星形胶质细胞的神经干细胞特性

胶质细胞是脑内数量最多的细胞,它与神经元之间的相互联系是在发育期就精确建立的。不同神经元的功能已有较深入的研究,与之相比,胶质细胞仍是非常神秘的细胞,特别是星形胶质细胞,除了对神经元提供重要的结构、代谢、营养支持外,它与神经元之间复杂的相互联系仍不清楚。本文将对星形胶质细胞作为神经干细胞／祖细胞这一最新发现作一综述。     

来源于大鼠脊髓星形胶质细胞的神经干细胞的增殖分化特性

目的:通过研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在A-NSC培养中的作用来观察其增殖特性;通过添加血小板生长因子PDGF-AA作为诱导因子来研究A-NSC分化的特性。方法:将A-NSC分四组:bFGF+EGF添加组,bFGF添加组,EGF添加组和对照组进行培养,通过形态观察和流式细胞仪检测细胞周期。同时添加PDGF-AA诱导A-NSC分化,以自然分化为对照组,通过免疫荧光染色观察比较其各类细胞分化比例的差异。结果:可观察到A-NSC在bFGF添加组和bFGF+EGF添加组有正常的分裂周期,而EGF添加组和对照组的细胞几乎都停滞在G0/G1期,显示其增殖受到阻滞;诱导实验检测到对照组细胞的分化比例分别为神经元(89.0±4.2)%,星形胶质细胞(4.6±3.2)%,少突胶质细胞(7.6%±2.5%),具有很高的神经元分化比例;诱导组细胞的分化比例分别为神经元(80.6±4.1)%,星形胶质细胞(3.0±1.3)%,少突胶质细胞(20.6±1.8)%,诱导组分化成少突胶质细胞的能力有显著提高(P<0.001)。结论:在A-NSC的生长过程中,bFGF对A-NSC的增殖起重要作用,在本实验条件下A-NSC倾向于向神经元分化,同时PDGF-AA能够显著诱导A-NSC分化成少突胶质细胞。     

星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的保护作用

为了探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对缺氧损伤神经元的保护作用,本实验将新生的KM小鼠的皮层星形胶质细胞分离、纯化并传代培养第三代第5d后,将星形胶质细胞(Ast)条件培养液,加入到缺氧损伤的神经元细胞培养液中,观测其对缺氧神经元的存活及其合成和释放一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)和胞膜ATP酶(ATPase)的影响。结果显示:10%和20%ACM对神经元存活有明显促进作用;与对照组相比,20%ACM还有效地减少了缺氧神经元NO、LDH的生成和分泌,保护和提高了ATPase的活性。以上结果提示ACM促进缺氧神经元的存活,其机制可能与减少NO、LDH合成释放及保护细胞膜上ATPase的活性有关。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

激活的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白及其对海马神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨切割穹隆海马伞的侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（CLU）及体外CLU诱导海马神经干细胞分化为神经元的情况。
方法 分别用切割穹隆海马伞的海马提取液、正常海马提取液、DMEM/F12 培养基培养星形胶质细胞,制备切割12h、24h、48h组,正常组和对照组条件培养基;ELISA检测比较不同条件培养基中CLU蛋白的浓度;体外细胞培养采用CLU诱导海马神经干细胞分化,设诱导组和空白对照组,7d后通过微管相关蛋白2（MAP-2）免疫荧光及Hoechst标记观察海马神经干细胞向神经元的分化情况。 结果 正常组和对照组条件培养基中CLU浓度较低,约为（0.1037±0.0119）ng/L和（0.1170±0.0078）ng/L;切割组12h、24h、48h条件培养基中其浓度明显增高,分别为（0.1940±0.0364）ng/L、（0.4250±0.0724）ng/L和（0.2903±0.0472）ng/L,以24h组最高,约为正常组和对照组的4倍。CLU诱导组中MAP-2阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.05）,其占总细胞数的百分比分别为(11.67±2.57)%和（4.52±1.54）%,且诱导组中MAP-2阳性细胞突起更长、更丰富。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞可分泌更多的CLU,体外细胞培养中CLU可促进海马神经干细胞向成熟的神经元分化。     

TNFα刺激的星形胶质细胞条件培养液对海马神经元的兴奋作用

目的:探讨肿瘤坏死因子-α刺激的星形胶质细胞对神经元的作用。材料和方法:体外纯化培养大鼠海马星形胶质细胞,采用反相高效液相法测定TNFα刺激后细胞培养液内谷氨酸的含量;将TNFα刺激后的星形胶质细胞条件培养液（Astrocytic Conditioned Medium,ACM）作用于培养的海马神经元,运用免疫细胞化学方法和图像分析技术研究神经元NF-κBp65和谷氨酸的表达。结果:（1）TNFα可明显促进星形胶质细胞释放谷氨酸;（2）ACM作用15min即可诱导神经元NF-κBp65的核表达,30min达高峰,180min恢复至对照水平;（3）ACM作用60min可使谷氨酸免疫反应阳性神经元平均光密度明显升高,持续至240min。结论:TNFα刺激的星形胶质细胞可通过释放谷氨酸等可溶性物质使神经元快速激活、兴奋性升高。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

星形胶质细胞来源细胞外囊泡促进大鼠神经干细胞向神经元的分化

背景：神经干细胞具有向神经元分化的潜能,已有报道表示星形胶质细胞与神经元存在密切联系,而有关星形胶质细胞来源细胞外囊泡是否具有促进神经干细胞向神经元高效分化的作用,仍未见相关报道。目的：探索星形胶质细胞来源细胞外囊泡诱导促进神经干细胞向神经元分化的可能性。方法：(1)体外培养大鼠神经干细胞及星形胶质细胞,行细胞形态及免疫荧光鉴定,进一步提取星形胶质细胞来源细胞外囊泡,并通过透射电镜、粒径分析、Western blot等方法进行鉴定;(2)将第3代神经干细胞分2组,分别加入同体积的PBS、星形胶质细胞来源细胞外囊泡(质量浓度为1 mg/mL)干预6 d;(3)通过免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测星形胶质细胞来源细胞外囊泡干预后神经元标志物的表达水平。结果与结论：(1)显微镜下神经干细胞形态为球形,以细胞团状分布,免疫荧光示特征性标志物CD133、Nestin呈高表达水平;(2)显微镜下星形胶质细胞形态为不规则星状,且免疫荧光示特征性标志物胶质纤维酸性蛋白呈高表达水平;(3)星形胶质细胞来源细胞外囊泡形态近似圆形或椭圆形杯状,动态光粒子散射仪显示直径在10-200 n...     

星形胶质细胞条件培养液促进胚胎干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨星形胶质细胞条件培养液在体外能否促进胚胎干细胞（ESCs）向神经元方向分化。 方法:在Bain等建立的4-/4+方案基础上，分成两组：单用ATRA组和ATRA联合胎脑星形胶质细胞条件培养液组，分3阶段诱导ESCs定向生成神经元样细胞。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；免疫组化染色法检测nestin、GFAP、NSE和NF-200的表达对诱导过程进行动态监测。 结果:（1）体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向3胚层分化的能力。（2）在诱导分化阶段，联合诱导组分化细胞NF-200和NSE的表达阳性率高于单用ATRA组。（3） 联合诱导组最终诱导ESCs生成纯度高达73.5%神经元样细胞。 结论:采用胚胎脑星形胶质细胞条件培养液可较高产率及纯度地促进ESCs生成神经元样细胞，值得推广应用。     

缺氧对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨单纯性缺氧对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法将36只新生1d大鼠随机均分为N组(正常对照组)、Q2组(缺氧2h组)、Q5组(缺氧5h组)。将海马组织在无血清培养液(均含有碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF和白细胞抗原B27)中,分别进行原代培养、单克隆培养和传代培养,单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)和Hoechst33342免疫荧光双标染色;传代培养的细胞传三代诱导分化,诱导分化3d的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Hoechst3342免疫荧光双标染色,计数NSE阳性细胞比例,进行统计学分析。结果单克隆培养的细胞均呈Nestin阳性表达,诱导分化的细胞部分呈NSE或GFAP阳性表达。Q2组、N组、Q5组细胞原代培养克隆球直径达2μm的时间分别为7d、10d、13d。传3代后,对各组细胞进行诱导分化,Q2组细胞诱导分化为神经元的比例明显高于N组,Q5组的细胞诱导分化为神经元的比例明显低于N组。结论短时间缺氧可促进在体海马神经干细胞增殖和诱导其向神经元分化,长时间缺氧则抑制在体神经干细胞增殖和向神经元分化。     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞和星形胶质细胞分化的研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化成神经细胞或星形胶质细胞。方法使用四种不同的诱导方式来处理BMSCs:-巯基乙醇(BME)、维甲酸(RA)、无血清培养基以及和新生鼠的脑星形胶质细胞共培养。结果四种方法处理后,BMSCs都能表达神经细胞标示物MAP2或星形胶质细胞标志物GFAP,并伴随着明显的细胞形态的改变。用RA诱导以及在无血清的培养基中培养,BMSCs主要分化成神经元样细胞,表达神经元的标志物MAP2,并且BME能促进这个过程。但在和星形胶质细胞共培养后,BMSCs主要分化成GFAP+细胞。结论BMSCs依赖于不同的诱导条件,具有分化成神经细胞或星形胶质细胞的可塑性。     

胰岛素对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素对大鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法培养大鼠大脑皮层NSCs,用胰岛素作用于培养的NSCs,3H-TdR掺入检测NSCs的增殖,免疫细胞化学和流式细胞仪检测NSCs的分化。结果胰岛素能明显促进NSCs对3H-TdR的摄入,明显促进细胞的增殖,并且胰岛素促细胞增殖作用具有一定的量效关系;免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示,胰岛素对NSCs向神经元的分化有明显促进作用,并且NSCs分化后多巴胺能神经元数目明显增加。结论胰岛素可能具有促进NSCs增殖和向神经元包括多巴胺能神经元分化的作用。     

异丙酚促进体外培养的成年大鼠海马神经干细胞增殖

目的异丙酚对于成年神经干细胞增殖能力的影响目前尚不明确,本研究对异丙酚对体外培养的大鼠成年神经干细胞的作用及其可能的分子机制进行了研究。方法体外培养的大鼠成年神经干细胞给予BrdU后,分别用10、50、100μg/ml的异丙酚进行处理,并同时设立溶媒对照和空白对照。24h后,采用免疫染色显示BrdU阳性细胞,DAPI复染细胞核。细胞存活率采用细胞计数法和MTT法测定。人工计数BrdU阳性细胞和固缩细胞核的比例。用Fura2-AM检测胞浆内Ca2＋浓度。分别用免疫荧光和免疫印迹法检测细胞内CREB和磷酸化CREB的表达位置和水平。结果低浓度（10μg/ml）异丙酚不能促进大鼠成年神经干细胞的增殖,而中浓度（50μg/ml）和高浓度异丙酚（100μg/ml）则呈剂量依赖性的促进其增殖。异丙酚提高了BrdU阳性细胞的比例。细胞死亡率在处理前后维持在低水平上（〈2%）。异丙酚显著提高了大鼠成年神经干细胞胞浆内的游离Ca2＋浓度。异丙酚处理前后,大鼠成年神经干细胞均能表达CREB和磷酸化CREB,但是异丙酚干预后,大鼠成年神经干细胞内磷酸化CREB表达水平显著增高。结论异丙酚可促进体外培养的大鼠成年神经干细胞的增殖水平,这是细胞存活率升高的主要原因,可能与胞浆内Ca2＋浓度以及CREB磷酸化水平的升高有关。     

不同胎龄大鼠大脑神经干细胞的分布比较

目的探讨正常状态下不同胎龄大鼠神经干细胞(neural stemeells,NSCs)在大脑中的分布。方法将孕鼠随机分为胎龄11天组、15天组和19天组,用免疫组织化学方法检测其大脑神经干细胞中的巢蛋白(Nestin),经图像分析比较其差异。结果胎龄11天组Nestin阳性细胞分布于整个神经管上皮层,随着胎龄的增加,Nestin阳性细胞主要在室管膜上皮层,细胞数逐渐增加,并向周围迁移;结论大鼠在正常胚胎发育过程中,随着胎龄的增加,其脑室室管膜及室管膜下区神经干细胞逐渐增多。     

Nestin-Expressing Cells in the Human Hippocampus

Nestin, a protein of the intermediate filament family, is typical of undifferentiated neural stem and progenitor cells. The present report describes studies of nestin expression in the hippocampus of patients with epilepsy and identifies five types of nestin-immunopositive cells differing in terms of their morphological phenotype and immunological characteristics. These were cells with the phenotype of radial glial cells, bipolar cells, small dendritic cells, cells of the subependymal zone, and astrocyte-like cells. Two types of cell — radial gliocytes of the dentate fascia and NG2-immunopositive bipolar cells — can be regarded as neural precursors of different levels of commitment. __________ Translated from Morfologiya, Vol. 126, No. 6, pp. 19–25, November–December, 2004. Director: Professor A. A. Sosunov Director: Professor R. Solomon     

Development of Neural Stem/Progenitor Cells from Human Brain by Transplantation into the Brains of Adult Rats

The aim of the present work was to study human neural stem/progenitor cells (SPC) cultured in vitro and their potential to survive, migrate, and differentiate after transplantation into adult rat brain. SPC were extracted from the brains of nine-week human embryos and were cultured in selective medium for three weeks. Transplantation was with suspensions of cells or whole neurospheres; these were studied four weeks after transplantation into the hippocampus, striatum, and lateral ventricles of adult rats. Analysis of transplanted cells was based on various histological and immunohistological staining methods: bisbenzimide, bromodeoxyuridine, and antibodies to human nuclei, vimentin, beta-tubulin, neurofilaments, and glial fibrillar acidic protein, which allowed us to make independent assessments of their state and differentiation. Transplanted SPC from human brains survived well for one month in all areas of adult rat brain without immunosuppression. Cells from suspension transplants migrated intensely and differentiated into neurons and gliocytes. At the same time, transplants of whole neurospheres showed limited or no migration because of the development of a glial barrier.