自身免疫性干眼调节T细胞及细胞因子的表达

目的：探究调节性T细胞在自身免疫性干眼发病中的作用,并对泪液系统内调节性T细胞及相关细胞因子的表达做出分析,为自身免疫性干眼病的治疗提供更加有效的治疗方案。

方法：单独培养提纯分离出的兔泪腺上皮细胞一段时间后,将其与分离出的外周血淋巴细胞以1：1的比例混合进行培养,并用5-脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)检测外周血淋巴细胞的增殖情况,将已激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉回输供体兔体内,回输细胞后的供体兔将作为兔自身免疫性干眼模型组,未诱导发病的正常兔个体为对照组,观察实验前后兔角膜染色和2、4、6、8wk的泪膜破裂时间、泪液的分泌等情况,回输细胞4wk后处死,收集双侧上下泪腺和结膜,并进行病理HE染色,然后提取泪腺组织中的总RNA,检测IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ的表达。

结果：BrdU检测出的外周血淋巴细胞增值比率为3.72,激活的外周血淋巴细胞回输体内会诱导产生兔自身免疫性干眼,与正常组比较,泪膜破裂时间减少,且差异具有统计学意义(P<0.05); 模型组较对照组泪液分泌显著减少,且差异具有统计学意义(P<0.05); HE染色显示在回输细胞4wk后,结膜组织和泪腺均有淋巴细胞浸润,检测发现模型组IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ的表达较对照组均有所增加,但IL-10、TGF-β的表达较对照组有所降低,且差异具有统计学意义(P<0.05); 流式细胞术检测表明,在对照组中,泪腺组织和脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例较高,模型组CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例有所降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：兔干眼模型发病时,CD4⁺CD25⁺Treg细胞免疫抑制作用下降,IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ等细胞因子在泪腺的炎症反应中都发挥着重要作用。     

清眩润目饮治疗兔蒸发过强型干眼的作用机制

目的：研究清眩润目饮对蒸发过强型干眼模型兔的作用机制和疗效。

方法：将25只雄性健康日本大耳白兔随机分为5组：空白对照组、模型组、西药组、高剂量清眩润目饮组、低剂量清眩润目饮组。空白对照组不做任何处理,采用改良睑板腺口灼烧法制备兔蒸发过强型干眼模型; 造模后,高、低剂量组每天分别予27.2mg/kg、6.8mg/kg的清眩润目饮灌胃,模型组每天以等量生理盐水灌胃,西药组以妥布霉素地塞米松眼膏1滴,1次/d点双眼,各组连续给药28d。各组分别在实验前第14d、实验前第7d、造模后当天、造模后第7d、造模后第14d,对全部实验兔行Schimer Ⅰ试验(SchimerⅠ test,SⅠt)和泪膜破裂时间(break-up time,BUT)测定。造模后15d以过量麻醉法处死动物,制备兔角结膜组织切片,采用苏木精-伊红染色法,观察各组兔角膜组织形态变化; 采用ELISA法检测兔角结膜中TNF-α、IL-1、IL-6的浓度含量。

结果：(1)BUT、SⅠt：造模后7d,西药组、高、低剂量清眩润目饮组的BUT、SⅠt较造模时均有不同程度的改善(P<0.05); 西药组、高、低剂量清眩润目饮组与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)TNF-α、IL-1、IL-6：ELISA法检测显示,模型组兔角结膜中的TNF-α、IL-1、IL-6浓度含量明显高于空白对照组,西药组和高、低剂量组兔角结膜中的TNF-α、IL-1、IL-6浓度明显低于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05),且高剂量组作用优于西药组。(3)病理组织学检查：造模后14d,空白对照组角膜上皮分层好,基底部细胞排列呈柱状,靠近角膜上皮呈鳞状改变,结膜可见完整的上皮层和结膜下组织层,杯状细胞排列紧密; 模型组角膜上皮层细胞数减少甚至剥脱缺失,基质层分层紊乱,结膜上皮细胞层不规则脱失,杯状细胞大量减少; 西药组、高剂量组兔角膜形态接近正常组,结膜杯状细胞数量与空白对照组无明显差异。

结论：清眩润目饮可以通过下调蒸发过强型干眼兔角膜和结膜中TNF-α、IL-1、IL-6的表达而抑制炎症反应,从而改善眼表症状,增加泪液分泌,延长泪膜破裂时间。     

大鼠泪液缺乏型干眼症眼表组织中IL-6和TNF-α的表达

目的:探讨白介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)在泪液缺乏型干眼症发病机制中的作用。方法:SD大鼠48只随机分成实验组和对照组两组,实验组通过摘除泪腺的方法制作干眼模型,对照组不做处理,分别于实验前1d及实验后1,2,4wk检测泪液的分泌、泪膜破裂时间及观察角膜荧光素染色,术后4wk将动物脊髓离断致死,用免疫组织化学方法检测结膜及角膜组织中IL-6和TNF-α的表达。结果:实验组大鼠SchirmerⅠ滤纸湿长较正常组缩短(P<0.01),泪膜破裂时间较正常组缩短(P<0.01);IL-6和TNF-α在两组均有表达,在实验组表达较强,对照组表达较弱,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-6和TNF-α在泪液缺乏型干眼的发病机制中起着重要的作用,泪液缺乏型干眼的发病机制与炎症有关。     

雌二醇、丙酸睾酮对泪腺细胞MMP-9表达及细胞凋亡的作用机制

目的:研究雌二醇(estradiol,E2)和丙酸睾酮(testosterone propionate,TP)对兔泪腺上皮细胞凋亡及对MMP-9蛋白表达的影响,探讨雌二醇及丙酸睾酮对干眼的作用机制。方法:体外培养兔泪腺上皮细胞,分别给予雌二醇及丙酸睾酮处理,双氧水(H_2O_2)诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡和免疫细胞化学法检测细胞MMP-9蛋白表达。实验分4组:凋亡对照组(AC组)、雌二醇组(E2组)、丙酸睾酮组(TP组)和空白对照组(BC组)。AC组只给予H_2O_2诱导凋亡,E2组给予1×10^(-5) mol/L雌二醇处理,TP组给予丙酸睾酮处理,BC组未加药物干预及未加H_2O_2诱导凋亡。结果:经H_2O_2诱导细胞凋亡后,泪腺上皮细胞早期凋亡率和MMP-9蛋白表达累积光密度值与BC组相比,AC组、E2组及TP组均显著增加;同比AC组,E2组及TP组细胞凋亡率和MMP-9蛋白表达量降低;E2组凋亡率及蛋白表达量比TP组明显降低;其差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:雌二醇和丙酸睾酮对H_2O_2诱导兔泪腺上皮细胞凋亡有一定的抑制作用,同时泪腺上皮细胞中MMP-9表达含量也降低,提示雌二醇和丙酸睾酮抑制兔泪腺上皮细胞凋亡的作用机制可能与MMP-9有关。     

氧化锌纳米颗粒在体内和体外对角膜的毒性评估

目的:通过构建体内和体外染毒模型,观察氧化锌纳米颗粒(ZnO NPs)对角膜的毒性影响。方法:体外培养原代人角膜上皮细胞(HCEpiC),暴露于0.5、5、12.5、25、50、100、250μg/mL氧化锌纳米颗粒24h,设不含纳米溶液的细胞培养液为空白对照组。采用MTT比色法评估细胞的活性。三种不同浓度(25、50和100μg/mL)的氧化锌纳米颗粒分散液暴露于麻醉后小鼠结膜囊内,磷酸盐平衡缓冲液(PBS)点眼为PBS对照组,每天3次,连续7d,第1、3、5、7d观察角膜形态,第8d取出眼球,观察角膜病理改变和炎症因子(TNF-α,IL-6)表达水平情况。结果:不同浓度的氧化锌纳米颗粒处理原代人角膜上皮细胞24h后,MTT结果显示,与空白对照组相比,氧化锌纳米颗粒在0.5μg/mL即对细胞有损伤作用,细胞存活率约80%(P<0.05),5μg/mL剂量时可致半数细胞死亡,在5～250μg/mL浓度范围对细胞的损伤作用具有浓度依赖性(P<0.0001)。不同浓度的氧化锌纳米颗粒暴露小鼠结膜囊,点眼7d后,25μg/mL和50μg/mL氧化锌纳米颗粒组可见部分角膜上荧光素的...     

自体外周血淋巴细胞经泪腺注射与静脉回输两种方式诱导兔自身免疫性干眼模型的对比分析

目的 基于泪液学、眼表组织及Th17/Treg相关指标比较自体外周血淋巴细胞(PBLs)经泪腺注射与静脉回输两种方式诱导兔自身免疫性干眼模型的异同。方法 将雌性新西兰大白兔随机分为正常对照组(NC组)、生理盐水泪腺注射组(NSI组)、自体PBLs泪腺注射组(ALI组)、生理盐水静脉回输组(NST组)、自体PBLs静脉回输组(ALT组),每组8只;自体PBLs通过与泪腺上皮细胞共培养以激活;ALI组予泪腺注射激活的PBLs 200μL,ALT组予耳缘静脉回输同等细胞量的PBLs 1 mL,NSI组予泪腺注射生理盐水200μL,NST组予耳缘静脉回输生理盐水1 mL;造模前与造模后4周检测各组兔泪液分泌量(SIT)、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色(FL)评分、泪液中白细胞介素17(IL-17)和白细胞介素35(IL-35)浓度,泪腺HE染色观察组织形态学改变,免疫组织化染色检测ROR-γt、Foxp3蛋白表达。结果 造模后4周,ALI组、ALT组兔眼均观察到SIT降低、BUT缩短、FL评分增加、泪液IL-17浓度上升和IL-35浓度下降(均为P<0.05),泪腺组织HE染色见...     

间充质干细胞对兔自身免疫性干眼模型病理改变及细胞因子表达的影响

目的 建立兔自身免疫性干眼模型,观察间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗后兔自身免疫性干眼的组织病理学变化及泪腺组织中细胞因子表达的变化.方法 取健康成年雌性新西兰白兔24只24眼,采用随机数学表法将兔分为正常对照组、干眼模型组和MSCs治疗组,每组各8只8眼.MSCs治疗6周后,观察兔眼组织病理学改变,实时荧光定量PCR检测泪腺组织中Th1、Th17细胞分化相关细胞因子mRNA相对表达量.流式细胞仪检测干眼模型组和MSCs治疗组兔泪腺组织和脾脏组织中调节性T细胞(CD4+ Foxp3+细胞)占淋巴细胞的比例.结果 MSCs治疗6周后,取各组兔泪腺并行HE染色显示:正常对照组未见或仅见少量淋巴细胞浸润;干眼模型组泪腺内部分腺体细胞出现萎缩,腺管周围和小血管周围可见散在分布的淋巴细胞汇集区;与干眼模型组相比,MSCs治疗组泪腺内淋巴细胞浸润减轻,腺泡细胞形态较好.与干眼模型组比较,MSCs治疗组结膜组织中淋巴细胞浸润聚集显著减轻,上皮结构完整,变性和萎缩细胞较少见.MSCs治疗组泪腺组织中Th1特征性细胞因子IFN-γ以及转录因子T-bet mRNA表达水平较干眼模型组明显下降,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05);Th17细胞分化相关细胞因子IL-17表达水平有下降趋势,但两组差异无统计学意义(P＞0.05);其转录因子RORa mRNA的表达水平较干眼模型组显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).MSCs治疗组泪腺组织中炎症因子TNF-α表达较干眼模型组显著降低,而抑炎因子TGF-β的表达较干眼模型组显著升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).泪腺组织中干眼模型组调节性T细胞(CD4+ Foxp3+细胞)占淋巴细胞的比例为10.0％,而MSCs治疗组中调节性T细胞占淋巴细胞的比例为27.8％,MSCs治疗组调节性T细胞较干眼模型组显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MSCs可以减轻自身免疫性干眼的组织病理学改变,对自身免疫性干眼具有一定的免疫调节及治疗作用,其免疫调控作用可能与调节抑炎因子和促炎因子平衡有关.     

摘除泪腺和泪腺注射肉毒杆菌毒素A制备大鼠干眼模型的比较

目的：分别采用摘除泪腺法和泪腺注射肉毒杆菌毒素A法诱导大鼠干眼症模型,通过对比两种干眼症模型的临床表现、病理学特点和细胞因子变化,探讨其优缺点和适用范围。

方法：健康8周龄雄性Brown Norway大鼠30只,随机分为3组：A组左眼为空白组,B组摘除大鼠左侧主泪腺,C组左侧泪腺注射肉毒杆菌毒素A。比较实验前1d,实验后3、7、14、28、42d的泪液分泌量(SⅠt)、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素钠染色评分的变化。42d观察结膜、角膜和泪腺组织病理学改变; 通过实时荧光定量PCR对白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和上皮生长因子(EGF)表达量进行检测。

结果：实验后第3d开始,B、C组均出现泪液分泌量持续性减少,与A组均有差异(P<0.05); 实验后第7d开始,B、C组均出现BUT持续性缩短以及角膜上皮染色明显增多,与A组比较有差异(P<0.05); 以上临床数据B、C组间比较均无差异(P>0.05)。A组角膜上皮细胞形态正常,B组及C组角膜上皮均存在不同程度表层细胞丝状分离,结膜杯状细胞数目明显减少,C组泪腺组织明显萎缩。B、C组结膜和角膜组织的EGF、TNF-α和IL-6表达量均显著增高,与A组比较均有差异(P<0.05)。B、C组间EGF和TNF-α的表达均无差异(P>0.05); 与C组比较,B组中IL-6的表达量更高(P<0.05)。

结论：摘除泪腺和泪腺注射肉毒杆菌毒素A均可以构建稳定的水液缺乏型大鼠干眼模型,建议根据实验设计及实验目的去选择合适的动物模型。     

基于JNK1/AQP5通路研究杞参方颗粒对高渗诱导的角膜上皮细胞的效应机制

目的:基于JNK1/AQP5通路观察杞参方颗粒对高渗诱导的角膜上皮细胞(HCECs)保护作用,阐明其治疗干眼的作用机制。方法:通过500mOsm/L浓度渗透压作用于HCECs制造干眼细胞模型。空白组:正常条件培养的角膜上皮细胞;模型组:模型细胞加入10%空白血清;西药组:模型细胞加入0.3%玻璃酸钠滴眼液;杞参方高剂量组:模型细胞加入15%杞参方高剂量含药血清;杞参方中剂量组:模型细胞加入15%杞参方中剂量含药血清:杞参方低剂量组:模型细胞加入15%杞参方低剂量含药血清。CCK-8法检测不同药物干预对HCECs存活率的影响;ELISA法检测各组细胞外液炎性因子TNF-α、IL-6的表达;免疫细胞化学法检测各组HCECs凋亡因子caspase-1与AQP5的蛋白表达变化;Western blotting法检测各组HCECs的JNK1、p-JNK1、AQP5表达情况。结果:与空白组相比,各组HCECs存活率均显著减少(均P<0.01),各组细胞外液炎症因子TNF-α、IL-6及HCECs中caspase-1、p-JNK1、AQP5蛋白表达水平均显著增高(均P<0.01);与模型组相比,各用药组HCECs存活率均显著增加(均P<0.01),各用药组的细胞外液中TNF-α、IL-6及HCECs中AQP5、p-JNK1蛋白表达水平及西药组及杞参方高中剂量组caspase-1、AQP5蛋白表达均减少(均P<0.05);与西药组相比,杞参方高剂量组HCECs存活率显著增加(P<0.01),杞参方各剂量组的TNF-α、IL-6表达水平均减少(均P<0.05),杞参方高剂量组caspase-1及杞参方高、中剂量组的AQP5蛋白表达水平减少(均P<0.05)。Western blotting法检测HCECs的JNK1蛋白表达各组比较无差异(P>0.05)。结论:杞参方颗粒可降低高渗诱导HCECs的JNK1的磷酸化和AQP5的蛋白表达,降低细胞外液炎症因子TNF-α、IL-6和HCECs凋亡因子caspase-1的表达,最终有效抑制炎症反应和细胞凋亡。     

肉毒杆菌B诱导大鼠干眼模型中泪腺炎症因子表达研究

目的: 建立肉毒杆菌B诱导大鼠炎症干眼模型,通过观察泪腺炎症因子表达变化为干眼病实验研究提供实验依据。方法: 健康8周龄雌性SD大鼠,30只,随机分为2组,20只为实验组,10只为对照组。右侧泪腺注射肉毒杆菌B0.1mL(20mU),生理盐水0.1mL。分别于实验前1d及实验后第3d;1,4,6wk,观察基础泪液分泌量、角膜荧光染色,并且酶联免疫吸附试验(ELISA)检测泪腺组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)变化。结果: 术后实验组从第3d时出现泪液分泌减少,4wk达到高峰,6wk后恢复;角膜荧光染色第3d时出现,持续6wk;泪腺组织IL-1β从第3d开始出现增加,持续6wk;TNF-α表达水平未增加,MIF检测从第4wk开始表达增加,持续6wk。结论: 泪腺注射肉毒杆菌B可以成功诱导大鼠炎症干眼模型,炎症因子的表达变化具有一定的特征性,为干眼病实验提供较理想的动物模型。     

密蒙花提取物对去势雄兔干眼症的预防作用

目的 观察密蒙花提取物对雄兔去势所致干眼症的预防作用,探讨密蒙花提取物抗雄激素水平下降所致干眼症的机制.方法 实验研究.将30只日本大耳白雄兔随机分为空白组(A)、模型组(B)、治疗组(C、D、E),每组6只,对B、C、D、E组行去势术建立动物模型,对C、D、E组分别以密蒙花提取物1倍剂量和2倍剂量以及染料木黄酮连续灌胃1个月,对全部实验兔行Schirmer Ⅰ试验,对兔泪腺组织中炎性因子转化生长因子(TGF)-β1、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)·α和凋亡相关基因蛋白Fas、FasL、Bax、bcl-2进行检测,电镜观察显微结构变化.各组SIT测量值治疗前后比较,使用配对t检验,如不满足t检验的使用条件则使用符号秩和检验;SIT各组间治疗后比较,以治疗前测量值为协变量,使用协方差分析.各组炎性因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α平均A值的比较,凋亡相关基因蛋白Fas、FasL、Bax、bcl-2平均A值和凋亡细胞数量的比较,使用多元方差分析.结果 C、D、E组Schirmer Ⅰ试验测量值明显高于B组(P<0.01),泪腺导管及腺泡上皮细胞中,IL-1β、TNF-α、Fas、FasL、Bax表达明显低于B组而TGF-β1、bel-2表达明显高于B组(P<0.01),电镜示C、D、E组显微结构明显改善.以上检测结果C、D组均明显优于E组(P<0.05).结论 密蒙花提取物对于雄激素水平所致兔干眼症有良好的实验疗效,其作用机制可能与其中主要成分黄酮类物质拟雄激素效应调节体内性激素水平有关,从而可调节泪腺局部炎性反应、抑制泪腺细胞凋亡.     

Induction of nitric oxide synthase and over-production of nitric oxide by interleukin-1beta in cultured lacrimal gland acinar cells

PURPOSE: Inflammation of the lacrimal gland is one of the major causative factors in aqueous tear-deficient dry eye syndrome. Pro-inflammatory cytokine production is upregulated in lacrimal gland autoimmune disease (i.e. Sj?gren's syndrome) and is associated with cell death. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS/NOS-2) is known to be induced in the presence of pro-inflammatory cytokines in several secretory epithelial cell types. We hypothesize that pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-1beta (IL-1beta), cause a marked increase in nitric oxide (NO) production via induction of iNOS in lacrimal gland epithelial cells and that this may be a significant pathophysiological pathway of dry eye syndrome. METHODS: Cultured immortalized rabbit lacrimal gland acinar cells were incubated with IL-1beta, iNOS inhibitor, or IL-1 receptor antagonist (IL-1ra). Colorimetric detection of NO(2)(-) and NO(3)(-) in the media, measured by the Griess reaction, was used as an index of NO production. Expression of iNOS was determined by SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: IL-1beta stimulated a concentration-dependent and time-dependent increase in NO production. IL-1beta-induced NO production was significantly antagonized by co-incubation with IL-1ra or the iNOS-specific inhibitor, 1400W. Expression of iNOS protein was greatest at 4hr after addition of IL-1beta, and was nearly undetectable at 12hr. IL-1ra greatly reduced IL-1beta-induced iNOS expression. CONCLUSIONS: Lacrimal gland acinar cells are able to produce iNOS in response to the pro-inflammatory cytokine IL-1beta. The amount of iNOS expressed and the subsequent levels of NO that are produced by lacrimal cells are far lower than those seen in macrophages, but are consistent with those reported for other cell types in the literature. This pathway of iNOS induction and overproduction of NO may be a factor in lacrimal gland cell death in dry eye syndrome. Inhibitors of iNOS or IL-1 receptor may be beneficial for controlling lacrimal gland inflammation.     

兔自身免疫性干眼模型的建立及泪腺炎症因子研究

目的　通过静脉回输自体激活的淋巴细胞建立稳定的兔自身免疫性干眼模型,并分析干眼的泪腺炎性因子,探究干眼的泪腺免疫反应。方法　通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞,建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。结果　与正常对照组相比,干眼模型组泪液分泌显著减少（ｔ＝１１５．６,Ｐ＜０．０５）,泪膜破裂时间缩短（ｔ＝９２．５,Ｐ＜０．０５）。荧光素钠染色显示角膜弥漫性点状着色,正常对照组基本无着色。泪腺组织ＨＥ染色显示淋巴细胞浸润,正常对照组很少。ＲＴ-ＰＣＲ结果显示,干眼模型组泪腺中炎性因子ＩＦＮ-γ、ＩＬ-６、ＩＬ-１７ｍＲＮＡ相对表达量显著升高（ｔ＝２６．２、１８．７、８．４;均为Ｐ＜０．０５）,抑炎因子ＩＬ-１０、ＴＧＦ-βｍＲＮＡ相对表达量显著降低（ｔ＝２２．１、１４．２;均为Ｐ＜０．０５）。结论　经兔泪腺上皮细胞激活的自体外周血淋巴细胞静脉回输后,成功诱发干燥综合征样自身免疫泪腺炎,建立了稳定的兔自身免疫性干眼模型。泪腺组织中细胞因子ＩＬ-６、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-β、ＩＬ-１０参与泪腺内炎症反应的发生和发展。     

密蒙花总黄酮含药血浆对干眼症细胞模型Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表达的影响

目的：观察密蒙花总黄酮含药血浆对干眼症细胞模型中泪腺上皮细胞Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表达的影响。

方法：将培养生长状态良好的泪腺上皮细胞,随机分为无雄激素培养黄酮治疗组(以下简称密蒙花总黄酮组),含雄激素培养对照组(以下简称雄激素组),无雄激素培养空白组(以下简称空白组)。分别加入含密蒙花总黄酮血浆、丙酸睾酮、含空白血浆开始进行干预。建立干眼症细胞模型。用Trizol试剂提取细胞总RNA。RT-PCR法检测泪腺上皮细胞中Bax mRNA及Bcl-2 mRNA的表达。

结果：密蒙花组、雄激素组能够抑制泪腺上皮细胞中Bax mRNA的表达,与空白组比较差异有显著性(P<0.01); 密蒙花组Bax mRNA的表达低于雄激素组,比较差异有显著性(P<0.01)。密蒙花组、雄激素组Bcl-2 mRNA的表达均高于空白组,比较差异有显著性(P<0.01); 密蒙花组Bcl-2 mRNA的表达高于雄激素组,比较差异有显著性(P<0.01)。

结论：密蒙花总黄酮含药血浆作用于雄激素水平下降所致干眼症的细胞模型可抑制Bax mRNA的表达,使Bax mRNA的表达量降低,同时促进Bcl-2 mRNA的表达,使Bcl-2 mRNA的表达量增加。密蒙花总黄酮含药血浆很可能是通过抑制泪腺上皮细胞中Bax mRNA及促进Bcl-2 mRNA表达的途径而达到抑制细胞凋亡的作用。     

密蒙花提取物治疗兔去势所致干眼症

目的观察密蒙花提取物对去势所致的干眼症雄免基础泪液分泌量，泪腺局部炎症因子转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor—α，TNF—α）的影响，探讨密蒙花提取物抗雄激素水平下降所致的干眼症的作用机制。方法将30只日本大耳雄兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）和染料木黄酮治疗组（E），每组6只，对B、C、D、E组行雄激素去势术建立动物模型，对C、D、E组分别以密蒙花提取物1倍剂量和2倍剂量以及染料木黄酮连续灌胃1个月，对全部实验兔行Schirmer I试验．采用免疫组织化学方法，对兔泪腺组织中炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF—α进行检测。结果C、D、E组SchirmerI试验测量值明显高于B组（P〈0．01），在泪腺导管及腺泡上皮细胞中．IL-1β、TNF—α．阳性表达的细胞数均明显低于B组，而TGF—β1阳性表达的细胞数均明显高于B组（P〈0．01）。以上检测结果C、D组均优于E组（P〈0．05）。结论密蒙花提取物中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后兔干眼症的发生。其作用机制可能与黄酮类物质化学结构与雄激素类似，可起到拟雄激素效应，从而调节泪腺局部炎症反应有关。密蒙花提取物可能成为治疗干眼症的新途径。     

人脐带间充质干细胞移植对小鼠干燥综合征的治疗作用及其机制

背景 干眼的发病率有逐渐升高的趋势,炎症反应参与干眼的发生和进展过程,而目前的治疗方法通常仅能缓解症状,而不能达到彻底治愈的目的.已有研究将干细胞移植用于眼表损伤引起的角膜缘干细胞缺乏症,但干细胞是否可用于干眼及其作用机制的研究鲜见报道. 目的 探讨人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)移植治疗干燥综合征的可行性及治疗途径. 方法 采用完全随机方法将20只24周龄雄性NOD/Ltj小鼠分为尾静脉注射组、泪腺注射组、点眼组和模型组,分别采用HUCMSCs悬液尾静脉注射法、泪腺注射法和点眼法进行HUCMSCs移植,模型组小鼠不移植HUCMSCs,采用ICR雄性小鼠5只作为正常对照.分别于注射后1、2和3周采用酚红棉线法测量各组小鼠的泪液分泌量;采用角膜荧光素钠染色法对角膜上皮的缺损情况进行评分;采用ELISA法检测各组小鼠血清白细胞介素(IL)-6、IL-17a、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)质量浓度;采用Western blot法检测各组小鼠泪腺组织中p65、Stat3、Stat5和细胞外信号调节激酶-1(Erk-1)的相对表达量.对各组小鼠上述指标的测定结果进行比较.结果 模型组、尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组NOD/Ltj小鼠干预后1、2和3周时组间泪液分泌量的总体比较差异均有统计学意义(第1周:F=3.700,P=0.040;第2周:F=5.150,P=0.008;第3周:F=10.130,P＜0.001),其中注射后第1、2和3周尾静脉注射组、泪腺注射组小鼠的泪液分泌量均明显多于模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但各时间点点眼组小鼠的泪液分泌量与模型组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).注射后1周ICR小鼠对照组、模型组、尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组角膜荧光素钠染色评分分别为3.00±0.63、9.40±1.62、5.20±1.17、4.20±1.17和7.20±0.98,其中尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组小鼠角膜荧光素染色评分值明显低于模型组,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000、0.033).注射HUCMSCs后尾静脉注射组小鼠血清IL-6、IL-17a和TNF-α质量浓度均明显低于模型组,差异均有统计学意义(t=4.70、3.46、11.00,均P＜0.01),而各组间小鼠血清IFN-γ,质量浓度总体比较差异无统计学意义(F=1.740,P=0.170).尾静脉注射组和泪腺注射组小鼠眶外泪腺中Stat5蛋白相对表达量低于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 NOD/Ltj干燥综合征模型小鼠全身和泪腺局部注射HUCMSCs能够分别抑制血清和泪腺中炎性相关因子的表达,减轻炎症反应,从而治疗干眼.HUCMSCs点眼法能够发挥润滑和营养角膜的作用,从而缓解干眼症状.     

淫羊藿总黄酮对干眼症雄兔泪腺中Bax和Bcl-2表达的作用研究

目的观察淫羊藿总黄酮对干眼症雄兔泪腺中Bax和Bcl-2表达的作用。方法随机将80只雄性健康新西兰大耳白兔分为A组(空白组)、B组(手术组)、C组(淫羊藿总黄酮组)、D组(雄激素组),每组20只。A组以生理盐水进行灌胃,B、C、D三组建立干眼症模型后分别以生理盐水灌胃、淫羊藿总黄酮灌胃、丙酸睾酮肌肉注射进行干预。每组根据喂养时间不同又分为A1～D1组(喂养1个月)和A2～D2组(喂养2个月),每组10只。A1～D1组于造模前及造模后2周、4周时,A2～D2组于造模后6周及末次最后一次用药后对雄兔进行泪液分泌实验(SchirmerⅠtest,SIT)和泪膜破裂时间(BUT)检查;A1～D1组和A2～D2组分别在饲养1个月及2个月时处死雄兔,即刻摘取泪腺,应用Western blot检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2的蛋白表达。结果 SIT、BUT检查结果显示,B、C、D三组雄兔均在造模1个月后形成干眼症。C1组、C2组及D1组、D2组雄兔泪腺组织中的Bax相对含量均较B1组、B2组低,差异均有统计学意义(均为P<0.01);C2组Bax相对含量低于C1组,差异有统计学意义(P<...