组为39.39%(13/33),组间突变率差异有显著性(P<0.05).该法与随机抽查标本测序结果一致率为100%. 结论:本研究中HPV16病毒发生E7第29位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异;HPV点突变TDI-FP检测方法是一种快速简便、高通量的基因突变检测技术.     

宫颈癌组织中HPV16E7序列多态性分析

目的 探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性。方法 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论 广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。     

宫颈癌组织中P16和HPV16/18 E7的表达及意义

①目的研究宫颈癌组织中抑癌基因p16 mRNA和蛋白质的表达,以及与HPV16/18 E7表达的关系.②方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测45例宫颈浸润癌组织、12例宫颈原位癌组织和20例正常宫颈组织中HPV16/18的感染情况;采用RT-PCR技术检测上述标本中HPV16/18阳性者E7 mRNA的表达水平及所有标本中p16 mRNA表达水平;采用免疫组化技术进一步检测HPV16/18 E7、P16蛋白的表达情况.③结果宫颈原位癌和浸润癌HPV16/18的感染率、HPV16/18 E7 mRNA和蛋白表达阳性率明显高于正常宫颈组织,差异有显著性(χ2=5.12～15.78,P<0.05、0.01),原位癌和浸润癌组之间比较差异无显著性(χ2=0.119、0.000,P>0.05);原位癌和浸润癌p16 mRNA的相对表达量明显高于正常宫颈,差异有显著性(F=5.412,q=4.125、5.519,P<0.05);HPV16/18 E7阳性组p16 mRNA的表达阳性率明显高于阴性组,差异有显著性(t=4.127,P<0.01);P16蛋白在宫颈原位癌和浸润癌组织中呈现过表达,在正常组织中为阴性表达或弱表达;p16 mRNA的相对表达量与HPV16/18 E7 mRNA的相对表达量呈显著正相关(r=0.813,P<0.05);P16蛋白的过表达与HPV16/18 E7蛋白表达有相关关系(χ2=8.959,P<0.01);HPV16/18 E7 mRNA和蛋白及p16 mRNA和蛋白的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤的大小和病人的年龄无关(P均>0.05).④结论抑癌基因p16的过表达发生在宫颈癌的早期和癌前病变阶段,可用于临床筛查和早期诊断宫颈癌.     

宫颈癌组织中HPV16E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E6)、16型人乳头瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E7)水平与患者临床病理特征及预后的关系。方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织(P<0.05); HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(P<0.05);多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中...     

AgNOR定量测定与TDI-FP法检测宫颈肿瘤及HPV类型

目的探讨早期诊断宫颈癌的新途径。方法应用宫颈细胞涂片核仁组成区相关嗜银蛋白（AgNOR）定量测定和染料终止子末端掺人-荧光偏振法（TDI—FP）联合检测宫颈病变，宫颈涂片按Ploton一步染色法进行染色，计数，TDI—FP法检测宫颈病变中HPV感染及分型情况。结果正常宫颈与慢性宫颈炎组，AgNOR计数多在4以下，高危型HPV16、HPV18阳性率明显低于宫颈上皮内瘤样病变（CIN）及宫颈癌组。随着宫颈病变的加重，AgNOR计数增多，同时伴随着HPV阳性率增高，AgNOR计数大于5者，高危型HPV阳性率明显增高。结论对AgNOR计数大于5者，行TDI—FP法精确检测，结合组织活检，有望提高宫颈癌高危人群的筛查及宫颈癌的早期诊断率。     

宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法的建立及意义

目的：建立宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法,分析宫颈癌发生各时期的HPV16早期基因E6相关转录的情况。方法：留取HPV16阳性的宫颈肿瘤组织63例,包括8例低度鳞状上皮内瘤变（LSIL）、38例高度鳞状上皮内瘤变（HSIL）和17例宫颈癌,提取RNA,利用含保守序列的RT引物将标本中的mRNA反转录成5’端含保守序列的cDNA,并利用HPV16E6特异性引物（P1）和保守序列（P0）进行PCR扩增,建立特异性扩增HPV16E6相关转录本的方法,检测标本中HPV16E6相关的转录本,通过E6特异性探针进行Southern杂交加以验证。结果：成功建立了HPV16E6相关转录模式分析的方法。经分析HPV16阳性的LSIL、HSIL及宫颈癌组织中E6转录模式结果发现,不同级别HPV16阳性的宫颈肿瘤组织的转录模式差异显著。随着LSIL向宫颈癌发展,肿瘤组织中HPV16E6转录本种类增多,且优势转录模式逐渐清晰。结论：成功建立HPV16E6相关转录模式分析的方法,并发现HPV16早期基因E6相关的转录模式与宫颈肿瘤癌变程度密切相关,其可能参与宫颈癌的发生和发展。     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒基因检测分型研究

目的 了解汕头地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒(HPV)的感染率及基因分型分布情况,探讨HPV基因型与宫颈癌类型的相关性.方法 应用基因芯片技术检测23种HPV基因型.对2006年1月-2008年6月在我院住院并确诊的125例宫颈癌患者宫颈脱落细胞行HPV检测,并统计各基因型的感染率.结果 125例宫颈癌标本中HPV阳性116例,占92.8%.共检测出9种HPV基因型,分别为HPV6、11、16、18、31、33、45、58、59.其中单一低危型(HPV6、11)感染3例,占2.6%;单一高危型(HPV16、18、45、59)感染82例,占65.6%;双重感染22例,占17.6%;多重感染9例,占7.8%.HPV16为主要致病基因型,检出率达59.5%;其次是HPV18,检出率为19.8%.结论 汕头地区宫颈癌患者中,HPV基因型多样,且多为高危型感染,以HPV16、18最为常见,存在双重染感,宫颈鳞癌中HPV感染率明显高于宫颈腺癌,HPV基因分布与肿瘤类型有关.     

HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)16相关宫颈癌组织中粘蛋白抗原16(MUC16)与E6表达的关系。方法:以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织(184例)为研究对象,采用Western blot和免疫组化方法检测HPV16 E6和MUC16的表达。结果:Western blot结果显示:C-33A细胞中HPV16 E6无表达,Ca Ski细胞和Si Ha细胞中可见HPV16 E6表达;C-33A细胞中MUC16的表达低于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(P<0.05),Ca Ski细胞和Si Ha细胞中MUC16的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:HPV16E6阳性的宫颈鳞癌组织中MUC16的表达高于HPV16 E6阴性的宫颈鳞癌组织(χ2=43.670,P<0.001)。结论:宫颈癌细胞系和鳞癌组织中MUC16与E6表达可能有关。     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

宫颈病变患者人乳头瘤病毒16亚型E2基因多态性检测

目的分析宫颈病变中人乳头瘤病毒（HPV）16亚型E2基因的多态与宫颈病变的关系,了解E2基因变异情况及其与宫颈
病变的相关性。方法应用PCR和高分辨率熔解曲线方法针对379例HPV高危亚型阳性宫颈脱落细胞样本进行HPV16感染
情况及HPV16亚型E2基因68位点和133位点多态分布情况进行检测。结果379例HPV高危亚型阳性宫颈标本共检出78例
HPV16亚型阳性,其在宫颈癌、CINⅡ~Ⅲ、CINⅠ、炎症患者中的检出率分别为44.8%、31.5%、24.1%和9.6%;HPV16E2基因
68C和133G的频率在中重度宫颈内瘤样病变和宫颈癌中明显高于轻度上皮内瘤样病变和炎症患者（P<0.05）。结论HPV16是
导致宫颈恶性病变的重要致病因素;随着病理类型的进展,HPV16感染率也逐渐增加;同时基因位点改变说明HPV16E2基因
单核苷酸变异可能使致癌能力发生改变。
     

温州地方株HPV16型L1基因多态性及蛋白特性分析

目的：了解温州地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法：设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈癌组织标本提取DNA,进行PCR扩增鉴定,PCR产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNAStar软件分析HPV16型L1基因多态性及蛋白特性变化情况。结果：测定的序列与标准基因序列（NC 001526）比较,温州地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为99.1%～99.8%,分别形成8种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上与标准株相比较无明显变化。结论：温州地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异。     

HPV_(16)型E_6/E_7序列突变情况与宫颈癌发生的相关性

目的:探讨宫颈癌人乳头瘤病毒16型(HPVl6)E6和E7转化基因序列多态性,及其与宫颈癌临床病理特征的相关性。方法:抽取77例宫颈癌组织中筛选出51例HPVl6阳性标本,扩增E6及E7基因,PCR产物进行序列测定。应用DNA Star生物软件进行核苷酸和氨基酸序列的分析。结果:宫颈癌组织中HPVl6E6共测得6个突变位点,均为错义突变。宫颈癌组织中HPVl6E7共测得4个突变位点,2个为错义突变。结论:HPVl6E6基因T178G/A突变与宫颈癌的发生发展无关,HPVl6E7基因A647G突变与宫颈癌的分化程度呈负相关,可以作为评估官颈癌恶性程度的指标。     

HPV16相关宫颈癌细胞系和组织中E7和DRR1蛋白的表达

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)相关宫颈癌细胞系和组织中E7和肾细胞癌下调基因1(DRR1)表达的关系。方法:以HPV16 E7阳性的宫颈癌Ca Ski和Si Ha细胞、HPV16 E7阴性的宫颈癌C-33A细胞及184例宫颈鳞状细胞癌组织为研究对象,采用Western blot方法和免疫组化染色方法检测E7和DRR1蛋白的表达,分析E7与DRR1蛋白表达的关系。结果:Western blot结果显示,C-33A细胞中HPV16 E7无表达,DRR1蛋白的表达显著高于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(F=454.982,P<0.001);Ca Ski细胞和Si Ha细胞表达HPV16 E7,二者DRR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,HPV16 E7阳性宫颈鳞状细胞癌组织141例,其中DRR1蛋白阳性34例;HPV16 E7阴性宫颈鳞状细胞癌组织43例,其中DRR1蛋白阳性32例;HPV16 E7阳性组织中DRR1蛋白的表达显著低于HPV16 E7阴性组织(χ2=36.250,P<0.001)。结论:DRR1可能是HPV16 E7作用的潜在靶基因。     

直肠腺癌患者人乳头状瘤病毒感染与k-ras基因突变检测

目的：探讨HPV感染及k-ras基因突变与直肠腺癌的关系。方法：应用PCR/SSCP银染法检测75例直肠腺癌患者癌及相应正常大肠黏膜组织中HPV DNA和k-ars基因第12、13密码子。结果：直肠腺癌组织中HPVDNA阳性检出率为73.3%（55/75）,而正常黏膜未检测到HPV DNA。HPV感染与患者年龄、Duke’s分期及淋巴结转移有关,而与患者的族别、性别、肿瘤直径、大体类型、组织学类型及浸润深度无关。75例直肠腺癌组织中检测到k-ras基因突变34例（45.3%）,均与患者年龄、肿瘤的大体类型、组织学类型、侵袭深度、淋巴结转移及Duke’s分期无关,且与HPV感染亦无关联（χ2=0.240,P=0.624,rP=0.056）。结论：HPV感染可能是导致直肠腺癌恶性表型的重要因素;而k-ras基因突变与HPV感染无关。