构建携带hIL-10基因的腺病毒载体及其对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:构建携带人白细胞介素(human interleukin,hIL)-10基因的腺病毒载体,细胞学及动物模型实验鉴定其介导的目的基因表达,并验证其对大鼠肝细胞损伤的保护作用?方法:以pORF-hIL10质粒为模板,PCR扩增hIL-10基因,插入腺病毒质粒pDC315,构建pDC315-hIL10?将质粒pDC315-hIL10与腺病毒包装质粒共转染至293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hIL10;感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达;建立体内外大鼠肝细胞损伤模型,验证Ad5-hIL10对肝细胞损伤的保护作用?结果:经PCR扩增?鉴定,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL10?大鼠肝细胞感染Ad5-hIL10后,随着病毒感染强度的升高,hIL-10表达明显上升?大鼠肝细胞体外培养模型预先感染病毒Ad5-hIL10,经四氯化碳诱导损伤,则细胞存活率随感染强度(multiplicity of infection,MOI)值升高而增加,至MOI=50时,细胞存活率恢复至92%;大鼠体内肝损伤模型显示,与损伤对照组和空白病毒对照组比较,Ad5-hIL10处理的大鼠肝细胞水样变性和间质炎症反应均减轻,肝功能的各项指标均有明显改善(P < 0.05)?结论:成功构建了重组腺病毒质粒Ad5-hIL10,且能明显提高肝细胞的存活能力,对肝功能有明显保护作用?     

标准桃金娘油对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症的影响

[目的]研究标准桃金娘油对慢性阻塞肺疾病（COPD）大鼠模型气道炎症的影响。[方法]24只Wistar大鼠随机分为3组：①对照组：不加任何干预;②COPD组：吸烟14支／次&#215;2次／d&#215;6d／周&#215;12周;③标准桃金娘油组：吸烟情况同COPD组,每日吸烟前给予标准桃金娘油灌胃治疗至第12周末。12周后测定肺功能;行支气管肺泡灌洗计数白细胞;用ELISA法测定肺部TNF—α、IL-6的含量;用HE染色评估肺部病理改变;用免疫组化法测定气道上皮ICAM-1的表达。[结果]①COPD组和标准桃金娘油组大鼠出现明显肺气肿病理改变和气流阻塞。②BALF细胞总数及中性粒细胞数结果：正常对照组分别为（1．30&#177;0．10）&#215;10^7／L与（0．09&#177;0．04）&#215;10^7／L,COPD模型组分别为（1．99&#177;0．94）&#215;10^7／L与（0．27&#177;0．13）&#215;10^7／L,P均〈0．05;标准桃金娘油组为（1．71&#177;0．97）&#215;10^7／L与（0．15&#177;0．05）&#215;10^7／L,较COPD模型组减少（P均〈0．05）。③支气管上皮ICAM—1表达及肺组织内TNF—α、IL-6表达：COPD模型组分别为6．99&#177;0．81,（860．82&#177;53．62）pg／mL,（689．01&#177;49．05）pg／mL,较对照组[分别为4．22&#177;0．74,（159．08&#177;46．65）pg／mL,（411．5&#177;26．60）pg／mL]增高（P均〈0．05）;标准桃金娘油组表达分别为5．04&#177;0．88,（668．36&#177;31．07）pg／mL,（589．64-4-19．03）ps／mL,较COPD组降低（P均〈0．05）。④COPD组BALF中性粒细胞数与支气管上皮ICAM-1表达强度呈正相关（r=0．571,P〈0．05）,也与肺组织中TNF-α、IL-6含量呈显著正相关（r=0．623、0．691,P均〈0．05）。[结论]吸烟可增加大鼠气道炎症反应,标准桃金娘油能改善由吸烟导致的气道炎症。     

监测血清TNF-α和IL-6水平在重症急性胰腺炎患者的变化及意义

目的探讨TNF-α和IL-6在重症急性胰腺炎（SAP）患者血清中的变化及临床意义。方法应用ELISA法检测32例重症急性胰腺炎及25例对照组血清TNF-α、IL-6的水平变化。结果人院时SAP患者TNF-α水平（48．5&#177;12．1）pg／mL显著高于对照组（13．5&#177;3．8）pg／mL,IL-6水平SAP患者（66．7&#177;19．3）pg／mL较对照组（42．3&#177;14．2）pg／mL无明显升高;SAP患者血清IL-6在入院的第7天升高最明显（180．1&#177;41．4）pg／mL,高于对照组,在入院第14天SAP患者血清TNF-α（29．5&#177;9．5）pg／mL,IL-6（102．8&#177;24．6）pg／mL仍然高于对照组。结论检测血清TNF—α和IL-6的水平变化,对重症急性胰腺炎的早期诊断、病情判断和预后评估具有重要的应用价值。     

丹红注射液治疗急性脑梗死患者对血浆TXB2、6-Keto—PGF1a的影响及临床疗效观察

目的观察丹红注射液治疗急性脑梗死患者的临床效果及对血浆TXB2、6-Keto-PGF1a含量变化的影响。方法将100例急性脑梗死患者分为两组,对照组40例,予常规基础治疗。治疗组60例在常规基础治疗的基础上,给予丹红注射液治疗。2周后,比较两组患者治疗前后神经功能缺损评分（NIHSS）、临床疗效及血浆TXB2、6Keto—PGF1a含量的变化。结果对照组和治疗组治疗前NIHSS分别为（8．02&#177;2．13）分与（8．56&#177;1．27）分（P〉0．05）,而治疗后两组N1HSS分别为（6．42&#177;1.55）分与（4．36&#177;1．07）分（P〈0．05）;对照组和治疗组临床总有效率分别为77．5％与91．7％（P〈0．05）;对照组和治疗组在治疗前血浆TXB2含量分别为（426．33&#177;224．21）pg／mL与（451．52&#177;249．71）pg／mL（P〉0．05）,而治疗后分别为（312．46&#177;176．96）pg／mL与（258．59&#177;158．55）pg／mL（P〈0．05）,两组治疗后均较治疗前下降（P〈0．05）,治疗组在治疗后TXB2含量低于对照组（P〈0．05）;对照组和治疗组在治疗前血浆6-keto—PGF1a含量分别为（247．73&#177;106．19）pg／mL与（233．90&#177;85．72）pg／mL（P〉0．05）,而治疗后分别为（327．34&#177;134．67）pg／mL与（400．94&#177;111．26）pg／mL（P〈0．05）,两组治疗后均较治疗前升高（P〈0．05）,治疗组在治疗后6-keto—PGF1a含量高于对照组（P〈0．05）。结论丹红注射液治疗急性期脑梗死能明显减轻神经功能缺失,其机理可能与调节TXB2／6-Keto-PGF1a平衡、抑制血小板聚集、改善脑血流有关。     

RNA干扰Tax基因表达及其对HTLV-Ⅰ在TLC中转录的影响

目的探讨RNA干扰Tax基因表达对人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型（HTLV—I）在T淋巴细胞（TLC）中表达的影响。方法运用RNAi技术特异性干扰Tax基因的表达,流式细胞技术和western blot法鉴定Tax蛋白的表达情况,并通过p27特异性蛋白的检测反映HTLV—I在TLC中表达。结果重组质粒psiTax／U6转染T细胞组Tax蛋白的表达（9．84&#177;3．32）％较未处理组（47．45&#177;14．52）％和pSilencer1．0／U6转染组（45．98&#177;10．66）％明显降低;western blot法显示重组质粒psiTax／U6转染TLC后。Tax以及p27蛋白表达较pSilencer1．0／U6转染组明显降低。结论运用RNA技术干扰Tax基因表达可以有效的阻止HTLV—1在TLC中的转录。     

血浆同型半胱氨酸等水平变化与急性脑梗死的关系

目的 探讨血浆同型半胱氨酸（Hcy）、内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、叶酸（FA）、维生素B12（VitB12）水平变化与急性脑梗死（ACl）的关系。方法测定110例ACl患者及51例健康对照者的血浆Hcy,ET、NO、FA、VitB12含量。结果ACl组血浆Hcy[（17&#177;5）μmol／L]、ET[（33&#177;19）μmol／L]显著高于对照组[（10&#177;3）μmol／L、（20&#177;13）μmoL／L]，P〈0．01；NO[（40&#177;7）μmol/L]、FA[（8&#177;4）ng／ml]、VitB12[（247&#177;119）pg／ml]的水平低于对照组[（60&#177;6）μmol／L、（10&#177;4）ng／ml，（412&#177;194）pg/ml]，P〈0.01,结论本研究对于患者病情观察、预后判断具有重要意义，尤其是在患者中推行加服FA和VitB12等制剂，为ACl的预防和治疗开辟了新的途径。     

冠心病患者血浆sICAM-1和IFN-γ的水平

目的探讨可溶性细胞黏附因子-1（sICAM-1）和γ干扰素（IFN-γ）在冠心病发病过程中的作用及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）对50例冠心病人（急性心梗14例，不稳定心绞痛16例，稳定性心绞痛20例）和30例正常人血浆中sICAM-1和IFN-γ水平进行检测。结果冠心病患者血浆sICAM-1和IFN-γ的水平分别为（344．25±70．55）ng／ml和（1．877±0．104）pg／ml，显著高于正常对照组（146．35±32．69）ng／ml和（0．072±0．014）pg／ml（P〈0．05）；急性心梗组二者的水平分别为（453．54±83．92）ng／ml和（2．316±0．129）pg／ml，显著高于不稳定型心绞痛组[（309．96±55．74）ng／ml和（1．722±0．047）pg／ml]和稳定型心绞痛组[（244．37±60．23）ng／ml和（1．223±O．132）pg／ml]（P〈0．05）。结论血浆sICAM-1和IFN-γ与冠心病的发生与发展相关，二者水平的检测对冠心病诊断及病情监测有重要意义。     

腺病毒介导p55γ基因N末端的过表达对胃癌细胞增殖的影响

目的：通过腺病毒介导,研究磷脂酰肌醇3-激酶p55γ调节亚基N末端24个氨基酸的过表达对胃癌MGC803细胞生长增殖的影响。方法：在HEK293细胞中扩增重组腺病毒Ad—N24-GFP以及空载体病毒Ad—GFP,并进行病毒滴度以及腺病毒对胃癌细胞感染率的测定,免疫印迹方法鉴定重组腺病毒感染MGC803细胞后融合蛋白N24-GFP的表达。通过细胞生长曲线和克隆形成实验观察Ad—N24-GFP对细胞增殖的影响。结果：重组腺病毒经过感染HEK293细胞后大量扩增,病毒滴度测定为1．0&#215;10^10pfu／ml,重组腺病毒对MGC803细胞的感染率在感染复数（MOI）为100时最强。与空载体细胞相比较,N24-GFP的高表达明显抑制MGC803细胞的生长,且抑制程度随病毒感染复数的增加呈逐渐增强的趋势;感染Ad—N24-GFP组细胞的克隆形成率[（28．30&#177;3．25）％]明显低于对照组细胞[（42．16&#177;2．84）％,P〈0．05]。结论：腺病毒介导N24p55γ基因的过表达能抑制胃癌细胞MGC803的增殖,其在胃癌基因治疗上可能具有潜在的应用前景。     

骨保护素的克隆及对骨髓问充质干细胞分化的影响

目的：克隆人骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）基因并构建其重组腺病毒,观察其对BMSCs分化的影响．方法：RT-PCR方法从人肝克隆OPG基因全长cDNA,利用穿梭质粒将OPG基因重组获得复制缺陷型重组腺病毒AdOPG;分离培养兔骨髓间充质干细胞,使用AdOPG感染兔BMSCs,以RT-PCR及Western Blot的方法鉴定BMSCs对OPG的表达。比色测定和细胞碱性磷酸酶染色法观察AdOPG感染BMSCs后5d时碱性磷酸酶（AIJP）的表达。结果：克隆获得人OPG基因,测序与Genebank一致,构建的重组腺病毒AdOPG滴度达10^9 efu／ml,AdOPG感染BMSCs5d后ALP活性值为（21024&#177;507）IU,AdGFP对照组为（3079&#177;89）IU,空白对照组为（2156&#177;78）IU。结论：骨保护素有利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。     

rhG-CSF动员正常供者与恶性血液病患者外周血造血干细胞质量的比较

目的探讨正常供者与恶性血液病患者使用重组人粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）动员后,用血细胞分离机采集的外周血造血干细胞,通过形态学观察PBSC中淋巴细胞比例及单个核细胞活力。方法分别对15例正常供者和14例恶性血液病患者使用rhG—CSF动员剂,用血细胞分离机采集外周血中单核细胞（MNC）,观察有核细胞数、有核细胞分类、MNC计数及细胞活力。结果（1）正常供者组采集的PBSC有核细胞总数为（4．31&#177;1．41）&#215;10^8／kg,恶性血液病患者组有核细胞总数MNC数为（6．21&#177;4．37）&#215;10^8／kg。（2）恶性血液病组采集的PBSC有核细胞数高于供者组（P〈0．01）。（3）用淋巴细胞比值乘以有核细胞总数计算单个核细胞,正常供者组（2．82&#177;1．03）&#215;10^8／kg、恶性血液病患者组（2．58&#177;1．79）&#215;10^8／kg,正常供者组与恶性血液病组单个核细胞数比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）正常供者组MNC计数为（96．7&#177;5．1）％,其中淋巴细胞占（65．9&#177;9．4）％、粒细胞占（16．3&#177;8．7）％、单核细胞占（16．5&#177;4．0）％;恶性血液病组MNC计数为（92．7&#177;15．6）％,其中淋巴细胞占（55．3&#177;16．7）％、粒细胞占（24．3&#177;16．5）％、单核细胞占（14．9&#177;9．1）％。（5）正常供者组冻存前后细胞活力分别为（91．5&#177;4．3）％、（67．4&#177;9．1）％,恶性血液病组冻存前后细胞活力分别为（82．9&#177;11．1）％、（56．5&#177;20．1）％;两组冻存前后细胞活力差异均有显著性（P〈0．01）。（6）rhG—CSF动员前后正常供者组及恶性血液病组T细胞在CD3单克隆抗体＋rhIL-2刺激下,外周血T淋巴细胞的增生能力在应用rhG—CSF后下降[（68．5&#177;15．1）％vs（52．3&#177;12．5）％（P〈0．05）。结论单用rhG—CSF或化疗联合rhG—CSF动员均可采集到足够数量的外周血造血干细胞,应用淋巴细胞乘以有核细胞数作为外周血造血于细胞移植时计算输入外周血造血干细胞数量的指标时简便、快捷,不失为一良好的临床检测方法。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

双亚基共表达人白细胞介素12重组腺病毒载体的构建与应用

目的构建双亚基共表达人白细胞介素１２（ＩＬ－１２）重组腺病毒载体,为其临床研究提供实验基础。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ分别克隆出人ＩＬ－１２两个亚基ｐ４０和ｐ３５的全长编码ｃＤＮＡ,经脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点（ＩＲＥＳ）序列连接后置于ＣＭＶ启动子下游,将其插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ,构建成人ＩＬ－１２的双顺反子共表达重组腺病毒载体;与ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞,经同源重组制备人ＩＬ－１２的重组腺病毒。结果扩增到的人白介素１２重组腺病毒滴度为２．１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ,体外感染２９３细胞、ＨｅｐＧ２细胞和人原代皮肤成纤维细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测证实人ＩＬ－１２的表达（３０～５０ｎｇ／１０６细胞／２４小时）,所表达的ＩＬ－１２体外能刺激人淋巴母细胞的增殖和ＩＦＮ－γ的产生。结论所制备的人ＩＬ－１２双亚基共表达重组腺病毒载体能有效表达具有生物学活性的人ＩＬ－１２,可望进一步用于临床研究。     

腺病毒介导的脾酪氨酸激酶对血管平滑肌细胞表型转换的影响

目的 构建脾酪氨酸激酶(Syk)重组腺病毒并感染血管平滑肌细胞(VSMC),观察Syk对VSMC表型转换的影响.方法 运用pDC315-GFP腺病毒载体系统,细菌同源重组法构建含目的 基因Syk腺病毒重组质粒pDC315-GFP-Syk,经过包装、扩增、纯化后获得Syk重组腺病毒;测定病毒滴度并感染体外培养的大鼠VSMC,饥饿处理24 h,用Real-time PCR法和Western blot法对Syk、平滑肌22a蛋白(SM22α)及平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)表达活性进行检测,观察Syk对平滑肌细胞表型转换的影响.结果 成功构建携带Syk基因的重组腺病毒,纯化后滴度为1011 pfu/mL,腺病毒感染VSMC后5 d,与空病毒组和对照组相比,Syk mRNA(741638.70±35213.53)和蛋白表达水平(2.14±0.71)增高(P<0.01);α-SM-actin(0.80±0.04)和SM22α mRNA表达水平(1.00±0.01)下降(P<0.05),同时,二者的蛋白表达水平也降低(0.61±0.10和0.18±0.06,P<0.01).结论 在VSMC中,Syk通过对其表型转换进行调控,进而影响平滑肌细胞的增殖和迁移.     

负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的 包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138).方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1、3Cre共转染人胚肾293细胞...     

携带hVEGF121-EGFP融合基因的腺病毒表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子121(HUMAN VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR121,HVEGF121)和增强型绿色荧光蛋白(ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN,EGFP)融合基因的腺病毒表达载体,观测其表达。方法以PUC18-HVEGF121质粒中的HVEGF121CDNA为模板,用PCR法扩增HVEGF121CDNA片段并去除其终止密码子,将此片段连接到含有EGFP CDNA的PEGFP-N1质粒中,再将融合基因HVEGF121-EGFP克隆到穿梭质粒PDC315中,与腺病毒质粒共同转染293细胞,构建重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度,并用免疫组化法检测VEGF121在NIH3T3中的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为1.2×1010~2.7×1011PFU/ML。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光表达。免疫组化结果也证明VEGF121能在NIH3T3中的表达。结论构建的HVEGF121-EGFP腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗,并观察外源基因在体内的表达。     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。     

以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体

目的 构建肾癌相关抗原G250重组腺病毒载体,以期用于基因转染树突状细胞(DC)治疗肾癌的实验研究.方法 利用AdMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC316-G250,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre以CaCL2法质粒共转染293细胞得到重组腺病毒Ad/G250,CsCl梯度离心纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度.Ad/G250转染DC细胞,RT-PCR及流式细胞仪检测G250的表达.结果 采用双质粒共转染293细胞,Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含外源基因的Ad/G250载体.经过PCR、RT-PCR和流式细胞仪证实腺病毒载体构建成功.病毒经过CsCl梯度离心纯化后,Ad/G250滴度达到5.6×109 U/ml.RT-PCR及流式细胞仪显示Ad/G250在DC中特异性表达.结论 成功构建了G250重组腺病毒载体.     

表达抗G250人源性抗体增殖缺陷型腺病毒的构建

目的构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。方法通过重叠延伸PCR、常规PCR方法,分别获得G250重链的可变区和恒定区（GH）eDNA序列及G250轻链（GL）eDNA序列,并克隆至pCLON12-IRES载体上,构建质粒pCLON12-GL-IRES—GH。酶切质粒pCLON12-GL—IRES—GH回收GL—IRES—GH片段,克隆至腺病毒载体pDC315,构建pDC315-GL—IRES—GH（pDC315-G250）。将pDC315-G250与腺病毒包装骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞,重组包装表达G250抗体的增殖缺陷型腺病毒AdDC315一G250。纯化病毒表达的G250抗体,免疫印迹实验检测该抗体能否与细胞表面抗原特异性结合。结果PCR及测序结果表明成功构建质粒pCLON12-GL—IRES—GH及腺病毒穿梭质粒pDC315-G250。PCR鉴定表明重组腺病毒AdDC315-G250含有目的基因,病毒包装成功。免疫印迹实验结果显示,纯化的抗体在G250抗原阳性的细胞中能检测到目的条带。结论成功构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。