蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:随机选取新生1天(Q1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时.将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d后...     

bFGF、EGF对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的　观察碱性成纤维生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)对新生大鼠海马神经干细胞生长和分化的影响。方法　从新生大鼠海马分离培养神经干细胞 ,采用免疫荧光法检测神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)的表达 ,使用bFGF、EGF作为诱导因子 ,通过免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞的方法检测神经干细胞分化为 3种神经细胞的状况。结果　取材细胞大部分为Nestin免疫阳性细胞 ,各实验组均可促进培养细胞的生长和分化 ,bFGF能明显增加神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的表达 (P <0 .0 5 ) ,EGF能明显增加胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达(P <0 .0 5 )。结论　bFGF倾向于诱导干细胞增殖并向神经元方向分化 ,EGF则倾向于诱导干细胞向胶质细胞分化 (P <0 .0 5 )。     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

六味地黄丸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的:观察滋补肝肾中药六味地黄丸体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,为进一步探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法打下基础。方法:采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,鉴定后的第3代细胞经bFGF预诱导24 h后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组进行诱导,观察细胞形态变化,诱导培养7 d,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果与结论:bFGF组、六味地黄丸组部分细胞逐渐伸出突起,多为2~3极,呈现较典型的神经元样细胞形态;均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,六味地黄丸组Nestin、NSE表达阳性率高于bFGF组,差异有统计学意义(P0.05)。结果说明:(1)全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高,生物学性状稳定,适于做进一步研究;(2)六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,可继续探讨六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导是否可获得更高比例的神经元样细胞。     

新生豚鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定

目的：探讨新生豚鼠海马来源的神经干细胞体外培养的最佳条件。方法：分离新生24h内的豚鼠海马组织，制成单细胞悬液，分别于DMEM／F12培养基、含体积分数2％B27的培养基及含4ng／L bFGF的B27培养基进行原代和传代培养，收集原代和传代培养的细胞，进行巢蛋白(Nestin)、GFAP及NSE免疫细胞化学染色。结果：在含bFGF的B27培养基中，传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经干细胞团。传代培养分化的细胞可见NSE或GFAP免疫阳性细胞。结论：含体积分数2％B27的DMEM／F12培养基中添加bFGF可获得大量新生豚鼠海马神经干细胞。     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

新生大鼠神经干细胞的体外培养方法

目的 探讨新生sD大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)适宜的体外分离培养方法.方法 从出生1～3d的SD大鼠脑组织中分离NSCs,采用不同的接种密度、传代方法,在体外培养NSCs,观察细胞的生长情况.巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学法对NSCs进行鉴定.结果 培养的神经球Nestin表达阳性,血清诱导后可分化为NSE阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞,具有自我增殖和多向分化能力,是NSCs.当NSCs接种密度为1×106/mL时,细胞增殖速度快,神经球生成的数量多.传代的方法应视情况而定,传代时间为7d左右.结论 建立了简单、稳定的新生大鼠NSCs的体外培养方法,为进一步研究NSCs的生物学特征及组织移植奠定了基础.     

睾酮定向诱导MSC分化的实验研究

目的：激素体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，睾酮定向诱导MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。睾酮诱导6h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外经睾酮诱导分化为神经元样细胞。     

差速贴壁法分离培养早期人胚骨髓间充质干细胞

目的:探讨差速贴壁法从早期人胚股骨分离、纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性,并观察培养细胞是否向神经元样细胞诱导分化。方法:取2～3月龄新鲜健康流产人胚股骨,切碎,接种玻璃培养瓶内培养8～12h,待较多的成纤维细胞贴壁,立刻将未贴壁细胞转种至塑料培养瓶培养,并多次传代;用甲氧酚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)诱导培养的细胞,免疫细胞化学方法检测诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况。结果:原代培养3d可见塑料培养瓶内有长梭形细胞生长,至第10天前后形成集落样克隆,传至第4代后呈单层漩涡状排列的长梭形的成纤维样细胞,已无明显细胞克隆形成,经多次传代,细胞保持良好的增殖能力和稳定的性状;免疫细胞化学方法显示未诱导细胞NSE、Nestin、GFAP阴性,诱导后细胞NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性,间接证实培养所得细胞是MSCs。结论:差速贴壁培养法从早期人胚股骨中分离纯化MSCs,去除可能的成纤维细胞污染,是简便有效的,可供有关研究参考选择。     

bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）在体外条件下对骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经千细胞（NSCs）和神经样细胞分化的诱导作用。方法 采用出生4周左右大鼠的全骨髓细胞进行培养，传至第3代时，分为两组：实验组细胞加入bFGF和EGF，进行诱导分化；对照组不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察，记录BMSCs的诱导分化情况，并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单抗鉴定。结果 实验组诱导7d后有部分细胞具备神经元样细胞形态，胞体锥形或圆形，有较长单极或多极的突起，均有Nestin、NSE、GFAP阳性细胞表达，且3种细胞数量差别有显著性（t=3．266～6．099，P〈0．05）。而对照组细胞仍为典型的成纤维细胞形态，无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。结论 bFGF、EGF可以诱导BMSCs向NSCs分化，并可调控神经元分化，促进神经元细胞成熟。     

大鼠神经干细胞体外培养的研究

目的：比较两种不同的分离培养方法对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。方法：分离新生24小时内的SD大鼠脑组织细胞,采用无血清培养技术进行体外扩增培养,分别以机械吹打法和胰酶消化法两种方法进行扩增培养、传代。免疫细胞化学法对NSCs 及其分化后的细胞进行Nestin,NSE,GFAP,CNP的鉴定。结果:分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力及Nestin 表达阳性,诱导后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。无论第一代或第二代比较,胰酶消化组NSCs 的增殖明显高于机械吹打组。结论:实验中分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs ,可诱导分化为终末神经细胞。在两种分离培养方法中,以胰酶消化法培养可获得更多的NSCs 。     

胰岛素样生长因子-1诱导新生小鼠海马源性神经干细胞增殖分化的研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对新生小鼠海马源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法通过取新生C57BL／6J小鼠海马组织,机械分离,体外培养NSCs,特异性标志蛋白Nestin免疫荧光鉴定。在细胞培养液中加入100μg／L的IGF-1记为IGF-1组,同时设立正常细胞对照组。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,GFAP、133Tubulin细胞免疫化学检测细胞分化情况。结果体外成功培养NSCs,特异性蛋白Nes-tin具有表达。IGF-1组NSCs较对照组增殖显著,且IGF-1组细胞具有显著的迁移和分化能力。细胞免疫荧光鉴定,IGF-1可促进细胞分化为星形胶质细胞和神经元（P〈0．05）。结论IGF-1能够促进体外培养的新生小鼠海马源性NSCs增殖,并诱导NSCs向星形胶质细胞和神经元分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的促增殖、分化作用及其机制。方法:取孕16天SD胎鼠海马NSCs培养,分别设空白对照组,己烯雌酚1×10-7 mol/L组、1×10-8 mol/L组、1×10-9 mol/L组,以及脑源性神经营养因子(BDNF)5×10-2 mg/L组;免疫荧光化学方法检测Nestin、神经元特异烯醇化酶及神经胶质酸性蛋白的表达,RT-PCR检测BDNF mRNA的含量。结果:不同剂量己烯雌酚处理各组神经球面积、积分光密度值、平均突起长度与平均突起数均增加,其中10-8 mol/L组海马NSC增殖与分化最明显,BDNF mRNA表达量亦最高(P<0.01)。结论:己烯雌酚对海马NSCs的增殖分化具有促进作用,且可能与上调BDNF的表达有关。     

EPO促进胚胎神经干细胞向神经元分化的形态学研究

目的：探讨促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）促进神经干细胞（neural stem cells ,NSCs）分化的形态学表现,为细胞移植治疗脑部疾病和脑损伤提供实验依据。方法取大鼠14 d胚胎脑皮质先增殖培养,后贴壁分化培养。适时镜下观察,免疫细胞化学染色,用nestin鉴定NSCs ,GFAP鉴定神经胶质细胞、MAP2鉴定神经元。选取第3代 NSCs ,向培养基中分别添加不同剂量的 EPO ,浓度分别为0．5u/ml ,5u/ml ,50u/ml ,500u/ml ,并设不添加EPO的对照组,MAP2免疫荧光共聚焦显微镜观察NSCs向神经元方向的分化。结果1）鼠胚脑皮质在无血清悬浮培养形成大量神经球,并可传代,球内细胞均表达 nestin。分化培养,可检测出MAP2或GFAP阳性细胞。2）EPO≥5u/ml各组分化培养,表达MAP2阳性细胞显著升高（P＜0．05）。结论大鼠胚胎脑皮质体外培养可获得NSCs ;适当浓度EPO可提高NSCs向神经元的分化。     

人NSCs分化的Astrocyte系中HCMV感染的建立

目的研究HCMV能否感染体外培养的由人海马神经干细胞（NSCs）分化成的星形胶质细胞（astrocyte）。方法体外分离、培养人NSCs,诱导其定向分化为星形胶质细胞,观察细胞的形态学特点并分别进行免疫荧光鉴定。然后用HCMVAD169株感染分化细胞,观察细胞形态变化,检测胞内病毒蛋白表达,并收集感染细胞的培养液,添加到正常人胚肺细胞中,观察有无典型细胞病变出现。结果体外原代培养的人NSCs绝大多数都表达巢蛋白（nestin）,诱导其分化为星形胶质细胞后,细胞高表达神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。HCMVAD169感染细胞7d后,细胞出现肿胀、变大变圆等典型病变,胞核内检测到HCMV即刻早期基因表达产物-IE蛋白,添加感染细胞的培养液到人胚肺细胞中,细胞也出现典型病变。结论上述结果说明：在体外培养的由人NSCs分化成的星形胶质细胞中,HCMVAD169能够建立增殖性感染,这可能与先天性感染导致脑发育异常有关。     

大鼠创伤性颅脑损伤后脑室下区内源性神经干细胞的增殖与分化

目的探讨创伤性脑损伤后脑室下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）的增殖分化的时程变化。方法采用随机数字表法将大鼠 分为3组,对照组不做任何处理,假手术组仅切开头皮和颅骨开窗,实验组采用Feeney氏法造成颅脑损伤（TBI）。选用Nestin与 BrdU两种细胞标志物及神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质细胞标志物GFAP,采用免疫荧光化学方法对3 组脑组织标本分别行双标蛋白抗体免疫荧光染色,检测TBI 后SVZ 内源性NSCs 的增殖、分化变化。结果TBI 后,伤侧 SVZNestin/NSE 、Nestin/GFAP、BrdU/NSE、BrdU/GFAP标记阳性细胞均明显增多,伤后第1天开始升高,第3天达峰值,第14天 恢复正常,实验组4个时间点间及实验组与对照组对应时间点间的比较差异均有显著性意义,其中以Nestin/GFAP标记的增殖分 裂阳性细胞升高最显著。结论TBI后,动员了伤侧SVZ中的NSCs,诱导该区内源性NSCs的增殖分化,提示SVZ是NSCs增殖 分化的重要的生发中心之一。     

NSE、S100及GFAP在视网膜母细胞瘤中的表达及意义

目的探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）、酸性钙结合蛋白（S100）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在视网膜母细胞瘤（Rb）中的表达及临床意义。方法对32例Rb眼球摘除标本进行病理切片,观察其形态及免疫组化染色NSE、S100、GFAP表达,并分析与肿瘤分化程度及临床分期的关系。结果Rb临床分期与病理分期并不完全一致。免疫组化显示,未分化型Rb中NSE染色阳性,GFAP和S100均呈阴性;而高分化型肿瘤中NSE染色阳性,胶质细胞、瘤间神经纤维GFAP和S100染色呈阳性。结论钙化是肿瘤的特征表现,肿瘤坏死与瘤细胞分化相关。肿瘤含有NSE阳性的神经元性瘤细胞,高分化型肿瘤可见S100、GFAP阳性的胶质细胞。