骨髓基质干细胞复合改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯体外构建组织工程化软骨

目的 探讨应用骨髓基质干细胞(BMSCs)复合光接枝改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯(PHBV)构建组织工程化软骨的可行性. 方法 将3代绵羊骨髓基质细胞接种于光接枝改性的三维PHBV支架材料上,24 h后以成软骨诱导液培养,3周后,复合培养物行扫描电镜观察,组织学观察,测定糖胺聚糖(GAG)含量.并将复合物埋植于绵羊腹部皮下,4周后取出,行大体及组织学观察. 结果 经成软骨诱导后,扫描电镜下,BMSCs的突触逐渐变短,由长梭形向扁平形转变,分泌基质量亦明显增多.组织学观察见细胞支架复合物阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性.GAG含量测定示诱导3周后,细胞分泌的GAG量(1306.7±192.3)明显高于未经诱导的BMSCs(205.0±26.2)(P<0.001),但仍低于正常软骨细胞(1969.2±235.3)(P<0.001).复合物埋植于皮下4周后,其内炎症细胞浸润明显,但番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性. 结论 以BMSCs为种子细胞,复合改性的PHBV,可于体外构建出软骨样组织,但该组织的理化特点与正常软骨仍有差距.     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体制备及复合骨髓基质干细胞成软骨的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔载体作为新型组织工程软骨载体的可行性。方法观察-80℃冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体的孔径、孔隙率、交通孔和密度;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(MSCs),MTT检测MSCs在载体上的黏附率及多孔载体对细胞增殖功能的影响;兔MSCs经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导7d后免疫组化检测Ⅱ型胶原、S-100蛋白表达;诱导后的MSCs与载体复合后植入裸鼠肌袋内,分别于术后2、4周取材进行组织学观察。结果载体孔径为230±30μm,孔隙率为79%,密度为11.50±0.36(μg/mm3);细胞在载体上黏附率87.5%;载体可轻度促进MSCs增殖;经TGF-β1诱导7d后MSCsⅡ型胶原、S-100蛋白免疫组化染色阳性;诱导后的MSCs在体内生长增殖良好,4周时可见新生软骨组织形成。结论该载体具有良好的孔径、孔隙率,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生载体。     

重组PGL3-转化生长因子β1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据.方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析.结果 MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性.图像分析示,实验组抗TGF β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论脂质体法重组PGI3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化.     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数。方法抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2代BMSCs,以5.0×107/cm3的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养。8周后取材,行相关检测。结果力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分。GAG含量为(6.0±1.2)mg/g,抗压强度为(2.2±0.8)kPa,弹性模量为(7.4±1.6)kPa。各项指标均明显优于其他各组。结论力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的 探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数.方法 抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2 代BMSCs,以5.0×107/cm3 的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7 d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养.8周后取材,行相关检测.结果 力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质 ,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分.GAG含量为(6.0±1.2) mg/g,抗压强度为 (2.2±0.8) kPa,弹性模量为(7.4±1.6) kPa.各项指标均明显优于其他各组.结论 力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨.     

成年恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养

目的温对猴骨髓基质干细胞(BMSCs)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。方法 抽取4只成年猴髂骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果 成年雄性恒河猴BMSCs体外培养生长良好，原代细胞10-13d汇成单层，传代后4～7d长满瓶底。HE染色光镜下观察见BMSCs为单核细胞，细胞呈梭形、多角形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论 猴BMSc的体外培养增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为灵长类动物骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞在β3转化生长因子联合胰岛素样生长因子-1定向诱导下的软骨组织工程

目的探讨β3转化生长因子（TGF-β3）在诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向软骨细胞分化中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的作用以及在软骨组织工程中的应用。方法在体外用TGF—β3或（和）IGF-1诱导藻酸钠微球中的MSCs向软骨细胞定向分化,免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达,Western印迹法检测Sox9蛋白的表达,激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察该软骨细胞在壳聚糖支架上的生长。结果TGF-β3。能诱导藻酸钠微球中的MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9,IGF-1能显著性地增强这种作用（P〈0．05）。Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9之间的相关系数分别为0．95和0．91。诱导的软骨细胞能在壳聚糖支架上黏附、迁徙、增殖。结论在TGF-β3诱导MSCs分化成软骨细胞地过程中,IGF-1可能通过促进Sox9的表达起到协同作用。诱导分化后的软骨细胞与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性。     

血清浓度影响骨髓基质干细胞体外软骨分化的实验研究

目的 探讨含有不同浓度胎牛血清的成软骨分化诱导液对骨髓基质干细胞(BMSCs)体外分化的影响,明确体外培养用血清在细胞分化中的作用,为软骨的体外组织构建提供技术参数.取第2代猪BMSCs,以5×107个细胞/cm3的密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆盘状支架上(直径5 mm,厚度2 mm),7 d后分别应用含0%、5%、10%血清浓度的诱导液(诱导因子包括TGF-1、IGF-Ⅰ及地塞米松)进行体外持续性诱导培养.8周取材行组织湿重测量、GAG含量定量分析、大体观察、组织学、组织化学及免疫组织化学检测.结果 10%血清组复合物外观瓷白色,坚硬细腻,体积和外形均无明显变化.组织学及免疫组织化学检测结果显示有典型的软骨陷窝,大量的软骨特异性细胞外基质成分,组织湿重和GAG定量亦明显高于其它两组;3%血清组复合物体积缩小,有少量陷窝样结构及软骨特异性胞外基质聚集;而无血清组复合物缩小,松软易碎,未见典型的软骨陷窝和软骨特异性基质成分.结论 体外诱导培养BMSCs构建组织工程软骨过程中,10%浓度的血清成分有利于BMSCs成软骨分化.     

rhBMP-2明胶纳米微球制备及体外缓释效果研究

目的制备重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)明胶纳米微球并检测其体外缓释效果。方法 "二次凝聚法"制备明胶纳米微球,扫描电镜、透射电镜和粒径分析仪检测纳米微球的表面形态、内部结构、粒径,计算其溶胀率;将rhBMP-2与明胶纳米微球复合,计算其包封率和载药量,并对其体外缓释效果进行检测。结果明胶纳米微球的表面形态良好,分散均一,内部结构多孔隙、通道,平均粒径(171.49±50.12)nm,溶胀率为1.83;rhBMP-2明胶纳米微球的包封率为(98.13±0.131)%,载药量为(58.89±0.079)ng/mg;rhBMP-2明胶纳米微球释药时间在1个月以上,呈"双相缓释",第1天为"突释相",释药量约为7%,以后平缓释放呈"缓释相",40%左右的药物于28 d内释放,约60%的药物在1个月以后释放。结论成功制备rhBMP-2明胶纳米微球,不但包封率高,而且体外缓释效果好。     

骨髓基质干细胞在骨科应用研究的现状

骨髓基质干细胞（marrow stromal cells,MSCs） 是一类具有独特表型和细胞化学特性的细胞群,有自我复制和多向分化的潜能.将小鼠的MSCs置于体外特定条件诱导培养下,可向多种中胚层和神经外胚层来源的细胞分化,包括成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、成纤维细胞、神经细胞、上皮细胞、肝细胞和脂肪细胞等成熟细胞[1].     

生长因子缓释微球的制备及其对内皮细胞的影响

目的:制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)可降解缓释微球,考察其生物活性的保存情况及它们对内皮细胞的作用。方法:采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF、VEGF的明胶缓释微球,将它们加入内皮细胞的培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况。结果:复合bFGF、VEGF的缓释微球平均粒径(11.32±3.64)μm;培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性;5天后两种生长因子缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组;7天后两种生长因子缓释微球组值仍高于其它组。结论:复合bFGF、VEGF的缓释微球制备工艺简便,具有良好的缓释活性能较长时间地持续释放活性bFGF、VEGF,可明显促进内皮细胞的增殖。     

TGF-β1缓释载体体外构建组织工程软骨

目的制备负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的三维多孔壳聚糖支架，检测TGF—β1缓释载体对软骨细胞功能的影响．方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，检测其体外降解并通过ELISA法检测微球的载药、释药性能。将软骨细胞置于复合载体中立体培养，通过苏木素伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、功能的影响。结果缓释微球的TGF—β1包封率达90．1％，并具有良好的药物缓释性能，软骨细胞在复合载体中增殖良好，并能够保持其表型及Ⅱ型胶原分泌功能。结论负载TGF—β1壳聚糖缓释微球的壳聚糖支架作为软骨细胞的载体在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用前景。     

体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源,目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种:(1)培养扩增自体获得的软骨细胞;(2)同种异体软骨细胞;(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞;(4)胚胎干细胞;(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下:1自体软骨细胞自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分,是终末分化细胞,具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天…     

腺病毒介导TGF-β1及BMP-7基因共表达感染骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损

目的探讨腺病毒介导转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白7(BMP-7)基因共表达感染对骨髓基质干细胞(MSCs)增殖和定向分化的影响,观察其构建组织工程化软骨对关节软骨缺损的修复质量和疗效。方法以腺病毒AdEasy为基因转移载体,制备携带TGF-β1和BMP-7基因的高滴度腺病毒感染兔MSCs,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达软骨细胞表型,通过免疫细胞化学、原位杂交、RT-PCR及己糖醛酸水平检测等方法鉴定。再将其与骨基质明胶(BMG)支架相复合体外构建组织工程化软骨,移植修复同种异体兔关节软骨缺损并进行形态学和组织学观察及修复结果分析。结果腺病毒感染MSCs后免疫细胞化学染色和RT-PCR可检测出外源基因及其编码蛋白的表达,通过原位杂交可检测出Ⅱ型胶原蛋白基因表达,细胞培养液中己糖醛酸水平明显升高。将其复合于骨基质明胶上,经组织染色和电镜观察可见前体软骨细胞贴附于BMG表面和孔隙内大量增殖,在体移植修复实验组新生组织为类透明软骨,修复效果明显优于各对照组。结论MSCs经携带TGF-β1和BMP-7基因的腺病毒感染后,体外能向软骨细胞作定向分化,可用于制备组织工程化软骨,使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能。     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠作为组织工程软骨支架的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架的制备方法和其作为组织工程软骨支架的可行性。方法光镜和扫描电镜观察-20℃、-80℃及液氮条件下冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠支架的孔径、孔隙率、交通孔和密度;测定不同条件制备的支架材料与正常软骨的压缩载荷-形变曲线;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),接种于不同条件制备的支架材料上培养,MTT检测MSCs在支架上的黏附率及多孔支架对细胞增殖功能的影响。结果在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料具有疏松多孔结构,孔径依次为300±45μm、230±30μm和45±10μm,孔隙率为81%、79%和56%,密度为9.41±0.25μg/mm3、11.50±0.36μg/mm3和29.50±0.61μg/mm3;-80℃和液氮条件下制备的支架材料,力学强度接近于正常软骨;MTT测得细胞在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料,黏附率分别为85.0%、87.5%和56.3%;可轻度促进MSCs增殖。结论-80℃条件下抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架,具有良好的孔径、孔隙率和抗压缩载荷能力,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生支架材料。     

骨髓干细胞体外组织工程软骨形成的实验研究

[目的] 探讨骨髓干细胞(BMSCs)在体外不同载体中软骨形成的能力和可行性.[方法] 分离培养猪BMSCs,将第3代BMSCs以载体内多点注射和表面点滴法植于A组:Ⅱ型纤维胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge),B组:生物蛋白海绵(fibrin collagen sponge and bFGF);C组:明胶海绵(gelatin sponge)3种载体上,于4周取材进行组织学分析.[结果] 纤维胶原蛋白海绵和生物蛋白海绵组均有软骨细胞形成,明胶海绵无细胞生长.利用SPSS 10.0软件统计学处理,显示B组软骨细胞阳性数量(92.75±10.57)多于A组(36.45±8.34),有统计学差异(P<0.01),两组都明显多于C组(0),有统计学差异(P<0.01).[结论] MSCs经分离扩增后种植于三维立体结构的纤维蛋白海绵载体上,在含有TGF-β1培养液中形成软骨;在TGF-β1和FGF的双重因子培养中,其软骨的形成能力明显增加.     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

β1转化生长因子浓度对体外诱导骨髓间充质细胞构建软骨的影响

目的 探讨β1转化生长因子（TGF-β1）浓度对体外诱导猪骨髓间充质细胞（BMSCs）构建组织工程化软骨的影响，明确TGF-β1诱导剂量对细胞分化的作用，为体外软骨构建提供适宜的诱导因子应用浓度参数。方法 抽取8周龄猪髂嵴骨髓，应用贴壁法分选单个核细胞，体外培养扩增后获得BMSCs，收集第2代细胞，以5×10^7个／cm。细胞的密度接种到聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形三维支架材料上（直径5mm，厚度2mm），7d后应用不同浓度TGFβ1（A组：5ng／ml、B组：10ng／ml、C组：20ng／ml、D组：50ng／m1）与IGF-1（50ng／m1）及地塞米松（40ng／m1）组成诱导剂，分别进行体外诱导培养。8周后取材行大体观察，体积、湿重及聚合蛋白多糖（GAG）定量，组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学等检测。结果 B、C、D组形成细胞材料复合物组织学结构较为类似，有明显的软骨陷窝，分布有大量Ⅱ型胶原及GAG；A组软骨陷窝结构较少，胞外基质染色较浅。B、C、D组的组织湿重、体积和GAG含量均明显高于A组。结论 诱导三维支架上的BMSCs体外构建组织工程化软骨过程中，10ng／ml的TGF-β1诱导浓度具有良好的促分化效能，TGF-1的促分化作用并未表现出明显的剂量依赖性。