IL-12对CIK细胞体外增殖及体内外杀瘤活性影响的实验研究

目的 动态观察IL-12对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)体外增殖,体内外的细胞毒活性的影响.方法 采用三种不同的细胞因子组合扩增CIK细胞,即IL-2组:IFN-γ、CD3单抗、IL-1和IL-2;IL-2加IL-12组:IFN-γ、CD3单抗、IL-1、IL-2和IL-12;IL-12组:IFN-γ、CD3单抗、IL-1和IL-12.流式细胞术分析细胞表型,细胞计数法测定细胞的增殖.MTT法测定CIK体外细胞毒活性,并通过做扫描和透射电镜,对CIK细胞杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察.研究CIK细胞对BGC-823荷瘤裸鼠的体内抗肿瘤作用.结果 三种方法均可使细胞增殖能力显著增加,对CD3+CD56+细胞的诱导作用也无明显差异,IL-12与IL-2联合作用组促增殖能力和细胞毒性作用明显强于其他两组(P＜0.05).被CIK细胞杀伤的肿瘤细胞的死亡形式是坏死和凋亡.动物实验证实CIK有较强的体内抗瘤活性,可延长荷瘤鼠的生存期,联合IL-12与IL-2诱导的CIK细胞疗效较好.结论 IL-12同样可以用于CIK细胞的诱导,而联合IL-12与IL-2诱导的CIK细胞其增殖能力和体内外抗肿瘤活性均增强.     

CIK疗法对S180荷瘤小鼠的体内抗瘤作用的研究

为了研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体内抗肿瘤活性,本文选择了S180荷瘤鼠作为实验肿瘤动物模型来研究其体内抗肿瘤作用.首先建立了S180荷瘤鼠肿瘤模型,即实验组和对照组昆明鼠各接种2×10~5个S180细胞,两天后通过尾静脉、局部注射两种途径给予10~7/次CIK细胞抗肿瘤治疗,设LAK细胞治疗对照组和生理盐水对照组.经过2次/周共4次治疗,第5天后杀鼠取脾,计算抑率.结果可见,CIK静脉组及局部组的抑瘤率分别达57%和78%,与LAK对照组相比差异显著(P<0.01),并于治疗结束后解剖鼠肿瘤部位大体观察所见,CIK治疗组肿瘤块较光滑、较小、     

CIK细胞体内外抗肝癌细胞作用

目的：研究肝癌患者CIK（cytokine-induced killer) 细胞的体外杀伤自体肝癌原代细胞的细胞毒活性以及正常人CIK细胞在裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法：分别分离获得肝癌患者和下人的外周血单个核细胞（PBMC）,加入细胞因子,体外诱导成CIK细胞,用流式细胞仪对细胞作动态表型分析,并与正常人的CIK细胞作对比。用^51Cr释放法,测定肝癌患者的CIK细胞体外杀伤自体肿瘤细胞的细胞毒性活性。在Balb/c裸鼠皮下接种肝癌细胞BEL－7402,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用,并与LAK、PBMC细胞相对比。结果：肝癌患者的CIK细胞体外增殖力强,至培养28天时达到最大增值倍数300多,表型分析结果表明,CD^3 CD56^ 双阳性细胞得到了大量的扩增,其含量由原来的0．23％上升到第21天的17．8％。体外实验表明,肝癌患者的CIK细胞杀伤自体原代肝癌细胞的细胞毒性活性明显高于自体的PBMC细胞。裸鼠体内实验表明,肝癌患者的CIK细胞能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率可达84．7％,高于LAK细胞的52．8％及PBMC的37．1％（P＜0．05和P＜0．01）。结论：CIK细胞具有较强的体内外抗肝癌细胞活性,有可能应用于临床上肝癌的过继性免疫治疗。     

CIK细胞实验研究及治疗肿瘤的临床疗效观察

目的 研究CIK细胞体外增殖特性及对CIK细胞治疗肿瘤的临床疗效观察.方法 提取外周血的PBMC,第0天加入IFN-γ,第1天加入IL-2、抗CD3单抗和IL-1培养CIK细胞,用流式细胞仪进行表型测定,并与LAK细胞进行比较;静脉输注CIK细胞对43例肿瘤患者进行治疗.结果 体外培养5 d后,CIK扩增倍数明显高于LAK细胞,表型分析发现CIK细胞中杀伤作用细胞CD8和CD3+CD56+的比例分别为70.9%和36.9%,LAK细胞为50.6%和1.63%,CIK细胞治疗肿瘤的总有效率为32.6%;治疗过程中的主要毒副反应是发热,占治疗总人数的20.9%.体温37.5～38.5℃,发热在2 h内自动缓解.结论 CIK细胞治疗肿瘤是一种安全有效的方法.     

CIK细胞体内外抗宫颈癌HeLa细胞活性的研究

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞的体内外抗宫颈癌HeLa细胞活性。方法：收集8名健康献血者和8名宫颈癌患者的新鲜外周血,分别通过常规方法分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,应用相应细胞因子体外诱导分化出CIK细胞,动态观察CIK细胞的体外增殖活性、细胞表型和对HeLa细胞的杀伤活性;在BALB/c裸鼠皮下接种效应细胞,观察宫颈癌患者CIK细胞对接种HeLa细胞的荷瘤鼠的抑瘤作用,同时设淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells,LAK）和PBMC细胞作为对照。结果：源于健康人和宫颈癌患者的CIK细胞间的增殖活性无明显区别（P〉0.05）。表型分析结果表明,两种来源的CIK细胞中CD3~＋CD56~＋双阳性细胞均得到了大量扩增,宫颈癌患者CIK细胞中CD3~＋CD56~＋双阳性细胞在实验开始前约占0.13%,到实验后第28天上升到25.8%。体外实验表明,宫颈癌患者的CIK细胞杀伤宫颈癌HeLa细胞的细胞毒活性明显高于PBMC细胞。裸鼠体内实验表明,宫颈癌患者CIK细胞能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率可达80.6%,高于LAK细胞的59.1%和PBMC细胞的38.3%（P〈0.01）。CIK治疗后肿瘤体积明显比空白对照组缩小（P〈0.05）。结论：宫颈癌患者CIK细胞具有较强的体内外抗宫颈癌细胞活性,有可能用于临床上宫颈癌的过继性免疫治疗。     

健康人和胃癌患者组织中CIK细胞抗肿瘤作用的观察

目的:探讨健康人和胃癌患者细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对原代癌细胞的体外抗肿瘤作用的差异,进一步了解CIK细胞的抗肿瘤作用。方法:分离健康人和胃癌患者自身的外周血单个核细胞,分别加入鼠抗人CD3 McAb、基因重组人IL-1α、IFN-γ、IL-2,经体外培养诱导为CIK细胞;手术留取的新鲜胃癌组织用机械研磨法分离成单细胞悬液;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测2种CIK细胞对胃癌细胞的杀伤活性。结果:健康人的CIK细胞较胃癌患者自身的CIK细胞的体外增殖力强,第1天表达CD3+/CD56+的细胞健康人占(1.064±0.22)%,癌患者占(1.031±0.13)%;而经细胞因子刺激后的第7天健康人占(28.66±2.00)%,癌患者占(17.63±2.22)%;14 d后分别占(57.14±1.96)%和(48.53±2.19)%(P<0.05);其杀伤肿瘤的能力也远远高于患者自身的杀伤能力。结论:健康人和胃癌患者的CIK细胞对原代癌细胞都有细胞毒的作用,健康人的CIK细胞无论增殖能力和细胞毒的活性都远高于肿瘤患者自身的CIK细胞。     

细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗胶质瘤实验研究

目的：研究正常人细胞因子激活的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）对人脑胶质瘤细胞系U251的体外细胞毒活性，以及对脑胶质瘤裸鼠移植模型的体内抗肿瘤作用。方法：取正常人外周血单个核细胞（pefipheral blood mononuclear cell，PBMC），通过多种细胞因子体外诱导成CIK细胞，用流式细胞仪对细胞作动态表型分析。用LDH法测定CIK细胞体外对U251的杀伤率，利用无胸腺裸小鼠U251细胞皮下移植瘤模型观察CIK细胞体内抑瘤作用。结果：CIK细胞在培养2周左右获得大量增殖，CD3^＋／CD56^＋双阳性细胞大量增殖〉1000倍。体外实验证明，CIK细胞对U251有明显的细胞毒活性；体内实验表明，CIK细胞能够显著抑制Balb／c裸鼠皮下移植瘤的生长，其抑瘤率可达50％。结论：CIK细胞是一种新型和高效的免疫活性细胞，具有较强的体内外抑制胶质瘤生长的作用，有可能用于临床上脑胶质瘤的过继性免疫治疗。     

Polyporus sp.MO5多糖的抗肿瘤作用

目的研究真菌Polyporus sp.M05多糖PSM-a体内对荷瘤小鼠S180的抑瘤作用及其机制.方法 MTT法检测PSM-a体外对S180细胞株的增殖抑制作用.建立S180小鼠模型,灌胃治疗,每日检测肿瘤体积并计算瘤体比和抑瘤率.实验结束后处死小鼠,MTT比色法测定小鼠自然杀伤(NK)细胞及淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)的杀伤活性.HE染色检测肿瘤组织细胞坏死情况.结果 PSM-a在体外能抑制S180细胞生长;在体内能显著降低荷瘤小鼠的瘤重和瘤体比,250μg/ml的PSM-a对肿瘤抑制率高达80%以上;PSM-a能促进NK细胞及LAK细胞的杀伤活性;病理切片显示PSM-a作用后引起肿瘤组织坏死.结论 PSM-a对S180荷瘤小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用,其机制可能与提高机体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性有关.     

可溶性结肠癌抗原与CD3mAb,IL-2联合诱导杀伤细胞的实验研究

IL-2诱导体外杀伤细胞扩增慢,高依赖IL-2,特异性差,影响了其疗效的发挥.根据报道CD3mAb与IL-2在杀伤细胞的诱导过程中有增强作用.为了获得具有高效,特异细胞毒活性的抗肿瘤效应细胞,我们采用CD3mAb、IL-2与可溶性肿瘤抗原(结肠癌抗原)联合诱导正常人外周血单个核细胞获得相对特异的杀伤细胞(TAK),并对TAK与LAK在增殖活性、杀伤活性及表型上进行了对比.     

冻存外周血干细胞扩增CIK细胞及其体外的抗肿瘤效应

目的:探讨患者冻存外周血干细胞体外诱导CIK细胞的增殖能力、表型特征及其对B细胞淋巴瘤细胞系的杀伤效应.方法:复苏患者冻存外周血干细胞悬液,Ficoll密度梯度方法分离单个核细胞及从健康人新鲜外周血分离单个核细胞,经IFNr、IL-2、CD3McAb诱导培养获得CIK:细胞.细胞计数板观察CIK细胞增殖能力;流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞区分效应细胞,PI染色,FACS检测靶细胞死亡率.结果:患者冻存外周血干细胞来源的CIK细胞较健康人增殖速度慢,最大增殖倍数低,但CD3+CD56+细胞比例与健康人差异无统计学意义,分别为(16.14±8.49)%和(17.52±3.30)%,P=0.744.患者及健康人CIK细胞与相应的诱导培养前单个核细胞相比,杀伤活性明显增强,在效靶比10:1时患者及健康人CIK细胞对Daudi细胞的杀伤活性为(29.23±8.85)%、(20.13±2.36)%,与培养前相比P值分别为0.004、0.001;患者CIK细胞杀伤活性强于健康人,P=0.05.结论:患者冻存外周血干细胞可以诱导生成具有抗肿瘤活性的CIK细胞,为其临床应用提供了实验依据.     

CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.     

共培养的树突细胞和CIK细胞对肺癌的体内外抑癌作用

背景与目的:细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller,CIK)细胞是高效的肿瘤杀伤细胞。树突细胞(dendriticcells,DCs)是体内最强的抗原递呈细胞,并且能够提高效应细胞的抗瘤活性。本实验将DCs和CIK细胞共培养观察DCs对CIK细胞的细胞表型、增殖活性及体内外的抗肺癌作用的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导出DCs、CIK细胞后,将DCs和CIK细胞按1∶10比例共培养5天获得DC-CIK细胞。流式细胞仪测DC-CIK细胞表型变化,3H-TdR掺入法测定其体外的细胞毒活性,并用肺腺癌细胞株A549建立裸鼠模型观察DC-CIK体内的抗肿瘤效果。结果:在培养第14天,DC-CIK细胞与单独CIK细胞培养组相比,增殖速率提高[(17.0±1.8)倍vs.(10.9±2.0)倍,P<0.05],CD3 CD56 表达水平明显上调[(36.0±4.2)%vs.(25.7±2.9)%,P<0.05],同时对A549细胞的细胞毒活性明显增强(P<0.05)。裸鼠体内实验表明,接种肺癌细胞51天后DC-CIK组、CIK组的抑瘤率分别为62.9%、41.5%,与对照组相比DC-CIK组及CIK组均抑制裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01),且DC-CIK组与CIK组抑瘤效应差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DCs与CIK细胞共培养可使CIK细胞获得更高的增殖活性和更强的抑癌作用。     

脐血CIK细胞的体外增生及其抗肿瘤效应

 【摘要】　目的　研究脐血CIK细胞体外增生活性及对肿瘤细胞的杀伤活性，为CIK细胞在肿瘤过继免疫治疗中的应用提供实验依据。方法　脐血经密度梯度离心获得单个核细胞，以CD3单抗、重组人白细胞介素-2（rhIL-2）、重组人白细胞介素-1（rhIL-1）和重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）为诱导剂制备多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。并设只加IL-2诱导成的LAK细胞和未加细胞因子的脐血单个核细胞（CBMNC）作为对照。培养前后分别用显微镜观察细胞形态，流式细胞术测定细胞表型的改变，锥虫蓝拒染法测定细胞增生水平，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定对肺癌细胞的杀伤活性。结果　实验发现，通过细胞因子的联合，可大量诱导出高活性的CIK细胞，CIK细胞在培养的第5天开始增生，第14天达到高峰，增生的细胞表型以CD+3 CD+56细胞为主。而LAK细胞的增生高峰出现在第7天，随后增生不明显；CBMNC表型无明显变化，增生不明显。CIK细胞针对肿瘤细胞的体外杀伤活性高于LAK细胞和CBMNC。结论　在体外细胞因子的联合作用下脐血能成功地诱导出大量的CIK细胞。脐血CIK细胞体外扩增快，杀伤活性强，对肿瘤细胞的作用优于传统的LAK细胞，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了一个新的方向。     

体外扩增CIK细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901

目的：观察CIK细胞增殖情况,了解扩增后的最佳应用时机,并观察体外对SGC-7901的杀伤作用。方法：健康人外周血单核细胞（PBMC）在体外条件下经过多种细胞因子的共同刺激诱导成CIK细胞,计数培养不同时间的CIK细胞,用流式细胞术检测CIK细胞的表型特征。用MTT法检测杀伤活性,对比CIK细胞与5-FU对SGC-7901的杀伤作用,并观察了两者联合应用的效果。结果：CIK细胞随体外培养时间的延长,数量及杀伤活性均增加。体外培养20d增殖124倍,CD3^＋、CD56^＋双阳性细胞的比例达66．1％,其后两者数量增长缓慢;体外实验显示CIK细胞对胃癌SGC-7901细胞株有明显的杀伤作用,最高杀伤效率为73．13％,其杀伤作用优于5-FU,P〈0．05。二者联合应用杀伤作用降低。结论：CIK细胞具有较强的抗胃癌细胞活性;体外培养15～20d时应用较为合适;联合应用时5-FU可降低CIK细胞的杀伤效率。     

特异性转移因子对荷瘤早期和晚期小鼠细胞免疫功能及生存期的影响

目的研究特异性转移因子（ＳＴＦ）对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法在小鼠腹腔内接种Ｓ１８０细胞同时腹腔注射５１８０－ＳＴＦ，测定天然杀伤（ＮＫ）和淋巴因子激活的杀伤（ＬＡＫ）活性、淋巴细胞转化（淋转）、ＬＡＫ特异杀伤活性及生存期。结果荷瘤小鼠ＮＫ和ＬＡＫ活性及淋转较正常小鼠明显低下（分别为１４．５５％±７１３％、１３．８２％±６．６４％、４４．１５±６．９４ＳＩ；２７．７４％±６．６７％、２９．３８％±９．１６％、６９．１４±７．６７ＳＩ），生存期明显缩短（分别为１７．５０±２．００ｄ和＞４５ｄ）。在荷瘤同时应用５１８０－ＳＴＦ，可部分阻止ＮＫ和ＬＡＫ活性及淋转的下降（分别为１８．６４％±７．１８％、２２．８４％±７．２２％和５３．０３±９．１５ＳＩ），延长生存期（２６．２５±４．４０ｄ），还可明显诱导ＬＡＫ特异活性。荷瘤３天后应用５１８０－ＳＴＦ，仅能部分诱导ＬＡＫ特异活性，不能延长生存期。结论ＳＴＦ可能有助于阻止癌前病变向癌转化，而对晚期肿瘤效果不佳。     

The CIK cells stimulated with combination of IL-2 and IL-15 provide an improved cytotoxic capacity against human lung adenocarcinoma

Generation of cytokine-induced killer (CIK) cells is an emerging approach in adoptive donor lymphocyte infusion for patients with a wide range of tumors. However, our previous in vitro studies have shown that the killing efficacy of CIK cells against lung cancer was lower than other tumor cells, while the underlying mechanisms are not clear. We explored the feasibility to improve CIK cells mediated cytotoxicity against lung cancer. Interleukin (IL)-15 is a pleiotropic cytokine that stimulates cytolytic activity and cytokine secretion of NK cells, which may enhance the cytotoxic activity of CIK cells. In this study, we intended to stimulate the CIK cells by IL-2 in combination with IL-15 in cell expansion to achieve enhanced cytotoxicity against lung cancer cells. The different phenotypes of IL-2 or combination of IL-2 and IL-15 stimulated cytokine-induced killer cells were determined, and the improved cytotoxicity of IL-2 and IL-15 induced CIK cells against lung adenocarcinoma were evaluated both in vitro and in vivo. CIK cells stimulated with both IL-2 and IL-15 has shown greater proliferative potential than CIK cells treated with IL-2 alone. IL-15 induction also has driven the expansion of CD3+CD56+ subset and significantly enhanced cytotoxicity against tumor cells. Further analysis has demonstrated that CIK_IL-2&_IL-15 injected mice models have shown significant tumor regression and lower expression level of CyclinD1 in tumor tissue. This study has provided preclinical evidences that CIK_IL-2&_IL-15 with enhanced cytotoxicity may offer alternative treatment option for patients with lung cancer.     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。     

人LAK细胞在体外和裸鼠体内抗人肺巨细胞癌（PG）的研究

Human LAK cells were prepared by culturing normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with or without rIL-2 and assayed for T cell surface markers as well as anti-tumor activity against PG in vitro and in nude mice. Although the percentages of T3, T4 and T8 positive cells in rIL-2-activated cells did not differ significantly from those of control cells in vitro, the former showed stronger cytotoxicity than control cells to PG tumor cells in vitro. In vivo, LAK cells completely inhibited the growth of PG tumor in nude mice, whereas PBMC control cells were of no effect. The anti-tumor effect of human LAK cells in nude mice may offer a useful model to study the role of human LAK cells against human tumor in vivo.