单纯疱疹病毒Ⅰ型tk基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为观察携带小鼠白细胞介素12(mIL-12)逆转录病毒包装细胞株在肝癌局部注射后,对体内肝癌治疗效果.方法:构建携带mIL-12的逆转录病毒载体,将该载体转染包装细胞系PA317,应用该包装细胞对实验性原位肝癌大鼠分别在不同时间进行治疗,观察其抗肿瘤作用,免疫功能变化,病理及毒性反应.结果:携带mIL-12逆转录病毒包装细胞(PA317-mIL-12)在原位肝癌局部注射后能明显抑制肝癌细胞生长,其早期治疗可使大鼠长期生存,中晚期治疗,大鼠虽然不能长期生存,但较空白对照组及携带空载体对照组的生存期明显延长,(P<0.01).其治疗组NK细胞及T细胞明显增加,其早期治疗效果优于中期治疗,另外,本研究对肝癌局部进行IL-12基因转染,可使另一叶肝癌消退,这表明IL-12可通过激活机体免疫细胞,杀灭未转染的肿瘤细胞,这对于临床应用IL-12基因治疗非常重要.同时,生存期超过2个月大鼠,再次接种相当数量的肝癌细胞,该大鼠不能再次形成肝癌.结论:肝癌局部注射IL-12基因能激发机体抗肿瘤免疫反应.     

自杀基因治疗恶性胶质瘤的研究

目的：单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因治疗恶性胶质瘤体内外试验。方法：分子克隆及真核细胞基因转染技术构建逆转录病毒（ＲＶ）载体ｐＭＶ７（ｔｋ）及ＰＡ３１７ｔｋ包装细胞系;体外不同比例混合鼠Ｃ６胶质瘤细胞与ＰＡ３１７ｔｋ细胞,在ＧＣＶ（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）作用下观察细胞存活率;建立ＳＤ大鼠颅内Ｃ６胶质瘤模型（种植５×１０５Ｃ６细胞）,治疗组第３天原位注射５×１０６ＰＡ３１７ｔｋ细胞,５天后腹腔给予ＧＣＶ（３０ｍｇ／ｋｇ．ｄ）,ＭＲＩ全程监测肿瘤消长,观察病症及存活期,并行病理检查。结果：在ＧＣＶ０．１～１０１μｇ／ｍｌ浓度范围内,Ｃ６细胞存活率随ＰＡ３１７ｔｋ细胞混入比例增加而逐渐减低（Ｐ＜０．００１）,并具有ＧＣＶ剂量依赖性（Ｐ＜０．０１）;体内试验治疗组病症轻,生存期延长,ＭＲＩ表明治疗组肿瘤体积较对照组明显减小（Ｐ＜０．０１）,１个月时病理检查见肿瘤细胞消失,代之以小胶质细胞增生并形成坏死囊。结论：应用本实验室构建的ＲＶ载体ｐＭＶ７（ｔｋ）及其ＰＡ３１７ｔｋ包装细胞系治疗恶性胶质瘤是一种有效及具有前途的治疗方法。     

白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究

目的：研究利用小鼠白细胞介素12(mIL12)和人白细胞介素2(hIL2)基因对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。方法：构建携带mIL12和hIL2基因的逆转录病毒载体，转染包装细胞后对实验性肝癌大鼠进行肝癌局部注射，观察对肝癌细胞的生长抑制作用及其对大鼠的免疫功能变化、毒性反应。结果：携带mIL12/hIL2基因的重组逆转录病毒在肿瘤内局部注射明显抑制了肝肿瘤的生长。肝癌接种后第1,3,5,7天治疗组大鼠35 d生存率分别为100%,100%,30%,10%。IL12+IL2治疗组平均生存时间明显高于生理盐水对照组（P＜0.01)、逆转录病毒空载体对照组（P＜0.01)、IL2治疗组（P＜0.01)和IL12治疗组（P＜0.05)。治疗后肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多。结论：肝癌局部注射携带mIL12和hIL2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长，早期治疗优于晚期治疗。     

胞嘧啶脱氨酶基因重组逆转录病毒载体构建及对PA317细胞的转移表达

逆转录病毒载体是向真核细胞中进行基因转移的高效载体之一,是比较成熟和应用范围最广的基因转移和基因治疗载体。胞嘧啶脱氨酶（ｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎｅｓｅ,ＣＤ）基因是一重要的自杀性基因,我们研究的目的是克隆构建含有ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体,并将该基因导入ＰＡ３１７包装细胞,建立完整的和安全高效的逆转录病毒表达载体系统,为开展ＣＤ基因与前体药物５氟胞嘧啶（５ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ,５Ｆｃ）联合用于肿瘤的实验治疗研究奠定基础。材料与方法　１－主要试剂：限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶…     

含MDR基因的人乳腺癌MCF 7/pZMDR多药耐药细胞株的构建

目的：肿瘤细胞的多药抗药性（ＭＤＲ）是化疗失败的主要原因之一，Ｐ－糖蛋白高表达是ＭＤＲ的主要机制，逆转ＭＤＲ成为肿瘤治疗亟待解决的问题。目前用于研究抗药性和筛选逆转抗药性药物的模型较少，本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法：采用基因工程技术，重组ＭＤＲ１基因ｃＤＮＡ于逆转录病毒载体ｐＺＩＲ－ＮｅｏＳＶ（Ｘ）的克隆位点，并用脂染胺（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）介导的ＤＮＡ转移技术，将其转入包装细胞ＰＡ３１７中，收集含病毒子的培养上清液感染对药物敏感的人乳癌细胞株ＭＣＦ－７，经筛选培养基筛选，ＰＣＲ、免疫组化及阿霉素在细胞内的分布等实验。结果：含ＭＤＲ基因的逆转录病毒载体ｐＺＭＤＲ的构建方法证明是正确的，ＭＤＲ１ｃＤＮＡ已整合在染色体基因组中并表达Ｐ－糖蛋白。结论：建立的ＭＣＦ－７／ｐＺＭＤＲ细胞为一特异表达Ｐ－糖蛋白的多药抗药性转基因细胞株     

c－ets－2、c－myc、N－ras三个癌基因联合反义RNA对肝癌细胞恶性表型的逆转

作者构建了一个能表达ｃ－ｅｔｓ－２、ｃ－ｍｙｃ及Ｎ－ｒａｓ三个癌基因联合反义ＲＮＡ的重组逆转录病毒载体，经病毒包装细胞ＰＡ３１７包装成假型逆转录病毒，利用此病毒成功地感染了人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１，经Ｇ４１８筛选得到Ｇ４１８抗性细胞，基因组ＤＮＡ杂交结果表明重组病毒稳定地整合入７７２１细胞基因组中。ＲＮＡ杂交结果表明转化细胞中有较高水平的联合反义ＲＮＡ表达。初步结果表明，反义ＲＮＡ使７７２１细胞生长速率下降约７０％，软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降。这一结果表明，针对多个癌基因的联合反义ＲＮＡ可能给肿瘤基因治疗提供新的途径，有进一步探索的价值。     

核酶对肝癌耐药细胞株BEL—7402／DOX耐药性的逆转作用

为逆转多药耐药ｍｄｒ－１基因产物Ｐ－ｇｐ蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性，作者设计合成了一种能切割ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ第１９６密码子ＧＵＣ序列的锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ），并定向克隆于逆转录病毒载体。经ＰＡ３１７包装后，病毒上清感染ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞株。经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证实，ＰＡ３１７及转化的ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞中均有病毒的高表达，ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，转化细胞中ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来，流式细胞技术检测发现转化细胞表面Ｐ－ｇｐ的表达与非转化细胞相比明显下降。ＭＴＴ法检测发现转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性。结果提示，此Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转化ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞后能有效抑制ｍｄｒ－１基因的表达，使已产生耐药的肝癌细胞的多药耐药表型发生逆转。     

逆转录病毒介导IL—2基因导入肝癌细胞的研究

利用逆转录病毒载体系统ＰＡ３１７／ＬＮＣ－ＩＬ－２所产生的含有ＩＬ－２基因及新霉素抗性基因的重组病毒，经共培养转染ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株。ＩＬ－２基因受巨细胞病毒早期启动子调控，转染后的细胞置于含新霉素类毒性药物Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）培养基内培养、筛选３０天，结果果转染率约为１￣２％。对存活下来的转染有ＩＬ－２基因和新霉素抗性基因的细胞形态和生长情况进行观察，同时从水平及蛋白质水平对外     

逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的？…

目的：为了研究抗ＭＤＲＩ核酶逆转肿瘤细胞中Ｐ－ｇｐ介导的多重耐药性（ＭＤＲ）的作用。方法：首先,我们建立了单纯由Ｐ－ｇｐ介导的、２０倍耐药的人Ｄａｕｄｉ淋巴瘤细胞的模型－Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。同时我们将表达不同抗ＭＤＲ１核酶的逆转录病毒载体（Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ,Ｎ２Ａ＋ｔＢＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和 Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲＩ－ｓＲｚ）转染到ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２细胞中进行包装,获得了高滴度的病毒［（１,１～２．５）×１０ｃｆｕ／ｍｌ］。后者用于感染Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。结果：通过一系列分子生物学检测证实,携带３种核酶的逆转录病毒不但整合到ＤＮＡ中,而且也高水平表达相应的核酶ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ。结果表明,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ转导的Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性,并伴随着ＭＤＲ１　ｍＲＮＡ和Ｐ－ｇｐ表达的阻断。结论：逆转录病毒载体高效介导的抗ＭＤＲ１核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细     

外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的：研究Ｐ１４ＡＲＦ基因对人脑胶质瘤细胞株（Ｕ－２５１）生长的影响。方法：用脂质体介导携带Ｐ１４ＡＰＦ的真核表达载体转染Ｕ－２５１细胞,观察其对该细胞株的生长、增殖周期等生物学行为的影响。结果：导入Ｐ１４ＡＰＦ胶质瘤细胞Ｕ－２５１的生长有明显的抑制作用。     

切割MDR1 RNA的核酶（Ribozyme）对肝癌多药耐药细胞株BEL…

为逆转肿瘤多药耐药基因产物Ｐ－ｇｐ蛋白质所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性，设计愈了一种能切割ＭＤＲ１ｍＲＮＡ第１９６密码子ＧＵＣ序列的锤头状核酶并定向克隆于转录病毒载体ｐＤＦＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ钭点。经病毒包装细胞ＰＡ３１７包装后感染人肝癌多药耐药细胞株ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞，经Ｇ４１８筛选得到稳定的转化细胞株。     

人B7—1（CD80）转染的PA317细胞对小鼠H22肝癌抑制作用的初步探讨

人Ｂ７－１（ＣＤ８０）转染的ＰＡ３１７细胞对小鼠Ｈ２２肝癌抑制作用的初步探讨黄晋生１杨金亮１严明山２连慕兰２张海荣１郭启煜１周正谋１房殿春关键词ＰＡ３１７Ｂ７－１（ＣＤ８０）Ｈ２２肝癌小鼠中图号Ｒ７３－３５Ｂ７是Ｂ细胞上的活化抗原，导入Ｂ７基因的肿瘤...     

逆转录病毒介导IL－2基因导入肝癌细胞的研究

利用逆转录病毒载体系统ＰＡ３１７／ＬＮＣ－ＩＬ－２所产生的含有ＩＬ－２基因及新霉素抗性基因（ｎｅｏｒ）的重组病毒，经共培养转染ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株。ＩＬ－２基因受巨细胞病毒早期启动子调控，转染后的细胞置于含新霉素类毒性药物Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）培养基内培养、筛选３０天，结果果转染率约为１～２％。对存活下来的转染有ＩＬ－２基因和新霉素抗性基因的细胞形态和生长情况进行观察，同时从水平及蛋白质水平对外源性基因的转录和翻译进行检测。结果表明：ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞在ＩＬ－２基因转染前后形态及生长情况无明显变化；培养上清活性检测发现转染后为转染前的２０～３０倍；逆转录ＰＣＲ分析显示转染后的ＩＬ－２ｍＲＮＡ量明显高于转染前。研究表明我们已成功地将ＩＬ－２基因导入肝癌细胞并获得持续、稳定、高效表达。     

含MDR基因的人乳腺癌MCF7／pZMR多药耐药细胞株的构建

目的：肿瘤细胞的多药抗药民生（ＭＤＲ）是化学失败的主要原因之定，Ｐ－糖蛋白高表达是ＭＤＲ的主要机制，逆转ＭＤＲ成为肿瘤治疗亟待的问题。目前用于研究抗经性和筛选逆转抗药性药物的模型较少，本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法；采用基因工程技术，重组ＭＤＲ１基因ＣＤＮＡ于逆转录病毒载体ｐＺＩＲ－ＮｅｃＳＶ（Ｘ）的克隆位点，并用脂染胺介民的ＤＮＡ转移技术，将其转入包装细胞ＰＡ３１７中，收集含病毒子的培养上清     

转基因细胞SPC-A-1/IL-2的致突变性研究 *

目的：观察转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的致突变作用,为转基因肿瘤细胞作为瘤苗进行临床应用的安全性检测提供依据。方法：在人ＩＬ－２的ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ重组并完成ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ包装体系的基础上,将ＩＬ－２基因导入人肺腺癌胸膜转移细胞系ＳＰＣ－Ａ－１中并得到ＩＬ－２基因的稳定表达,然后通过遗传毒理学实验技术对转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的ＤＮＡ及培养上清液进行体内和体外的致突变性实验研究。结果：转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２的ＤＮＡ及培养上清液均未显出致突变作用。结论：转基因细胞ＳＰＣ－Ａ－１／ＩＬ－２作为瘤苗应用可初步视为是安全可靠的。     

重组人GM—CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定…

建立逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦ基因转移系统,为ＧＭ－ＣＳＦ基因悠我肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。应用基因重组技术将ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲｎｅｏ,获得重组载体ｐＤＯＲＧＭ。经脂质体介针其转染于病毒包装细胞系ＰＡ３１７细胞,经ＮＩＨ３Ｔ３细胞检测病毒滴度,ＮＩＨ３Ｔ３放大实验检测辅助病毒,并用同熵度病毒感染人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７。     

人肝癌细胞耐药模型-7721/Adm的建立及其部分生物学特性

目的：建立耐药肝癌细胞模型－７７２１／Ａｄｕ并研究其生物学特性。方法：应用人肝癌细胞株－７７２１（简称７７２１细胞株）,采用阿霉素（Ａｄｍ）高浓度间歇诱导法,建立耐药人肝癌细胞模型－７７２１／Ａｄｍ（简称７７２１／Ａｄｍ细胞株）。观察该细胞的生长规律;用ＭＴＴ法检测该耐药细胞模型的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药模型细胞周期中的分布,细胞表面多药耐药基因（ｍｄｒ）的表达产物Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）     

逆转录病毒载体介导人GM—CSF基因在HL—60白血病细胞的高效转…

探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性,为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７,获得重组逆转录病毒,将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞,经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群,应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移     

逆转录病毒载体介导人 GM-CSF 基因在 HL-60 白血病细胞的高效转移和表达

目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性，为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７，获得重组逆转录病毒，将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞，经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群，应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移并整合到ＨＬ－６０细胞基因组中，而未转基因和转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经ＰＣＲ检测未能扩增出特异性片段。经ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１检测，转基因细胞分泌的ＧＭ－ＣＳＦ生物学活性为６０～２００ｎｇ／ｍｌ（细胞１×１０６，培养２４小时），而未转基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞培养上清无ＧＭ－ＣＳＦ活性。结论逆转录病毒载体介导的ｈＧＭ－ＣＳＦ基因能在体外培养的人ＨＬ－６０白血病细胞中获得高效的转移和表达。     

树突状细胞与髓性白血病的免疫治疗 *

目的：我们应用逆转录病毒构建了ＩＬ－１２,Ｂ－７和ＧＭ－ＣＳＦ表达载体,以研究基因修的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法：将３种表达载体分别转染ＥＬ－４胞腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果：当接种子ＥＬ４／ＩＬ－１２细胞后,在Ｃ５７ＰＬ／６同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较ＥＬ４／Ｗｔ和ＥＬ－４／Ｎｅｏ组明显减少（Ｐ〈０．０１）。在ＥＬ４／ＩＬ－１２被排斥后,体内试验中诱发了实验动物抗