植物生长调节剂对东北矮紫杉愈伤组织中次生代谢物质的影响

目的 使用植物生长调节剂提高东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量.方法 以东北矮紫杉幼茎为外植体,运用正交试验优选NAA、2,4-D和6-BA 3种植物生长调节剂组合培养植物愈伤组织,HPLC法测定愈伤组织中紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量.结果 植物生长调节剂对东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成的影响顺序是:NAA>6-BA>2,4-D.结论 利用东北矮紫杉愈伤组织培养生产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的最佳培养基为:B5+NAA 2.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L.     

美丽红豆杉枝叶中抗肿瘤活性成分的提取与分离

以美丽红豆杉的枝叶为原料,采用一种新的方法提取和分离用以合成高效抗癌药紫杉醇所需的前体———10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ),并对10-DABⅢ的提取、分离、纯化条件进行了优化筛选。采用该工艺方法得到的10-DABⅢ晶体纯度可达91%,得率也在70%以上,从而证实了该工艺路线在生产上是可行的。     

培养基成分对云南红豆杉细胞生长和产生乙酰巴卡亭Ⅲ的影响

目的 研究B5培养基主要成分对云南红豆杉Taxus yunnanensis细胞生长和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响.方法 利用植物组织培养技术结合HPLC分析手段,通过改变B5培养基中CaCl2、NaH2PO4、(NH4)2SO4和KNO3的质量浓度,研究其对云南红豆杉细胞生长及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ量的影响.结果 试验组与对照品相比,B5培养基中高质量浓度的NaH2PO4能够显著促进云南红豆杉细胞生长,CaCl2、(NH4)2SO4和KNO3浓度对细胞生长无显著影响;B5培养基中低质量浓度的CaCl2、NaH2PO4、(NH4)2SO4和KNO3能够显著促进10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成与释放.结论 B5培养基中NaH2PO4为300 mg/L时,能够显著促进云南红豆杉细胞生长,细胞生长最是对照的1.2倍,CaCl2、(NH4)2SO4和KNO3分别在75～300、134～268和2 500～5 000 mg/L对细胞生长无显著影响;B5培养基中CaCl2、NaH2PO4、(NH4)2SO4和KNO3的质量浓度分别为75、75、33.5、625 mg/L时,能够显著促进细胞中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成与释放,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量分别是对照的1.5、1.4、2.4倍.     

云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定

目的 建立以固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量.方法 固相萃取柱:Agilent ODS C18 500 mg/3 ml;色谱柱:Agilent zorbax SB-C18( 250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:甲醇-水-乙腈(35∶55∶10),流速1.0 ml·min-1,检测波长227 nm,柱温30℃.结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在 1.6～8.0 μg·ml-1范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为96.8%,RSD为 4.8 %(n= 6).结论 该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定,方法稳定,结果准确、可靠.     

云南红豆杉生长过程中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量变化

目的 研究云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl baccatinⅢ)的含量变化.方法 采用色谱柱Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(42∶13∶45),流速1.0 ml·min-1,柱温32℃,检测波长234 nm,测定云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量.结果 回归方程 Y = 15.290 29X -4.059 76 (r = 0.999 0),线性范围5.50～550 μg·ml-1;加样回收率(n=6)98.6%,RSD为2.4%.在云南红豆杉生长期树皮中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量高于枝叶,是枝叶中最高含量的1.498倍;休眠芽分化期和休眠期是10-去乙酰巴卡亭Ⅲ积累的关键时期,在枝叶中的含量显著高于树皮,最高含量达0.115 0%是树皮中最高含量的1.769倍,二年生枝叶中含量略高于一年生枝叶.结论 该方法简便、准确度高,可用于云南红豆杉枝叶的质量控制.     

基于指纹图谱结合化学模式识别对不同发酵程度曼地亚红豆杉曲的质量评价

目的 建立曼地亚红豆杉Taxus × media曲指纹图谱,对曼地亚红豆杉曲质量控制和资源开发提供科学依据。方法 采用HPLC法建立45批曼地亚红豆杉曲的指纹图谱,通过对照品比对,对共有峰进行指认,确定并建立7种有效成分含量的测定方法。在指纹图谱基础上,结合聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘法-判别分析等筛选出不同发酵程度曼地亚红豆杉曲间差异性标志物。结果 45批曼地亚红豆杉共有32个共有峰,指认了18种成分,相似度均大于0.9。通过聚类分析将不同发酵程度曼地亚红豆杉曲分为5类,主成分分析提取了4个主成分;综合分析筛选10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇、7-表紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮作为曼地亚红豆杉曲的质控成分,质量分数范围分别为0.071 5～0.123 7、0.124 5～0.117 1、0.113 5～0.126 1、0.122 5～0.162 7、0.071 0～0.089 3、0.809 1～1.110 2、1.003 1～1.994 8 mg/g。结论 建立的指纹图谱及多成分含量测定方法专属性强,稳定,可靠,为曼地亚红豆杉曲的质量控制及资源开发提供参考。     

云南红豆杉化学成分研究

从云南红豆杉的树皮中分离得到4个紫杉烷类二萜化合物及1个黄烷醇类化合物。根据理化常数及光谱分析确定为紫杉醇C-7-木糖甙,紫杉醇B,10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ,紫杉素及2R,3R-儿茶精。     

不同产地及生长年限曼地亚红豆杉中10-脱乙酰基巴卡亭III、三尖杉宁碱、紫杉醇量的比较分析

目的 分析和比较5个不同产地、不同生长年限曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量的差异。方法 利用甲醇和三氯甲烷混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和比较10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ）、三尖杉宁碱和紫杉醇量及3者总量。结果 不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类及其总量间存在极显著性差异（P < 0.01）;10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇和3种紫杉烷类总量相对较高的3个产地及生长年限分别依次为HK4 > SM3 > SM2、ZL3 > HK4 > ZL4、ZL3 > SM2 > HK4、HK4 > ZL3 > ZL6。除10-DAB Ⅲ与三尖杉宁碱量间不存在显著的相关性外,其余各成分间均存在极显著的正相关关系（P < 0.01）;不同产地及生长年限间紫杉醇与3种紫杉烷类总量间呈现出同升同降的趋势;聚类分析表明福建福州产区紫杉醇量具有一定的特殊性,而河南开封3种紫杉烷类总量有别于其他产区。结论 产地和生长年限对曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类量的变化具有明显的影响,可以通过对生物合成途径进行调控,继而达到获得更多紫杉醇原料药的目的。     

紫杉醇前体化合物10-去乙酰baccatin Ⅲ和baccatin Ⅲ在东北红豆杉中的含量

报道了不同生长年限、不同生长形态和不同生长部位的东北红豆杉样品中紫杉醇的前体化合物baccatinⅢ和10-去乙酰baccatinⅢ的含量测定结果。通过相同样品中紫杉醇含量及云南红豆杉中两个化合物含量的比较，对利用价值进行了讨论。     

朝鲜产东北红豆杉树皮中紫杉烷类成分的研究

目的研究朝鲜产东北红豆杉树皮中紫杉烷类的化学成分。方法采用乙醇提取、液-固萃取以及硅胶柱色谱分离,通过理化常数和光谱分析鉴定化合物的结构。结果从朝鲜产东北红豆杉的干燥树皮中分得8个化合物。经理化性质及波谱分析,鉴定了其中的7个化合物的结构,分别为紫杉醇(taxol,Ⅰ)、三尖杉宁碱(cephaolman-nine,Ⅱ)、7-表-紫杉醇(7-epi-taxol,Ⅲ)、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ,Ⅳ)、7-木糖基-紫杉醇(7-xylose-taxol,Ⅴ)、2-deacetoxydecinnamoyl taxinine J(Ⅵ)、β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅶ)。结论化合物Ⅰ~Ⅶ为首次从朝鲜产东北红豆杉树皮中分得,化合物Ⅵ为首次从该种植物中分得。     

基于RAPD的福建产南方红豆杉遗传多样性研究

目的对福建省23个不同地理种源的南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei进行分析,以揭示其种源和种群的遗传多样性,为南方红豆杉资源的收集与保护提供一定的理论依据。方法利用RAPD分子标记技术,对福建省23个不同地理种源的南方红豆杉的遗传多样性进行分析。结果物种水平上的观测等位基因数(Na)为1.974 4,有效等位基因数(N_e)为1.603 8,Nei’s基因多样性指数(H)为0.351 3,Shannon多样性指数(I)为0.522 8。不同种源的南方红豆杉的遗传多样性相对较高。通过对种源和种群的遗传多样性分析,发现23个不同种源的南方红豆杉的遗传距离变化幅度为0.240 4~0.912 0,遗传相似度的变化幅度为0.401 7~0.786 3。7个不同种群的南方红豆杉群体的遗传距离变化幅度为0.021 0~0.379 4,遗传相似度的变化幅度为0.684 3~0.979 2。根据Nei法计算南方红豆杉7个种群遗传多样性遗传相似度(D_(st))为0.108 8,分化指数(G_(st))为0.369 0,基因流系数(N_m)为0.855 0,总的遗传变异中有36.9%的变异存在于群体间,群体内的变异63.1%,种群内存在明显分化。结论不同种源间的南方红豆杉存在一定的遗传变异,但不同种群间的南方红豆杉群体的相似度又比较高,亲缘关系较近。     

对数期继代对南方红豆杉细胞培养动力学的影响

目的 解决南方红豆杉细胞生长缓慢及代谢水平低下的问题。方法 对对数期(20d)和静止期(30d)的红豆杉细胞分别进行继代，在整个生长周期中测定了培养基中的碳源、氮源、磷酸盐的变化并分析了红豆杉细胞生长及紫杉醇的合成情况。结果 对数期继代细胞吸收碳源和硝态氮早于静止期继代的细胞，且前者的比生长速度是后者的1．5倍，紫杉醇含量提高了近4倍。结论 对数期继代有利于生物量的积累及紫杉醇的合成。     

南方红豆杉转录组SSR位点分析及其分子标记开发

目的 基于赤霉素（gibberellin A₃,GA₃）处理下的南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei转录组数据鉴定和分析SSR位点,开发可用于南方红豆杉种质资源鉴定和遗传多样性分析的SSR标记。方法 使用MISA软件对南方红豆杉转录组数据进行SSR分析,搜索SSR位点。可搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸,最小重复数分别设置为10、6、5、5、5、5次。采用Primer 3（2.3.5版,默认参数）进行SSR引物设计。通过毛细管荧光电泳检测,最终选定多态性好,扩增成功率高的SSR引物用于后续数据分析;通过MEGA进行UPGMA聚类分析,构建聚类树。结果 转录组测序共获得202 361条Unigene,采用MISA软件搜索出12 008个SSR位点,分布在10 894条Unigenes上,发生频率为5.38%,平均距离为1/7.64 kb。单核苷酸重复类型最丰富,占总SSR位点的51.74%,其次为三核苷酸（20.92%）和二核苷酸重复类型（20.88%）。A/T、AG/CT是优势重复基序,分别占总SSR重复类型的49.60%和10.93%。随机抽选96对SSR引物,以4个地区12份南方红豆杉种质进行引物有效性和多态性验证,筛选出13对具多态性的SSR引物,多态性引物比率为13.54%。13对引物在东北红豆杉Taxus cuspidata扩增效率高达100%,但在曼地亚红豆杉Taxus × media扩增效率仅为23.08%。聚类分析表明太行山地区南方红豆杉聚为一类,浙江、福建和湖南等南方来源的南方红豆杉聚为一类,后三者彼此之间遗传距离更近。结论 南方红豆杉转录组测序产生的Unigene信息可以用来开发SSR分子标记,开发的13个标记将有助于南方红豆杉物种遗传多样性、分子育种、资源保护等方面的研究。     

南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析

目的从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定。方法采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能。结果获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(p I)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量最高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化p AC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色。结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础。     

南方红豆杉愈伤组织培养及其紫杉烷二萜类成分的分析

目的研究南方红豆杉愈伤组织的出愈时间、诱导率、生长率、生长状态、褐变程度,比较愈伤组织中紫杉醇等5种紫杉烷二萜类成分的量。方法采用单因素比较、正交试验设计,研究影响南方红豆杉愈伤组织诱导和生长的各种因素;采用HPLC法测定不同来源愈伤组织中10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇和东北红豆杉素5种紫杉烷二萜类成分的量;采用加权评分综合考虑以上各因素优选组织培养条件。结果外植体脱分化形成愈伤组织的能力,以完整叶片及茎段最好;暗培养有利于紫杉醇等5种萜类成分的富集;愈伤组织诱导的最适培养基为B5+2,4-D 3.0mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。结论南方红豆杉愈伤组织诱导、培养与外植体种类、培养基种类、光照有较大关联,紫杉醇等5种紫杉烷二萜类成分的富集受植物生长调节剂种类及浓度影响显著。     

鸢尾科3种药用植物种子的形态学及显微结构

目的:研究鸢尾科3种药用植物射干、鸢尾、马蔺种子的形态学及显微结构,为射干、鸢尾、马蔺种子的质量评价和鉴别提供科学依据。方法:用体式显微镜观察射干、鸢尾、马蔺种子形态,用石蜡切片方法制作射干、鸢尾、马蔺种子的切片,观察其显微结构。结果:射干和鸢尾种子均呈球形,外包黑色光滑的假种皮,表面有网状纹饰。射干种脐圆形或椭圆形,微凸,黄褐色。鸢尾种脐圆形,灰白色或黄白色。马蔺种子为不规则球形,暗砖红色、棕褐色或暗紫黑色,无光泽,内外种皮结合紧密,种脐黄白色,线形。显微结构可见,射干种皮细胞浅紫红色,鸢尾种皮细胞深紫色,马蔺种子不具假种皮,种皮结构较为复杂;三者的胚乳均较为发达、致密,胚位于中央。马蔺种子在形状、表皮颜色、假种皮有无、种脐颜色和形态上与射干、鸢尾种子有显著差异,从以上特征可与后两者予以区分;射干、鸢尾种子外观相似,但二者种脐的颜色和形态不同,种皮细胞颜色不同,可作为鉴别特征。结论:上述部分的特征可作为射干、鸢尾、马蔺种子的主要特征与其他物种区别,为三者的鉴别提供依据。     

基于16 S rRNA序列研究华重楼植株可培养内生细菌的多样性

目的分析华重楼Paris polyphylla健株和茎腐病感病植株内生可培养内生细菌的多样性。方法用牛肉膏蛋白胨培养基分离华重楼茎腐病及健康植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌,采用16 S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增结合DNA测序技术,对分离自华重楼健株及茎腐病植株不同部位的细菌进行初步鉴定。结果从华重楼的健康植株和感病植株中分离到11属23种细菌。从健株分离到4属11种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到9、10和5种内生细菌。从病株分离得到10属14种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到11、8和3种内生细菌。华重楼健株的根茎部内生细菌量最高,达2.999×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为7.32×104 cfu/g,华重楼健株根茎、茎、叶中的芽孢杆菌量最高,比例分别为73.3%、67.1%和81.8%。华重楼病株的茎部内生细菌量最高,达2.817×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为2.76×104 cfu/g,华重楼病株的根茎、茎、叶部的假单胞菌量最高,比例分别为35.6%、50.3%和60.5%。华重楼健株不同部位的多样性指数和均匀度指数均高于病株。结论华重楼健康植株以芽孢杆菌为优势细菌类群,华重楼茎腐病植株以假单胞菌为优势细菌类群。华重楼健株相比病株具有更为丰富的内生细菌群落多样性。     

基于红外光谱法的云南重楼及其近缘种的亲缘关系研究

目的傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)结合化学计量学方法分析云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis及其近缘种的亲缘关系,为重楼属药用植物资源的开发利用提供理论依据。方法采集云南重楼、白花重楼Paris polyphylla var.alba、毛重楼Paris mairei、南重楼Paris vietnamensis、五指莲Paris axialis var.axialis共50份样品的红外光谱信息,对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、多元散射校正、二阶求导等预处理,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)及系统聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)分析光谱数据。结果原始红外光谱中,1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm~(-1)等为重楼属植物的共有峰,主要归属为黄酮、淀粉和糖苷类成分的吸收峰;毛重楼和五指莲分别在1 535和1 369 cm~(-1)附近有特征吸收峰,可与另外3种重楼属植物相区分。以全波段光谱数据进行PLS-DA和PCA,PLS-DA对重楼属植物分类效果优于PCA,能够准确区分5种野生重楼属植物。系统聚类分析(HCA)及向量夹角余弦相关性分析能够反映5个重楼属植物的亲缘关系,云南重楼与白花重楼和南重楼的亲缘关系较近,与毛重楼和五指莲的关系较远。结论 FTIR结合化学计量学方法,能够快速区分不同种类重楼属植物,明确云南重楼及其近缘种之间的亲缘关系,为重楼属植物亲缘关系研究提供一种快速、有效的方法,同时为重楼种质资源开发和利用提供理论基础。     

南方红豆杉愈伤组织培养的研究

对南方红豆杉叶愈伤组织诱导条件及最适培养基级成成分进行了探讨。结果表明,２,４－Ｄ比ＮＡＡ更有利于愈伤组织的形成。培养基中添加适度浓度的ＣＡ、Ｐｈｅ和乙酸钠能促进南方红用愈伤组织的生长和紫杉醇的积累。     

南方红豆杉内生真菌的分离及抗菌活性筛选研究

 目的 对我国广西产的野生南方红豆杉内生真菌进行分离,并研究其抗菌活性,旨在筛选具有良好抗菌活性的真菌菌株,以寻找新型抗菌物质。 方法 以组织块分离法获得内生真菌,并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌为实验菌株,用琼脂块法和纸片扩散法对分离的菌株进行抗菌活性筛选。 结果 从南方红豆杉根、茎、叶中共分离到34株内生真菌,其中有8株真菌对至少1种实验菌株有抗菌活性,占总分离菌株的23.53%。 结论 南方红豆杉内生真菌种类多样,而且存在着丰富的抗菌天然活性物质,这可为寻找新型抗菌物质提供可利用的候选菌株。