Rag1、Rag2基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

目的 建立重组激活基因,Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析.方法 通过传统的胚胎干细胞(ES)细胞打靶、囊胚注射方式,分别构建Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型;通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测;通过外源异种肿瘤细胞移植实验,对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价.结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低;人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu(裸小鼠)或(NOD-SCID)非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性.结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍,导致免疫系统严重缺陷,可作为异种外源肿瘤移植的受体,用于小鼠荷瘤模型的建立.     

RNA干扰膀胱癌实验动物模型研究进展

1膀胱癌实验动物模型 膀胱癌实验动物模型为膀胱癌的研究提供了一个有效的方法。膀胱癌动物模型的建立方法包括：①化学致癌剂诱发的动物膀胱癌模型;②膀胱癌移植瘤动物模型;③转基因或基因敲除的动物模型。     

人急性T淋巴细胞性白血病小鼠模型研究

急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)是一种具有高侵袭性特征的恶性血液肿瘤,建立稳定的动物模型是研究其发病机制及进行潜在治疗药物的前临床研究的重要前提。日益广泛应用的稳定的T-ALL小鼠动物模型主要有小鼠的异种移植模型和转基因小鼠模型。现就T-ALL的小鼠异种移植模型从小鼠品系、移植用细胞株、建模方式及模型的应用进行综述。     

利用CRISPR/Cas9技术建立NOD/SCID/IL2Rγ-/-免疫缺陷小鼠

目的NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠品系是最严重的免疫缺陷品系,广泛应用于异种移植的研究。然而,SCID突变是 Prkdc 基因的一个自发性突变,会导致T细胞发育阻滞后渗漏而且很难进行基因型鉴定。因此,开发一个敲除Prkdc和IL2Rγ基 因的新品系NSG小鼠非常重要。方法使用CRISPR/Cas9系统实现Prkdc和IL2Rγ基因的靶向敲除。将基因敲除小鼠与NOD 背景小鼠杂交,我们产生了新品系NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠,称为cNSG（中国NSG）小鼠。结果cNSG 小鼠完全缺乏T 细胞,B细胞以及NK细胞而且表达NOD突变。体内成瘤实验证实cNSG鼠是一种比免疫缺陷裸鼠更有效的异种移植模型。 结论cNSG 小鼠与Jackson实验室的NSG鼠的免疫缺陷一致,有望成为中国生物医学研究的重要异种移植模型。     

Prkdc和Il2rg双敲除免疫缺陷小鼠的构建和初步应用

目的：构建NOD背景免疫缺陷小鼠,作为新的人源肿瘤异种移植(patient?derived xenograft,PDX)模型。方法：利用 CRISPR/Cas9技术获得NOD背景Prkdc和Il2rg双基因敲除小鼠,通过正常繁育得到能够稳定遗传的纯合子后代(命名为NYG 小鼠),流式细胞术检测小鼠外周血免疫细胞比例,移植接种新鲜肿瘤组织,观察记录肿瘤生长状况及HE染色观察传代PDX 肿瘤形态学特点。结果：NYG小鼠外周血小鼠无成熟的T细胞、B细胞和NK细胞表达,对移植的患者肿瘤组织几乎没有排斥反应,组织病理学表型及免疫系统未见明显异常。结论：成功构建NYG小鼠免疫缺陷小鼠,为肿瘤学基础理论及应用研究提供了新的PDX动物模型。     

人源性肿瘤组织原位异种移植模型的特征及研究策略

人源性肿瘤组织原位异种移植模型(PDOX模型)能够更好地保持原发肿瘤的基因特征,在组织学、转录组、多态性和拷贝数变异中具有高的保真度,保留了原发瘤的微血管、基质成分和相互作用,以及肿瘤转移的特点,从而更加准确地预测临床患者的疾病预后,可以筛选出最合适的个体化治疗方案,在临床转化应用研究中显示出良好的前景。但由于小鼠和人体微环境仍有差别,原位移植瘤的形态结构与原发瘤仍存在一定差别,且原位移植并不能确保肿瘤发生转移。因此,构建个体化PDOX模型就需要分析移植瘤的组织形态和相关基因的表达,建立异种移植模型的数据库,共享异种移植模型的信息与研究结果,促进PDOX模型的转化应用。本文总结了PDOX模型的主要特征,概述了其优势以及局限性,并对应用进行了展望。     

ANP基因敲除小鼠的饲养繁育及基因型鉴定

目的繁殖和鉴定心房钠尿肽(ANP)基因敲除小鼠。方法将引进的ANP敲除杂合子小鼠进行饲养并繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型。结果获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(ANP+/-)、纯合子(ANP-/-)和野生型(ANP+/+),子代小鼠纯合率为9.09%。结论 ANP基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究ANP缺失对肿瘤发生发展的影响提供了理想的动物模型。     

昆明小鼠肺癌模型建立的初步研究

建立皮下异种肿瘤移植的昆明小鼠肺癌模型,为临床和基础研究提供理想的动物模型。方法采用培养细胞移植法,将人肺腺癌细胞系A549接种于昆明小鼠皮下,观察肿瘤移植成功率,并测瘤重,固定标本作石蜡切片、HE染色、组织学观察。结果昆明小鼠小腿皮下异种肺癌移植成功率为37.5%。结论利用人肺腺癌细胞系A549可以建立皮下异种肿瘤移植的昆明小鼠肺癌模型,但其成功率较低,仍需进一步完善。     

患者源性非小细胞肺癌异种移植模型的建立及个体化治疗策略研究

目的 通过将患者非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）临床手术标本接种于BALB/c裸小鼠,建立相应的移植瘤模型,为肺癌患者个体化治疗药物的筛查和临床前疗效的评估提供理想的动物模型。方法 收集患者非小细胞肺癌手术标本并将其植入裸鼠体内建立患者源性异种移植（patient-derived xenograft,PDX）模型,分析病理组织学形态,检测人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达,以及潜在靶标单胺氧化酶A(monoamineoxidase A,MAOA)的表达。进一步在此患者源性NSCLC异种移植模型中评估靶向药、临床一线化疗药物顺铂的抗肿瘤功效。结果 成功建立了患者源性的NSCLC异种移植瘤模型,该模型保留了源肿瘤组织病理学形态,且EGFR、MAOA呈阳性表达。使用EGFR抑制剂奥希替尼联合顺铂体现出良好的治疗效果;此外,MAOA抑制剂氯吉林也具有良好的抗肿瘤潜能,...     

PLCε基因敲除小鼠移植性肝癌模型的建立与分析

目的利用PLCε基因敲除小鼠建立移植性肝癌动物模型,以探讨PLCε基因在肝肿瘤生长发育过程中的作用。方法选取PLCε+/+小鼠15只为对照组,选取PLCε+/+(野生型)和PLCε-/-(敲基因型)小鼠各15只为模型组I和II,沿腹中线开腹后将H22细胞接种到模型组小鼠肝脏实质内,对照组注射生理盐水。于注射后第15天行剖腹探查,观察各组成瘤率及肿瘤体积,并进行肿瘤病理学分析。结果各组小鼠的存活率均为100%。模型组I肿瘤移植成功率为100%,肿瘤体积平均为(65.21±5.25)mm3。模型组II的肿瘤移植成功率为53.3%,肿瘤体积平均为(23.46±3.47)mm3。模型组I的肿瘤平均体积明显大于模型组II(P0.05)。模型I组和II组病理检查均证实为原位肝细胞瘤。结论成功建立了PLCε敲基因小鼠移植性肝癌动物模型,验证了PLCε敲基因小鼠具有抑制肝肿瘤生长的特性。     

裸小鼠内源性C型病毒的显现及其侵染异种移植瘤的电镜观察

裸小鼠因胸腺先天发育不良、T细胞免疫功能缺损而成为移植人体肿瘤的理想动物模型。近年发现,裸小鼠内源性C型病毒有侵染异种移植瘤的情况,其结果有可能改变移植瘤的生物学特性,使肿瘤生化、免疫研究复杂化。对于此类病毒的活化机制及其生物危害业已引起肿瘤工作者的重视。自1981年以来,本文作者在开展裸小鼠繁殖研究和建立异种移植瘤模型的过程中,对裸小鼠内源性C型病毒的显现特点及其侵染异种移植瘤的现象进行了比较系统的电镜观察,现将结果报告如下: 材料和方法实验所用的二个品系裸小鼠分别引自日本国和美国BALB/CA/JCL(nu/nu,un/+)及Swiss-DF(nu/     

经体外培养的肝癌组织人源性异种移植小鼠模型的建立

目的通过添加人工基质胶,对原代肝癌组织进行体外培养,进而建立肝癌组织人源性异种移植(PDX)小鼠模型。方法收集中山大学肿瘤防治中心肝胆科共5份肝癌组织,经清洗、冻存、复苏等处理,添加人工基质胶,进行为期50～80 d的体外培养;免疫缺陷小鼠肾包膜下接种建立肝癌组织人源性异种移植模型;建模小鼠饲养80～120 d后,取移植瘤进行病理学检测,苏木精-伊红(HE)染色观察组织形态,免疫组化染色检测甲胎蛋白(AFP)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的表达情况,每张玻片取3个视野统计阳性细胞,计算阳性率。结果 5例PDX模型中成功2例,建模成功率为40%。其中001号建模小鼠移植侧肾脏萎缩、质地变硬,移植瘤生长,肾脏周围附着大量附属物;004号建模小鼠腹腔大量腹水,且移植侧肾脏可见黄色肝癌病灶。病理HE染色可见移植瘤组织细胞异型性明显,核分裂增多,失去正常的结构;免疫组化法检测移植瘤组织AFP和GPC3,均呈阳性表达,平均阳性率分别为88%、93%;表明移植瘤组织均保留了原代肝癌组织特性及相应蛋白表达。结论经长期体外培养的原代肝癌组织成功构建人源性异种移植小鼠模型,实现PDX模型构建技术的突破,为进一步的肝癌药物筛选奠定基础。     

微囊包裹肿瘤细胞异种移植的实验研究

为了对化疗药物抗肿瘤效应进行在体恢速坪估，我们采用做囊包裹人肿瘤细菌技术。建立了人类卵巢癌小鼠异种移植动物模型。植人小鼠体内的微囊在给药后不同时期予以回收。根据回收的微囊内肿瘤细菌生长抑制率，对化疗药物的抗肿瘤效应作出评价。结果表明：微囊包囊的肿瘤细胞能在小鼠体内生长而不被排斥。所用各种化疗药物均能透过微囊包膜并抑制囊内肿埔细胞的增殖，因此，微囊包裹肿瘤细胞异种移植模型可用于快速评估各种化疗药物对不同组织类型肿瘤细胞的抗瘤效应，为抗肿瘤药物的大规模筛选提供了合适手段     

心脏过表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的建立

目的 建立心脏过表达人源PRKAG2 (G100S)的转基因小鼠模型,为进一步研究该人源基因点突变对小鼠心脏发育、形态和功能维持的作用奠定基础.方法 克隆人源基因PRKAG2并构建点突变质粒,将人源PRKAG2 (G100S)插入α肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游,构建转基因表达载体.选用C57BL/6J小鼠为遗传背景,通过显微注射法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测人源PRKAG2 (G100S)的表达.结果 经过回交繁育后建立了2个品系的心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠品系F2代,并通过qPCR、蛋白质印迹法检测,确认了转基因小鼠心脏组织中人源PRKAG2(G100S)在rmRNA和蛋白水平存在过表达,且该突变能在转基因小鼠中稳定传代.结论 本研究成功建立了心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,人源PRKAG2 (Gl00S)基因在心脏组织的过度表达在小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步深入研究与探讨.     

结直肠癌原位移植造模技术研究进展

近年来,针对结直肠癌(CRC)的动物模型受到了研究者们的广泛关注。实验室小鼠成为肿瘤学研究中最具吸引力的实体之一。目前常规使用的CRC动物模型分为自发性模型、诱发性模型、移植性模型以及转基因模型。CRC原位移植造模相较于异位移植造模有其显著的优势,因此应用日趋普及。新的造模方式不断取代传统的造模方式,在肿瘤成瘤率、小鼠存活率以及肿瘤细胞转移率上都有明显的提高。现对开放手术造模、灌肠造模、经肛门低剂量电凝造模以及内镜微创造模四类方法及其优缺点进行阐述。     

多药耐药基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立

目的敲除大鼠多药耐药基因1(Abcb1),并在基因敲除大鼠的基础上建立Abcb1人源化大鼠模型,为Abcb1相关药物代谢和药物评价研究提供更接近人类的动物模型。方法利用大片段转基因技术和CRISPR/Cas9技术相结合,建立人源化大鼠模型,利用PCR,RT-PCR和Real-time PCR的方法进行鉴定及分析。结果将包含人源Abcb1启动子和c DNA的153 kb BAC片断转入到大鼠基因组,获得稳定表达h-Abcb1基因的大鼠,同时建立了Abcb1基因敲除大鼠。通过将两者杂交建立了Abcb1人源化大鼠模型。人源大鼠与大鼠内源Abcb1表达谱有明显的区别,人源化大鼠不仅表达h-Abcb1基因,在组织表达谱方面也与人类更接近。结论建立了Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型,Abcb1人源化模型可作为Abcb1基因相关药物代谢研究更接近人类的动物模型。     

食管鳞癌患者来源移植瘤模型：B-NDG®小鼠与BALB/c裸鼠的比较

目的 探讨不同品系的小鼠对于食管鳞癌患者来源的异种移植瘤（ESCC PDX）成瘤率的影响,为ESCC的临床个体化治疗建立更优势的临床前动物模型。方法 收集22例ESCC患者手术切除的肿瘤组织,分别利用B-NDG®（NSG）鼠和BALB/c裸鼠来建立ESCC PDX模型。通过观察移植瘤成瘤情况,测量移植瘤体积,绘制生长曲线图,计算成瘤率和成瘤时间,HE染色、免疫组化及基因组测序等实验,比较移植瘤组织与原患者肿瘤组织的一致性。结果 22例标本的PDX模型移植结束,发现NSG小鼠ESCC肿瘤发生率（50%,11/22）高于BALB/c裸鼠（18.18%,4/22）（P=0.027）。NSG小鼠的平均肿瘤成瘤时间为75.95 d短于BALB/c小鼠的91.67 d,差异具有统计学意义（P<0.001）。在NSG小鼠和BALB/c小鼠异种移植模型中,肿瘤均能保持病人ESCC肿瘤组织的形态学特征。基因分析结果显示,与BALB/c裸鼠相比,NSG小鼠肿瘤与亲代患者肿瘤样本间的基因相似度更高（P<0.0001）。结论 成功构建了NSG小鼠和BALB/c裸鼠ESCC皮下移植瘤模型,并发现NSG小鼠对于模型成功的建立更具有优势。     

异种移植胎肠细胞介导排斥反应的免疫学机制

目的:用大鼠游离胎肠移植于小鼠模型研究细胞介导排斥反应(CMXR)的免疫学机理.方法:观察同种和异种胎肠游离移植各组移植物的病理改变和浸润细胞的表型,并用原位杂交方法检测移植物内Th细胞因子mRNA表达.结果:(1)移植胎肠的存活率同种移植组高于异种移植组(P＜0.01);(2)异种移植胎肠主要发生细胞介导的排斥反应;(3)异种移植物内浸润细胞主要为CD4 T细胞和ED2 MФ,其IL-4、IL-5和IL-10mRNA阳性细胞均明显高于IFN-γmRNA阳性细胞(P＜0.01).结论:CMXR与同种移植急性排斥反应存在本质差异,其特点是排斥程度强烈,异种移植胎肠内以CD4 T细胞和ED2 MФ浸润为主,且Th2细胞功能增强.大鼠至小鼠游离胎肠移植模型是研究CMXR的较为理想的动物模型.     

小鼠骨髓干细胞移植对生殖细胞生成的影响

目的:探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓干细胞移植对不育模型小鼠生殖细胞的影响。方法:用白消安造小鼠无精子症模型,将绿色荧光转基因小鼠骨髓细胞处理后移植到无精子症模型小鼠睾丸网内,在小鼠分组干预后用Western-Blot方法检测各组小鼠睾丸VASA基因表达水平。结果:模型鼠睾丸病理切片显示睾丸曲细精管内生殖细胞显著减少(P<0.05),Western-Blot结果显示VASA基因蛋白水平较正常鼠显著降低(P<0.05)移植成功组小鼠VASA基因蛋白表达水平较模型对照组高(P<0.05),但仍低于正常鼠水平。结论:1含骨髓干细胞的骨髓混合细胞移植到无精子症模型小鼠睾丸网内,可明显促进生殖细胞生成。2VASA基因表达水平可作为睾丸性不育动物模型评价指标。     

促进重点实验室向高技术水平深层次发展的体会

本实验室进行了十几年的实验动物转基因技术应用的基础性研究。先后制备了裸鼠小鼠人喉癌移植瘤模型、裸杂鼠乳腺移植瘤模型。对人鼠移植与鼠间移植的异同，移植瘤的生物学特性，微波对移植瘤的影响等进行了研究。2003年经显微注射方法获得抗菌肽、人胰岛素和双基因转移FVB小鼠转基因模型建立取得成功，并经PCR和Southern检测，高阳性表达。