兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的:建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型,观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法:实验于2005-03/07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养:日本大耳兔20只,利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞,无血清生长因子培养基(成分:DMEM:Ham’sF12为1∶1,并加入以下激素及生长因子:10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μg/L甲状腺素、0.4mg/L氢化可的松、7.5mg/L内皮细胞生长支持物、25μg/L表皮生长因子、1mmol/L-谷氨酰胺,100IU/mL青霉素,50mg/L链霉素)体外培养。②细胞纯度及鉴定:用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应,二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果:①气管上皮细胞的分离:低温消化加刷洗法获得的气管上皮细酶胞数量较多,呈圆形,较大,悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征:皿接种细胞24h后,贴壁率约为60%,细胞增大,并进入分裂套相。五六天后细胞增殖旺盛,部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长,在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃,第3周纤毛逐渐消失成遗迹,细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察:见纤毛由细胞顶膜伸出,大部分集结成束,除纤毛外,还可有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定:抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性,细胞达(91±3)%。结论:酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养,以建立兔气管纤毛可上皮细胞的原代培养模型,具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

目的：探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法，以便获得大量的神经干细胞，方法：实验于2003-06／10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成分别取出生3d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质，用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞，进行细胞培养，加20μg／L表皮生长因子，20μg／L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长，用半定量法换培养液，用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定，流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测。结果：①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性，证明这些细胞为神经干细胞。②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快。③改进的胰蛋白酶消化法得到了1&;#215;10^8L^-1单细胞，避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片。④含20μg／L表皮生长因子和20μg／L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养。⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势。结论：SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下。神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用。采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率，应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率。     

兔肌源性干细胞的分离及诱导分化为成骨细胞的观察

目的：探讨兔肌源性干细胞的分离、鉴定和诱导分化的方法。方法：取2月龄幼兔臀肌1g，采用胶原酶，dispase，胰蛋白酶分步消化，针头过滤，差速贴壁法分离肌源性细胞。用锥虫蓝染色细胞计数描记生长曲线，MTT法间接反映细胞增殖活性。作Bc1-2，Desmin免疫细胞化学染色鉴定肌源性细胞。用分化培养基(DMEM 5mL／L FBS 50mL／L HS 10mg／L BMP2 5g／L 维生素C 10mmol／L β-甘油磷酸钠＋10mg／L 地塞米松 10g／L 青霉素／链霉素)诱导细胞分化，用Osteocalcin，碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定成骨前体细胞。结果：用上述方法分离的肌源性细胞呈短梭形或多角形，体积明显小于肌细胞，24h贴壁，接种后36h开始增殖，生长有明显的方向性，原代肌源性干细胞对数生长期为7～9d，16d汇合。第3代肌源性干细胞接种后第3～5天为对数生长期，约8d汇合。细胞汇合后少部分细胞出现双核或三核，甚至出现核链，显示肌细胞分化倾向。约60％～70％的原代肌源性干细胞Bc1-2，Desmin免疫细胞化学染色呈阳性。用成骨细胞分化培养基中培养2周后，大部分细胞Osteocalcin碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性，显示其成骨前体细胞分化。结论：用上述方法分离的肌源性细胞具有干细胞特征，并能在体外分化为成骨前体细胞和肌起源细胞，是一种组织特异性干细胞，即肌源性干细胞。     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织，而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法，观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006—03／2007—06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸，在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部），即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞，锥虫蓝染色显示细胞活性达90％以上，将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞，用含10％胎牛血清以及10μg／L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12d后于倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞，贴壁的间充质干细胞形态均匀，呈长梭形，克隆样生长，增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速，诱导后细胞形态明显改变，呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞，在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景：体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题。 目的：观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法。 设计：单一样本观察。 单位：四川大学生命科学院细胞生物学实验室。 材料：孕14dSD大鼠10只。DMEM／F12 1：1，碱性成纤维细胞生长因子，表皮生长因子；巢蛋白抗体IgG，β-微管蛋白Ⅲ抗体IgG，胶质纤维酸性蛋白抗体IgG，生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗。 方法：实验于1999／2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成。①从胎鼠前脑取出脑组织，采用酶消化．机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆。②神经干细胞以2&;#215;10^8 L^-1密度接种培养，分4组，每组6瓶细胞，DMEM／F12组：加入DMEM／F12（1：1）培养基含体积分数为0．1的小牛血清；碱性成纤维细胞生长因子组：培养基为含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子；表皮生长因子组：培养基含30μg／L表皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子＋表皮生长因子组：先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2h后再换成含表皮生长因子的培养基培养。培养24h后更换培养瓶，培养14d后显微镜下计数原代克隆数，免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达。 主要观察指标：①神经干细胞的原代克隆。②单细胞克隆培养结果。③诱导分化结果。 结果：①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力，免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高（0．630％）。③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 结论：①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞。②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法。     

犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难，尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。方法：获取犬小块阴道组织，机械分离阴道黏膜上皮，Dispase 酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞，接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代；机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞，在含体积分数10%胎牛血清的 DMEM 培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况，分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展，四五天后呈对数生长，七八天可达70%融合，为单一的上皮细胞，呈典型铺路石样，未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次，连续传代六七次，细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形，此后呈对数生长，4 d后融合呈典型的“峰和谷”样，每三四天可传代1次，连续传代七八次，细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实，犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养，可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。     

体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的：采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞，选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的最佳方法。方法：实验于2004—12／2005—10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行。①取新生儿脐带约5cm长（家属志愿提供）原代分离血管平滑肌细胞；分别用贴块法和胰酶／胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞。②贴块法：将血管平滑肌细胞组织块20％M199完全培养基（200mL/L胎牛血清＋10mL／L双抗＋5mL/L-谷氨酰胺）贴壁24h后，补足完全培养基培养；胰酶／胶原酶酶解法：第1步胰酶消化：将脐动脉剪成1mm&;#215;1mm大小。装入含2．5g／L胰酶培养瓶中，消化15-30min，加入20％M199完全培养基终止消化。第2步胶原酶消化：将上述处理过的组织块放入含1g／LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中，过夜，离心，收集细胞，以1&;#215;10^4个细胞／cm^2密度接种培养皿中，补足20％M199完全培养基培养。③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌α-肌动蛋白表达情况进行观察和检测。结果：①贴块法：组织块种植后2周时，多数细胞已贴壁伸展。4～6周细胞达80％融合时，镜下成“峰与谷”样，可传代培养，传代间隔期一般是两三周；胰酶／胶原酶酶解法：细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞，达到生长融合时细胞密度低。2周左右细胞融合，可传代培养。传代间隔期一般是一两周。②贴块法获得的细胞初期生长速度慢，但达到融合前细胞数量多，细胞得率高；胰酶／胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快，群体倍增时间短，但达到融合前细胞数量少于贴块法，细胞得率低。（曼）胰酶／胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法（93．1％．71．4％，x^2=4．626，P〈0．05）。结论：两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞；贴块法合成表型细胞比例大，胰酶／胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大，后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

背景：对于神经千细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握。 目的：采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006～10/2007—09在广西医科大学基础医学实验室完成。材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEMIF12培养基中培养。主要观察指标：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果：培养24h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团：48h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增。免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达。 结论：在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖。     

一种高效实用的人卵巢表面上皮细胞培养方法**

背景：体外分离培养纯度高、活力强且生物学特性稳定的卵巢表面上皮难度很大,目前原代培养主要采用组织块贴壁法和酶消化法,但这两种方法在取材、细胞活力及细胞纯度上都存在一定的问题。目的：建立一种高效实用的人卵巢表面上皮分离、培养和鉴定方法。方法：创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮,以红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化,并向无血清 DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态,应用苏木精-伊红染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定,并绘制生长曲线。结果与结论：卵巢表面上皮培养24 h 开始贴壁生长,7-12 d 后基本达到融合,细胞呈多角形或扁平型,透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性,所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物 CK19。细胞生长良好,可以传6-8代,细胞生长曲线呈“S”形,纯度达95%以上。结果提示细胞刷取培养法操作简单,能够快速分离获得大量卵巢表面上皮,所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯度达95%以上,且细胞生长稳定。     

2006年湖南省霍乱监测结果分析

目的 监测人群中霍乱病例和被霍乱弧菌污染的水体及食物,以便尽早采取预防控制措施,防止疫情扩散.方法 全省范围开展腹泻患者及外环境、食品监测,选择重点地区开展甲鱼霍乱弧菌污染状况专项监测.结果 2006年湖南省共登记腹泻患者111 526例,检测霍乱弧菌89 661例,检测率为80.39%,检出阳性4例,均为0139群霍乱弧菌感染;检测环境和食品样44 533份,其中水体35 113份,全部为阴性,水产品5377份,阳性16份,阳性率为0.30%,阳性标本为甲鱼和牛蛙,其他食品4043份,均为阴性;甲鱼专项监测2323份,检出阳性33份,阳性率为1.42%;霍乱毒素基因检测34株菌,20株为产毒株,占58.80%;药敏试验28株菌,均对诺氟沙星、环丙沙星、丁胺卡那霉素100%敏感,对强力霉素、复方新诺明的敏感率为92.86%.结论 甲鱼、牛蛙等水产品是湖南省发生霍乱的主要因素,应加强水产品的监测和卫生管理.     

新生儿抚触技术在产科中的应用体会

目的探讨新生儿抚触促进新生儿生长发育、融洽护患关系、提高产妇满意度的临床价值。方法选择2008年1月至2008年8月在我科住院正常分娩和剖宫产的健康儿200例,随机分为对照组100例,抚触组100例,观察新生几吃奶量、睡眠时间、排便时间和产妇满意度。结果抚触组新生儿吃奶量、睡眠时间、排便时间及产妇满意度均优于对照组。结论新生儿抚触既能促进新生儿生长发育,又能融洽护患关系,提高产妇满意度。是一种值得推广的简单易行效果好的新型护理技术。     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.     

流程管理在见习期护士护理培训管理中的应用研究

目的 探讨流程管理应用于护士见习期护理培训管理与现代护理继续教育管理的适应关系.方法 采用自行制定的各项护理培训管理流程及考核量化表对2006年及2007年的各50名见习期护士分别从护理部考核、科护士长考核、护士长考核、责任带教护师评价、患者评价、转正率角度按照职业道德、操作能力、服务质量、绩效考核、适应能力等5项指标进行2次测评.结果 评价者对见习期护士的2次测评评分比较,差异明显.结论 流程管理在见习期护士护理培训管理中的实施有利于临床护理管理规范化、程序化、科学化,是适应新医疗环境下对见习期护士较好的护理培训管理方式.