限制性显示技术作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法的初步研究

目的初步研究限制性显示技术（RD-PCR）作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法对芯片杂交信号的影响。方法收集3个健康人外周血单核细胞，提取RNA后分为两组，采用RD-PCR进行样本双色（Cy3／Cy5）荧光标记，与3张Agilent 60 mer高密度（22K）人1B寡核苷酸芯片进行杂交。排除阴性和阳性对照信号值、Cy3和（或）Cy5的前景与背景间无统计显著性差异点的信号值，进一步排除两种荧光标记间存在统计显著性差异点的信号值，将3张芯片的共同信号值用于分析。SPSS软件进行常规统计分析和作图，R语言环境下的VSN统计包排除芯片间和两种不同荧光标记间的系统误差。结果3张芯片的8744个共同点用于本研究。芯片间及两种荧光标记间存在明显的可校正的系统误差。芯片间杂交信号值相关显著。RD-PCR样本标记方法对较低表达基因信号值较为敏感。结论初步的统计分析结果表明，RD-PCR是一种潜在的有用的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响

目的 观察标记引物法、随机渗入标记法、末端转移标记法三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响。方法 将淋球菌gyrA基因91位密码子突变型探针倍比稀释成终浓度为1000／μmol／L～0．25μmol／L的梯度浓度点样并制作寡核苷酸芯片，PCR扩增荧光标记包含gyrA基因突变的目的DNA片段，与芯片杂交，分别记录三种标记方法的杂交信号强度。结果 标记引物法的荧光信号最强，随机渗入标记法的荧光信号强度次之，其Cy5—duTP最佳浓度为0．1mmol／L(dTTP：Cy5—dUTP=10：1)，末端转移标记法反应时间在60min和120min时荧光信号值相近。点样的探针浓度达到31μmol／L，以上，荧光信号为平台期。结论 明确了三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响，有助于选择寡核苷酸芯片的荧光标记方法。     

卡托普利对糖尿病性心肌病大鼠心肌组织能量代谢和炎症反应的影响

目的 探讨卡托普利保护心肌组织的作用机制。方法 (1)将糖尿病性心肌病大鼠分为对照组和治疗组,治疗组每天给予卡托普利1.5 mg/kg·b.w.,口服15 w;(2)从动物心肌组织中抽提mRNA,经逆转录分别用Cy3、Cy5荧光标记,获得两组动物来源的cDNA探针;(3)cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 (1)脂肪酸b氧化相关基因、线粒体电子质子偶联和氧化磷酸化相关基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖的白三烯B4羟基脱氢酶基因在治疗组中表达明显上调。(2)二甲基精氨酸水解酶基因在干预治疗组中表达明显下调。结论 卡托普利可能通过改善病变心肌的能量供应、抑制炎症反应对糖尿病性心肌病心肌组织起保护作用。     

一种用于芯片质控的通用序列标签寡核苷酸探针的设计

目的设计一种带有通用序列标签的寡核苷酸探针以应用于寡核苷酸芯片点样的质量控制。方法以HIV寡核苷酸探针作为核心序列,在其一端或两端连接上多种通用序列标签（usz）构建新型探针。然后打印芯片,以Cy5标记的通用引物（Cy5-UP,与UST互补）进行杂交,筛选出5条荧光信号强的探针,重新打印芯片。再分别以不同浓度梯度的、Cy5标记的通用引物（Cy5-UP）和随机引物（Cy5-RP）与芯片杂交,比较两者杂交效率。结果Cy5-UP的杂交结果显著优于Cy5-RP的杂交结果,特别是在较低浓度时。结论利用Cy5标记的通用引物检测探针上的通用序列标签,可以为芯片点样的质量控制提供一种更有效的方法。     

核糖体蛋白基因芯片的制作和临床试用

【目的】制作核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)基因芯片,探讨该芯片应用方法。【方法】设计、合成58mer寡核苷酸探针,打印芯片。收集溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者和正常自愿者结肠黏膜,提取总RNA。逆转录法Cy5-dCTP标记试验样品,试验样品包括正常组4例、混合正常组1例、UC 8例、UC混合1例,Cy3-dCTP标记共同参照,1例正常样品和共同参照进行Cy5-dCTP、Cy3-dCTP荧光交换。试验样品和共同参照配对杂交、扫描,应用BRB-TOOL(3.90)进行数据分析。【结果】制作了包括77条RP基因,2条RP类似基因(RPL26-like1、RPL7-like1)低密度芯片。UC混合样品杂交的信号值与UC 1～8分别杂交信号值之均数最为接近,健康人混合样品杂交的信号值和H 1～4分别杂交信号值之均数没有相近之处,但更接近于单样品杂交的结果;混合样品所得到的差异基因数明显少于样品分别杂交所得到的差异基因数。2例荧光交换Ratio值高度相关。【结论】成功制作了RP基因芯片。样品混合会影响杂交数据的统计,同时,均一化能轻微减弱荧光染料引起数据的偏差。     

人鼻咽癌不同部位组织相关基因表达谱的研究

目的 筛选鼻咽癌癌变发生过程中的重要基因。方法 应用显微切割和荧光标记探针基因芯片杂交技术,检测鼻咽癌、癌周组织、癌旁组织及鼻咽炎症组织的基因差异表达,扫描仪扫描荧光芯片,图象处理软件分析结果。结果 在检测的3组标本中,存在大量差异表达基因,涉及基因包括信号与蛋白传递、癌基因与原癌基因、免疫相关基因、凋亡基因,以及DNA结合转录和转录因子等范围。结论 鼻咽癌癌变过程中有多个多种类基因参与,说明鼻咽癌癌变过程是一个复杂、多通路的过程。     

直接标记的抗体芯片筛选血清疾病候选标志物的研究

目的应用血清样品直接标记和抗体芯片方法进行抗原和疾病标志物的筛选。方法分别取正常、糖尿病和甲亢患者的血清,采用FMB的ASB600抗体芯片的样品及相关的标记试剂盒,对3μl血清样本进行直接生物素标记。抗体芯片孵育后,用链霉亲合素标记的Cy3荧光显色芯片,经扫描仪检测杂交信号,分析比较芯片内、芯片之间的信号结果重复性,初步筛选疾病样本中与正常样本有差别的蛋白标志物。结果芯片内的两点重复性相关系数R2达到0.95～0.99,芯片重复实验间的相关系数R2达到0.98。对不同样本间的芯片信号进行比较,可以发现与疾病相关的新蛋白分子。结论本研究中使用的ASB600抗体芯片和直接标记荧光检测的实验方法可用于疾病相关的血清分子标志物的识别与寻找。     

一种用于生物芯片标记效率的研究方法

目的利用自杂交的方法对芯片杂交样品的标记效率进行检测和实验质控。方法提取人红白血病K562细胞RNA后,将核酸样品等分成两等份,分别应用通用引物标记Cy3和Cy5荧光物质,然后和制备的K562芯片进行杂交,通过比较杂交后探针上Cy3和Cy5的荧光信号强度,对样品的标记效率和杂交流程进行实验分析和质控。结果杂交后的芯片探针显示为等量的Cy3和Cy5重叠后的黄色荧光,由于样品是等量的同一种核酸物质,从而证明了样品标记的效率一致性较好。结论通过自身杂交方法来比较相同样品两种荧光标记物的信号强度,对芯片本身的质量进行检测,分析标记物的标记效率,可以应用于生物芯片实验的质量控制。     

近交系小鼠双色荧光正相杂交芯片技术体系的建立和优化

目的探讨采用单核苷酸多态性（SNP）检测方法-双色荧光正相杂交芯片技术对近交系小鼠遗传质量监测及相关影响因素。方法运用基于芯片的双色荧光正相杂交检测SNP技术,进行芯片杂交动力学研究,考察信号值（Cy3,Cy5）和ratio值（Cy5/Cy3）与PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度之间的关系,研究PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度对SNP分型的影响。结果采用正反标记实验后,Ratio值随着PCR产物点样浓度的增加呈稳定趋势;PCR双链产物长度对信号值影响比较大,点样时其长度不宜太长,最好不超过450 bp;随荧光标记探针长度的增加,基因分型能力明显下降,长度为15 bp最佳,长度超过20 bp时,已基本没有区分能力。结论PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度是双色荧光正相杂交SNP分型系统的重要影响因素,采取适当的PCR产物点样浓度、PCR产物长度和荧光标记探针长度,并采用正反标记实验,可以取得稳定、准确的基因分型效果。为进一步进行近交系小鼠遗传质量监测的研究奠定基础。     

用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的 研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(T_m)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果 与结论 获得22条60mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。     

一种新的基因芯片检测荧光标记技术:通用引物U2联合标记法

目的报告一种新的基因芯片荧光标记技术:通用引物U2联合标记技术(universal primer U2 labeling ,UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法流感病毒RNA用四种标记方法处理后与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交,用Spss10.0对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法可用于基因芯片研究和应用。     

一种新的基因芯片检测荧光标记技术：通用引物U2联合标记法

目的报告一种新的基因芯片荧光标记技术:通用引物U2联合标记技术(universal primer U2 labeling,UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性.方法流感病毒RNA用四种标记方法处理后与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交,用Spss10.0对杂交结果进行分析.结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单.结论UPL方法可用于基因芯片研究和应用.     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的 应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法 提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA，并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体，挑选阳性克隆，用PCR扩增．以纯化的PCR产物做探针，制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头，用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3，与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果 芯片杂交结果经扫描分析，发现42个K562细胞肿瘤特异性基因，进一步用序列分析证实．其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论 我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因．为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。     

HIV基因芯片的初步研究

目的：建立HIV基因检测芯片的分析技术，方法：分离HIV 1U26942基因限制性显示片段作探针，应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片，然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交，以分析限制性显示基因片段的杂交动力学，经杂交后清洗和干燥，扫描芯片进行检测。结果：对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论：建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

HIV基因芯片的初步研究

目的建立HIV基因检测芯片的分析技术。方法分离HIV1U26942基因限制性显示片段作探针,应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片。然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交,以分析限制性显示基因片段的杂交动力学。经杂交后清洗和干燥,扫描芯片进行检测。结果对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

一种用于基因表达谱分析的基因芯片方法

目的：通过研究SLE患者外周血基因表达谱的改变，建立一种新型的基因芯片技术用于分子发病机理的研究。方法：提取总RNA，逆转录合成单链cDNA、双链cDNA，体外转录合成生物标记的cRNA与基因芯片进行杂交，通过抗体的检测标记荧光染料Cy3，基因芯片扫描仪进行图像扫描。结果：该方法有较高的重复性和稳定性，SLE患者与正常对照组相比较，鉴定出94个基因存在表达差异。结论：该方法能在较少起始标本量的情况下，有效地进行SLE致病基因的筛选，更好的理解SLE发生的分子机理，并且可在其它疾病研究中推广应用。     

基因芯片技术在胰腺癌相关基因研究中的应用

目的　应用基因芯片技术比较胰腺癌组织与正常胰腺组织基因表达谱的差异 ,以寻找新的诊断指标和治疗位点。方法　将 12 80 0 0个人类全长基因的PCR产物点样在特殊处理后的玻片上制备基因芯片。采用逆转录的方法分别将Cy5 dUTP标记胰腺癌组织mRNA、Cy3 dUTP标记正常胰腺组织mRNA以制备探针。将每一标本的混合探针与芯片杂交 ,用ScanArray 30 0 0荧光扫描仪扫描荧光信号。应用ImaGene3.0软件分析、计算每点的Cy5和Cy3信号值。以Cy5 /Cy3比值的自然对数绝对值 >0 .6 9为标准 ,筛选差异表达基因。结果　在所检测的 6例胰腺癌标本中 ,共有 5 4个基因有差异表达 ,其中胰腺癌组织中表达上调基因 32个 (包括基因库中已登录基因 2 4个 ) ,表达下调基因 2 2个 (包括基因库中已登录基因 15个 )。结论　基因芯片技术为阐明胰腺癌特异基因表达谱提供了强有力的工具。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。