乙型肝炎病毒C基因截短对S基因转录与表达的影响

目的 研究HBV C基因截短对S基因转录与表达的影响。方法采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体，瞬时转染HepG2细胞。应用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测S基因的转录；应用Western blot、ELISA检测S蛋白的表达。结果经酶切鉴定，C基因截短型HBV载体构建成功；C基因截短对HBVS基因转录没有影响，但C基因截短141nt后可显著提高HBV S蛋白表达。结论HBV C基因截短可影响HBV S基因的生物学功能，机制发生在转录后或翻译水平。     

复制缺损型HBV表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究

目的　探索HBV作为基因治疗载体的可能性及检验HBV点突变表达显性阴性突变体抗HBV的作用。方法　在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达核心 P蛋白及核心 表面抗原的融合蛋白 ,整合于具有HBV复制的 2 2 15细胞 ,形成细胞克隆 ,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果　 2 2 15 pMEP4组、2 2 15 CP组、2 2 15 CS组 ,对HBsAg平均抑制率分别为 2 74 %±3 83%、4 0 0 8%± 2 0 5 % (P <0 0 1)和 5 2 94 %± 1 93% (P <0 0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为4 4 6 %± 4 2 5 %、5 2 86 %± 1 32 % (P <0 0 1)和 4 1 6 0 %± 1 6 5 % (P <0 0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 15 3%、82 0 %和 6 7 2 %。仅在 2 2 15 CP组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论　在细胞内表达显性阴性突变体具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;经修饰后的HBV基因组在野生型HBV辅助下 ,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒。     

携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制

我们以体外能够表达野生ＨＢＶ的质粒ｐＨＢＶ30 91为研究对象 ,用ＧＦＰ基因替代ＨＢＶ的Ｓ读码框构建携带外源基因的重组ＨＢＶ载体ｐＨＢＶ Ｓ ＧＦＰ。为了保证重组载体中外源基因能够有效表达及整个ＨＢＶ基因读码框的顺利通读 ,在改造ＨＢＶ时保留了Ｓ基因的前 9个核苷酸使ＧＦＰ与之融合 ,从而保证Ｓ基因起始密码子附近的ＤＮＡ结构尽可能与野生ＨＢＶ一致 ,保持ＨＢＶ自身基因表达调控元件的特性。结果表明 :(1)将构建的重组ＨＢＶ基金项目 :国家自然科学基金资助项目( 30 170 85 4) ;全军医药卫生科研基金资助项目( 0 1ＭＡ0 10 )…     

潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建

目的 配合HBV载体的研究，为HBV载体提供包装。方法 HBV全基因经删除包装信号e区后，插入到潮霉素抗性pMEP4载体，转染HepG2细胞系，用潮霉素筛选形成细胞克隆。检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系，进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒，PCR方法观察上清液中病毒的形成。结果 包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg：携带重组HBV的G418抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后，经两种抗生素同时筛选，在细胞培养上清液中能检出突变型HBV，未检出野生型HBV。结论 删除了包装信号的HBV次全基因，失去了形成完整HBV颗粒的能力，但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白。     

HBV前C／C基因变异与宿主T细胞免疫的关系

T细胞免疫反应对乙型肝炎患者病毒的清除有重要作用,乙肝病毒（HBV）前C／C基因变异不仅改变了病毒本身的生物学性状,也改变了宿主的特异性T细胞免疫应答。本文就近年来HBV前C／C基因变异与患者体内T细胞免疫的关系作一综述。     

乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究

近年来的研究提出ＨＢＶ感染者体内存在有准种的假说 ,我们以前Ｃ/Ｃ基因为研究靶区域 ,应用多聚酶链反应(ＰＣＲ)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶序列 ,随机选择克隆测序 ,比较其结果 ,证明了ＨＢＶ准种的存在 ,并发现多种基因突变形式。试验用 4例患者诊断为病毒性肝炎 ,乙型、慢性 ,临床检测ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｃ阳性。提取 2 0 0 μｌ血清中的ＨＢＶＤＮＡ ,用于多聚酶链反应 (ＰＣＲ)。以甘人宝等发表的ＨＢＶａｄｒ亚型序列为依据 ,设计引物序列。其上游引物为 :5′ＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴ…     

肝病患者血清cccDNA与HBV复制及肝组织损伤的关系

细胞外乙型肝炎病毒（HBV）DNA是一种松弛环状的部分双链DNA分子，而在感染的肝细胞核内则是另一种不同形式的病毒DNA，即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。近来研究发现血清中存在cccDNA；另有研究证实外周血淋巴细胞同样存在HBVDNA与cccDNA。因此血清cccDNA的来源可能不只是肝组织，其临床意义尚不十分清楚。我们检测了228例肝病患者血清cccDNA。现将有关资料报告于下。     

119 HBV前C/C基因变异与宿主T细胞免疫的关系

T细胞免疫反应对乙型肝炎患者病毒的清除有重要作用,乙肝病毒(HBV)前C/C基因变异不仅改变了病毒本身的生物学性状,也改变了宿主的特异性T细胞免疫应答.本文就近年来HBV前C/C基因变异与患者体内T细胞免疫的关系作一综述.     

HBV基因型与前C/C启动子变异及抗病毒疗效的关系

目的 了解深圳市乙型肝炎病毒（HBV）基因分型情况，探讨HBV基因型与前C／C启动子变异、乙肝的病程进展及抗病毒疗效的关系。方法 用单克隆抗体ELISA法（mAbs ELISA）对深圳市165例HBV感染者进行HBV基因分型；随机抽取24例慢性乙型肝炎（CUB）患者，用基因芯片技术检测HBV前C／C启动子变异；回顾性分析HBV基因型与干扰素、贺普丁抗HBV疗效的关系。结果 ①165例患者中，以B型106例（64.2％）和C型48例（29．1％）为主。慢性无症状乙肝病毒携带者（ASC）组B型占95．4％，肝硬化（LC）组C型占64．7％（P〈0．05）。②24例CHB患者中，16例（10例B型，6例C型）发生HBV前C／C启动子变异：前C区变异（nt1896、1862）者10例（B型9例，C型1例）。基本C区启动子变异（BCP）变异（nt1762、1764）者6例（B型1例，C型5例）。③用干扰素治疗的27例HBeAg（＋）CHB患者，达到完全应答者B型11例（62．5％）较C型1例（9．1％）多见（P〈0．05）。用贺普丁治疗的29例HBeAg（＋）CHB患者，持续应答者B型15例（78．9％）较C型3例（30．0％）多见（P〈0．05）。结论 ①深圳市HBV基因分型以B型为主，C型次之。②C型较B型易发生BCP变异，发生肝硬化机会较高，且对于扰素及贺普丁疗效较差。     

慢性HBV C基因启动子变异的检测

目的 了解慢性乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ基因启动子变异的情况以及对病毒血清学的影响。方法 应用错配聚合酶链反应特异性扩增含有ＨＢＶ Ｃ基因启动子的片段,扩增产物用限制性内切酶Ｂｃｌ Ｉ酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱,分析Ｃ基因启动子区段的核苷酸（ｎｔ）１７６２由碱基Ａ→Ｔ和（ｎｔ）１７６４碱基由Ｇ→Ａ的变异,并经直接测序分析证实ＲＦＬＰ结果。结果 １１０例慢     

磷酸脂酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

 目的 初步鉴定可能与 HBV 核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶。 方法 以磷酸酯酶 2A 抑制剂冈田酸（OA）处理体外培养的人肝癌 HepG2.2.15 细胞。将细胞分为 4 组，分别加入终浓度为 0（对照组）、10、20、30 ng/ml 的 OA（OA 10 ng 组、OA 20 ng 组、OA 30 ng 组），每组各设 5 孔。在培养 0、2、4、6 d 时分别收集各组细胞培养上清液，采用电化学发光方法检测 HBsAg 浓度，荧光实时定量 PCR 方法检测 HBV DNA 拷贝数。取培养 2 d 时的各组细胞，采用蛋白质印迹方法检测 HBcAg 异质性，免疫荧光细胞化学染色方法检测 HBcAg 亚细胞定位。 结果 OA 10ng 组、OA 20 ng 组各时间点细胞培养上清液HBsAg 浓度、HBV DNA 拷贝数分别与对照组相应各时间点比较，差异均无统计学意义；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常。OA 30 ng 组在培养 2、4、6 d 时细胞培养上清液 HBsAg 浓度（ng/ml）均明显低于对照组相应各时间点（分别为 385.9 ± 43.1 vs. 510.2 ± 63.3、346.5 ± 39.6 vs. 484.6 ± 59.4、295.1 ± 32.8 vs. 467.2 ± 52.9，P 值分别为 0.028、0.022、0.016）；在培养 2 d 时细胞培养上清液 HBV DNA 拷贝数（ml-1）明显高于对照组相应时间点（6.71 ± 6.07 vs. 6.34 ± 5.72，P = 0.022），而在培养 4、6 d 时均明显低于对照组相应各时间点（分别为 5.80 ± 5.19 vs. 6.29 ± 5.68、4.75 ± 4.15 vs. 6.25 ± 5.58，P 值分别为 0.008 和 0.005）；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带明显增宽，约 20% 的 HepG2.2.15 细胞的细胞核内 HBcAg 红色荧光信号明显增强。 结论 短时间、高浓度的 OA 处理可提高 HBV DNA 的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平，提示磷酸酯酶 2A 可能参与了 HBV 核心蛋白的去磷酸化过程。     

PCR-RFLP结合克隆测序监测乙肝病毒拉米夫定耐药突变株的产生

目的 建立PCR结合酶切的方法监测慢性乙型肝炎患者体内拉米夫定耐药突变株的产生,并与PCR产物克隆后测序相结合。了解此方法的可靠性和可行性,同时用此方法筛查50例应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中耐药株的发生情况。方法 拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者50例,治疗时间9个月-24个月,设计错配PCR结合限制性片段长度多态性方法,快速检测患者体内乙型肝炎病毒（HBV）酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid,YMDD)变异株的发生情况,对筛检耐药株阳性的标本应用PCR产物克隆后测序加以证实。结果 在50例服用拉米夫定患者中发现9斧正患者在用药超过9个月时出现拉米夫定耐药突变株（YMDD变异株）,其中YIDD变异5例,YVDD变异4例,后者有3例合并有1526M突变。结论 本方法在检测YMDD变异方面具人快速简便的特点,经克隆后测序证实,具有较好的可靠性。     

HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA相关性的研究

目的探讨HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA之间的关系。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测30例经肝组织活检病理检查确定为HBV携带者的肝组织中HBVcccDNA、HBVtDNA和血清HBV DNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBVcccDNA与肝组织内HBVtDNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系。结果HBV携带者肝组织中均可检出HBVcccDNA,范围在3．15×10^3拷贝／mg～1．06×10^7拷贝／mg（对数值：5．66±O．93）;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBVDNA定量呈正相关（r=0．375,P〈0．05）,与血清HBVDNA无相关性（r=0．174,P〉0．05）。肝组织中HBVcccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关（r=0．562,P〈0．001）;而与血清HBeAg定量无相关性（r=0．152,P〉0．05）。结论HBV携带者肝组织内HBVcccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBVDNA载量不能直接代表其肝组织中的HBVcccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝幺日织中HBVcccDNA水平的指标。     

在慢性乙型肝炎治疗过程中HBsAg水平与HBV DNA病毒复制的相关性分析

目的： 病毒载量的测定常被用来诊断和监测慢性乙型肝炎的疗效。文献报道采用全自动微粒子化学发光免疫反应测定HBsAg水平可作为替代标记。本研究旨在进一步分析慢性乙型肝炎治疗过程中血清HBsAg水平和HBV DNA水平的相关性。方法：本研究选取47例慢性乙型肝炎的患者［男性35人,女性12人,平均年龄(35±8)岁］。聚乙二醇化干扰素α-2a单一治疗患者（18例）、聚乙二醇化干扰素α-2a +拉米夫定联合治疗患者（14例）、拉米夫定单一治疗患者（15例）治疗48周并留取0、4、8、24、48、72周的血清。用TaqMan PCR测定HBV DNA水平,全自动微粒子化学发光免疫反应测定HBsAg水平。结果：18例聚乙二醇化干扰素α-2a单一治疗的患者和14例聚乙二醇化干扰素α-2a +拉米夫定联合治疗的患者可观察到HBsAg滴度随HBV DNA复制水平的一致变化,呈显著相关（r=0.83,P<0.01）。而在15例拉米夫定单一治疗的患者则未观察到HBsAg滴度随HBV DNA复制水平一致的变化趋势,但无相关性。聚乙二醇化干扰素α-2a单一治疗、聚乙二醇化干扰素α-2a+拉米夫定联合治疗的患者HBsAg水平中位数下降幅度均明显优于拉米夫定单一治疗的患者（P<0.05）。结论：在以干扰素为基础的慢性乙型肝炎治疗期间,血清HBsAg水平与HBV DNA 水平显著相关,动态HBsAg定量监测对治疗有一定的指导意义,可作为监测HBV疗效的替代标记。     

检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的临床意义

目的检测乙肝患者血清中乙肝两对半（HBVM）、乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）以及HBVDNA，比较在不同乙肝两对半模式的患者中HBV．LP与HBVDNA的检出率，探讨乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）用于乙肝患者临床诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测HBV．LP和乙肝两对半，采用荧光定量PCR方法对患者HBVDNA进行检测。结果（1）相同乙肝模式患者血清中HBV．LP与HBVDNA检出率差异无统计学意义；（2）143例小三阳乙肝患者血清中HBV．LP与HBVDNA阳性率差异无统计学意义，二者的检出一致率为82．52％[（65＋53）／143]；（3）HBV—LP吸光度（A值）与HBVDNA呈正相关关系（r=0．983）。结论乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白与HBVDNA有良好的正相关关系，在HBeAg阴性的乙肝患者中乙肝病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）与HBVDNA有较高检出一致率，HBV—LP用于临床反映乙肝病毒复制水平，特别是HBeAg阴性乙肝患者体内病毒复制情况有重要的意义。     

C基因型乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子突变与疾病进展的相关性研究

目的探讨HBV前C区（PreC）及基本核心启动子（BCP）突变与慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者疾病进展的关系。方法收集88例慢性HBV感染者血清标本，包括36例无症状携带者（其中24例为HBV携带者，12例为HBsAg携带者）、36例慢性乙型肝炎（慢性乙肝）和16例肝硬化患者。所有标本均经型特异性引物PCR法鉴定为HBVC基因型，并用巢氏PCR法扩增HBVPreC和BCP基因片段，用PCR产物直接测序法测序，然后用ClustalW1．8软件进行序列分析。结果在50例HBeAg阳性患者中，无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762／A1764双突变率和T1846突变率分别为12．5％、42．1％、100％和0％、5．3％、28．6％，差异均有统计学意义（P值分别为0．03和0．02）。在38例HBeAg阴性HBV感染者中，无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762／A1764双突变率分别为16．7％、58．8％和66．7％，差异无统计学意义（P=0．08）。肝硬化组的C／G1753突变率显著高于无症状携带者及慢性乙肝组（分别为55．6％、8．3％、11．8％，P=0．01），其A1896突变率也高于无症状携带者组（分别为55．6％、8．3％，P=0．01）。结论HBVT1762／A1764双突变与C基因型HBV慢性感染者的疾病进展有关。     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。     

乙型肝炎病毒增强子I／X基因启动子变异与HBV慢性感染疾病谱的关系

目的探讨乙型肝炎病毒增强子I（HBVEnhI）／X基因启动子变异与乙型肝炎病毒慢性化感染疾病谱的关系。方法随机收集275例HBV感染者的血清标本,包括慢性乙型肝炎（CHB）100例,肝硬化（LC）74例,肝细胞癌（HCC）101例。以入选病例的基因型为分组,采用半巢式PCR的方法扩增HBVEnhI／X基因启动子并测序,测序结果与HBV参照序列比对,确定变异位点,使用x^2检验和多变量logistic回归进行数据分析。结果①HBV基因分型结果：HBVB基因型患者158例（61．48％）,包括CHB70例,LC36例,HCC52例;HBVC基因型患者117例（38．52％）,包括CHB30例,LC38例,HCC49例。②HBVB基因型A1123Y变异在LC组明显高于CHB组（30．56％vs．8．58％,x^2=8．533,P=0．005,A=4．693,95％CI[1．567～14．056]）,HCC组明显高于CHB组（28．85％vs．8．58％,x^2=8．607,P=0．003,OR=4．324,95％CI[1．544～12．109]）;A1317G变异在HCC组明显高于CHB组（30．77％VS．7．14％,x^2=11．687,P=0．001,A=5．778,95％CI[1．955—17．076]）。HBVC基因型T1323C变异在HCC组明显高于CHB组（30．61％vs．6．67％,x^2=6．318,P=0．012,A=6．176,95％CI[1．301-29．331]）。③多变量logistic回归分析发现A1317G（A=5．706,95％CI[1．770～18．837],P=0．004）和T1323C（A=5．810,95％CI[1．114～30．306],P=0．037）变异是HCC发生的独立危险因素。结论乙型肝炎病毒增强子I／X基因启动子突变与肝硬化、肝癌的发生有关,对变异位点的检测有助于预测肝硬化和肝癌的发生。     

HBV核心启动子A1762T/G1764A双突变与慢加急性肝衰竭关系的研究

目的 分析HBV BCP A1762T/G1764A双突变与慢加急性肝衰竭（Acute on chronic liver failure,ACLF）之间的相关性.方法 对166名HBV慢性感染后处于疾病不同阶段的患者进行HBV前BCP A1762T/G1764A双突变检测,比较不同患者之间突变率的差异.结果 慢性肝炎（CHB）45人,肝硬化（LC）45人,ACLF 49人,肝细胞癌（HCC）27人,各组A1762T/G1764A双突变率分别为40.0%（18/45）、84.4%（38/45）、73.5%（36/49）、92.6%（25/27）.但是,以CHB为基础的ACLF患者和以LC为基础的ACLF患者A1762T/G1764A双突变率差异无统计学意义[（81.3%）vs.（69.7%）,P=0.502].HBeAg阳性者和HBeAg阴性者BCP双突变率差异无统计学意义（P=0.735）.A1762T/G1764A双突变者HBV DNA水平（10g）为5.68±1.36,阴性者HBV DNA水平（log）为6.14±1.81,差异无统计学意义（P=0.075）.结论 A1762T/G1764A双突变与HBV感染后疾病进展相关,不具备ACLF特异性;A1762T/G1764A联合突变者HBV DNA水平及HBeAg状态也与非联合突变者差异无统计学意义.     

慢性乙型肝炎患者肝脏病理特点与血清HBeAg和HBV DNA的关系

目的 了解慢性乙型肝炎患者病理特点与血清HBeAg和HBVDNA的关系.方法对1057例慢性乙型肝炎患者进行肝脏病理检查,采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA,用化学发光法检测血清HBeAg.结果 HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者的炎症及纤维化程度(G4和S4分别为7.83%和12.17%)较HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者高(G4和S4分别为3.39%和5.44%);HBeAg阳性的患者中HBV DNA滴度低的患者炎症及纤维化程度较高(HBV DNA 104～105 G3G4和S3S4分别为45.64%和30.20%),而HBeAg阴性的患者则是HBV DNA滴度高的炎症及纤维化程度较高(HBV DNA106～107 G3G4为54.55%和HBV DNA 108～109S3S4为42.85%).结论慢性乙型肝炎患者的肝脏病理与血清HBeAg及HBV DNA水平有不同相关性,对HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者要及早进行肝脏病理检查和抗病毒治疗.