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单纯疱疹病毒Ⅰ型tk基因的克隆及其真核表达载体的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:为观察携带小鼠白细胞介素12(mIL-12)逆转录病毒包装细胞株在肝癌局部注射后,对体内肝癌治疗效果.方法:构建携带mIL-12的逆转录病毒载体,将该载体转染包装细胞系PA317,应用该包装细胞对实验性原位肝癌大鼠分别在不同时间进行治疗,观察其抗肿瘤作用,免疫功能变化,病理及毒性反应.结果:携带mIL-12逆转录病毒包装细胞(PA317-mIL-12)在原位肝癌局部注射后能明显抑制肝癌细胞生长,其早期治疗可使大鼠长期生存,中晚期治疗,大鼠虽然不能长期生存,但较空白对照组及携带空载体对照组的生存期明显延长,(P<0.01).其治疗组NK细胞及T细胞明显增加,其早期治疗效果优于中期治疗,另外,本研究对肝癌局部进行IL-12基因转染,可使另一叶肝癌消退,这表明IL-12可通过激活机体免疫细胞,杀灭未转染的肿瘤细胞,这对于临床应用IL-12基因治疗非常重要.同时,生存期超过2个月大鼠,再次接种相当数量的肝癌细胞,该大鼠不能再次形成肝癌.结论:肝癌局部注射IL-12基因能激发机体抗肿瘤免疫反应. 相似文献
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自杀基因治疗恶性胶质瘤的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV-tk)基因治疗恶性胶质瘤体内外试验。方法:分子克隆及真核细胞基因转染技术构建逆转录病毒(RV)载体pMV7(tk)及PA317tk包装细胞系;体外不同比例混合鼠C6胶质瘤细胞与PA317tk细胞,在GCV(Ganciclovir)作用下观察细胞存活率;建立SD大鼠颅内C6胶质瘤模型(种植5×105C6细胞),治疗组第3天原位注射5×106PA317tk细胞,5天后腹腔给予GCV(30mg/kg.d),MRI全程监测肿瘤消长,观察病症及存活期,并行病理检查。结果:在GCV0.1~101μg/ml浓度范围内,C6细胞存活率随PA317tk细胞混入比例增加而逐渐减低(P<0.001),并具有GCV剂量依赖性(P<0.01);体内试验治疗组病症轻,生存期延长,MRI表明治疗组肿瘤体积较对照组明显减小(P<0.01),1个月时病理检查见肿瘤细胞消失,代之以小胶质细胞增生并形成坏死囊。结论:应用本实验室构建的RV载体pMV7(tk)及其PA317tk包装细胞系治疗恶性胶质瘤是一种有效及具有前途的治疗方法。 相似文献
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目的:研究利用小鼠白细胞介素12(mIL12)和人白细胞介素2(hIL2)基因对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。方法:构建携带mIL12和hIL2基因的逆转录病毒载体,转染包装细胞后对实验性肝癌大鼠进行肝癌局部注射,观察对肝癌细胞的生长抑制作用及其对大鼠的免疫功能变化、毒性反应。结果:携带mIL12/hIL2基因的重组逆转录病毒在肿瘤内局部注射明显抑制了肝肿瘤的生长。肝癌接种后第1,3,5,7天治疗组大鼠35 d生存率分别为100%,100%,30%,10%。IL12+IL2治疗组平均生存时间明显高于生理盐水对照组(P<0.01)、逆转录病毒空载体对照组(P<0.01)、IL2治疗组(P<0.01)和IL12治疗组(P<0.05)。治疗后肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多。结论:肝癌局部注射携带mIL12和hIL2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长,早期治疗优于晚期治疗。 相似文献
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逆转录病毒载体是向真核细胞中进行基因转移的高效载体之一,是比较成熟和应用范围最广的基因转移和基因治疗载体。胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminese,CD)基因是一重要的自杀性基因,我们研究的目的是克隆构建含有CD基因的重组逆转录病毒载体,并将该基因导入PA317包装细胞,建立完整的和安全高效的逆转录病毒表达载体系统,为开展CD基因与前体药物5氟胞嘧啶(5fluorocytosine,5Fc)联合用于肿瘤的实验治疗研究奠定基础。材料与方法 1-主要试剂:限制性内切酶、T4DNA连接酶… 相似文献
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目的:肿瘤细胞的多药抗药性(MDR)是化疗失败的主要原因之一,P-糖蛋白高表达是MDR的主要机制,逆转MDR成为肿瘤治疗亟待解决的问题。目前用于研究抗药性和筛选逆转抗药性药物的模型较少,本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法:采用基因工程技术,重组MDR1基因cDNA于逆转录病毒载体pZIR-NeoSV(X)的克隆位点,并用脂染胺(lipofectAMINE)介导的DNA转移技术,将其转入包装细胞PA317中,收集含病毒子的培养上清液感染对药物敏感的人乳癌细胞株MCF-7,经筛选培养基筛选,PCR、免疫组化及阿霉素在细胞内的分布等实验。结果:含MDR基因的逆转录病毒载体pZMDR的构建方法证明是正确的,MDR1cDNA已整合在染色体基因组中并表达P-糖蛋白。结论:建立的MCF-7/pZMDR细胞为一特异表达P-糖蛋白的多药抗药性转基因细胞株 相似文献
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c-ets-2、c-myc、N-ras三个癌基因联合反义RNA对肝癌细胞恶性表型的逆转 总被引:3,自引:0,他引:3
作者构建了一个能表达c-ets-2、c-myc及N-ras三个癌基因联合反义RNA的重组逆转录病毒载体,经病毒包装细胞PA317包装成假型逆转录病毒,利用此病毒成功地感染了人肝癌细胞株SMMC-7721,经G418筛选得到G418抗性细胞,基因组DNA杂交结果表明重组病毒稳定地整合入7721细胞基因组中。RNA杂交结果表明转化细胞中有较高水平的联合反义RNA表达。初步结果表明,反义RNA使7721细胞生长速率下降约70%,软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降。这一结果表明,针对多个癌基因的联合反义RNA可能给肿瘤基因治疗提供新的途径,有进一步探索的价值。 相似文献
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为逆转多药耐药mdr-1基因产物P-gp蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性,作者设计合成了一种能切割mdr-1mRNA第196密码子GUC序列的锤头状核酶(Ribozyme),并定向克隆于逆转录病毒载体。经PA317包装后,病毒上清感染BEL-7402/DOX细胞株。经Northernblot杂交证实,PA317及转化的BEL-7402/DOX细胞中均有病毒的高表达,RT-PCR结果表明,转化细胞中mdr-1mRNA与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来,流式细胞技术检测发现转化细胞表面P-gp的表达与非转化细胞相比明显下降。MTT法检测发现转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性。结果提示,此Ribozyme转化BEL-7402/DOX细胞后能有效抑制mdr-1基因的表达,使已产生耐药的肝癌细胞的多药耐药表型发生逆转。 相似文献
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逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的?… 总被引:6,自引:1,他引:5
目的:为了研究抗MDRI核酶逆转肿瘤细胞中P-gp介导的多重耐药性(MDR)的作用。方法:首先,我们建立了单纯由P-gp介导的、20倍耐药的人Daudi淋巴瘤细胞的模型-Daudi/MDR20。同时我们将表达不同抗MDR1核酶的逆转录病毒载体(N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz,N2A+tBNAimet-196MDR1-sRz和 N2A+tRNAimet-iMDRI-sRz)转染到GP+envAM12细胞中进行包装,获得了高滴度的病毒[(1,1~2.5)×10cfu/ml]。后者用于感染Daudi/MDR20。结果:通过一系列分子生物学检测证实,携带3种核酶的逆转录病毒不但整合到DNA中,而且也高水平表达相应的核酶tRNAimet-iMDR1-sRz,tRNAimet-196MDR1-sRz和tRNAimet-196MDR1-Rz。结果表明,tRNAimet-iMDR1-sRz和tRNAimet-196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性,并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达的阻断。结论:逆转录病毒载体高效介导的抗MDR1核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细 相似文献
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为逆转肿瘤多药耐药基因产物P-gp蛋白质所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性,设计愈了一种能切割MDR1mRNA第196密码子GUC序列的锤头状核酶并定向克隆于转录病毒载体pDFOR-neo的BamHI钭点。经病毒包装细胞PA317包装后感染人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX细胞,经G418筛选得到稳定的转化细胞株。 相似文献
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人B7-1(CD80)转染的PA317细胞对小鼠H22肝癌抑制作用的初步探讨黄晋生1杨金亮1严明山2连慕兰2张海荣1郭启煜1周正谋1房殿春关键词PA317B7-1(CD80)H22肝癌小鼠中图号R73-35B7是B细胞上的活化抗原,导入B7基因的肿瘤... 相似文献
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利用逆转录病毒载体系统PA317/LNC-IL-2所产生的含有IL-2基因及新霉素抗性基因(neor)的重组病毒,经共培养转染SMMC-7721肝癌细胞株。IL-2基因受巨细胞病毒早期启动子调控,转染后的细胞置于含新霉素类毒性药物G418(400ug/ml)培养基内培养、筛选30天,结果果转染率约为1~2%。对存活下来的转染有IL-2基因和新霉素抗性基因的细胞形态和生长情况进行观察,同时从水平及蛋白质水平对外源性基因的转录和翻译进行检测。结果表明:SMMC-7721肝癌细胞在IL-2基因转染前后形态及生长情况无明显变化;培养上清活性检测发现转染后为转染前的20~30倍;逆转录PCR分析显示转染后的IL-2mRNA量明显高于转染前。研究表明我们已成功地将IL-2基因导入肝癌细胞并获得持续、稳定、高效表达。 相似文献
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目的:肿瘤细胞的多药抗药民生(MDR)是化学失败的主要原因之定,P-糖蛋白高表达是MDR的主要机制,逆转MDR成为肿瘤治疗亟待的问题。目前用于研究抗经性和筛选逆转抗药性药物的模型较少,本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法;采用基因工程技术,重组MDR1基因CDNA于逆转录病毒载体pZIR-NecSV(X)的克隆位点,并用脂染胺介民的DNA转移技术,将其转入包装细胞PA317中,收集含病毒子的培养上清 相似文献
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转基因细胞SPC-A-1/IL-2的致突变性研究 * 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:观察转基因细胞SPC-A-1/IL-2的致突变作用,为转基因肿瘤细胞作为瘤苗进行临床应用的安全性检测提供依据。方法:在人IL-2的cDNA与逆转录病毒载体pLXSN重组并完成PA317/pLIL-2SN包装体系的基础上,将IL-2基因导入人肺腺癌胸膜转移细胞系SPC-A-1中并得到IL-2基因的稳定表达,然后通过遗传毒理学实验技术对转基因细胞SPC-A-1/IL-2的DNA及培养上清液进行体内和体外的致突变性实验研究。结果:转基因细胞SPC-A-1/IL-2的DNA及培养上清液均未显出致突变作用。结论:转基因细胞SPC-A-1/IL-2作为瘤苗应用可初步视为是安全可靠的。 相似文献
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人肝癌细胞耐药模型-7721/Adm的建立及其部分生物学特性 总被引:22,自引:3,他引:19
目的:建立耐药肝癌细胞模型-7721/Adu并研究其生物学特性。方法:应用人肝癌细胞株-7721(简称7721细胞株),采用阿霉素(Adm)高浓度间歇诱导法,建立耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm(简称7721/Adm细胞株)。观察该细胞的生长规律;用MTT法检测该耐药细胞模型的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药模型细胞周期中的分布,细胞表面多药耐药基因(mdr)的表达产物P-糖蛋白(P-gp) 相似文献
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目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性,为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体(lipofectin)包装技术将N2A/CMV/hGM-CSF导入包装细胞PA317,获得重组逆转录病毒,将重组病毒悬液感染人髓系白血病HL-60细胞,经G418筛选出HL-60转基因细胞群,应1用MTT法测定GM-CSF活性。结果PCR及Southernblot检测结果证实,GM-CSF基因成功地转移并整合到HL-60细胞基因组中,而未转基因和转空载体N2A的HL-60细胞经PCR检测未能扩增出特异性片段。经GM-CSF依赖株TF-1检测,转基因细胞分泌的GM-CSF生物学活性为60~200ng/ml(细胞1×106,培养24小时),而未转基因及转空载体N2A的HL-60细胞培养上清无GM-CSF活性。结论逆转录病毒载体介导的hGM-CSF基因能在体外培养的人HL-60白血病细胞中获得高效的转移和表达。 相似文献
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树突状细胞与髓性白血病的免疫治疗 * 总被引:5,自引:0,他引:5
目的:我们应用逆转录病毒构建了IL-12,B-7和GM-CSF表达载体,以研究基因修的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法:将3种表达载体分别转染EL-4胞腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果:当接种子EL4/IL-12细胞后,在C57PL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P〈0.01)。在EL4/IL-12被排斥后,体内试验中诱发了实验动物抗 相似文献