基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的 探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法 (1)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。(2)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果 (1...     

活血消瘿方调控Fas系统对结节性甲状腺肿大鼠模型甲状腺细胞凋亡的影响

目的：探究活血消瘿方调控Fas系统对结节性甲状腺肿大鼠模型甲状腺细胞凋亡的影响。方法：将60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、活血消瘿方低剂量组、活血消瘿方中剂量组、活血消瘿方高剂量组,每组10只。空白对照组大鼠灌胃生理盐水,其余各组大鼠灌胃0.1%PTU溶液复制结节性甲状腺肿模型。给予相应药物干预4周后,ELISA法检测血清中促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲腺原氨酶(FT3)、游离甲状腺素(FT4)水平;测定甲状腺组织质量,HE染色分析甲状腺组织的病理学变化;TUNEL分析甲状腺细胞的凋亡指数;免疫组织化学、Western blotting和RT-PCR检测FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表达水平。结果：模型组大鼠血清中TSH含量明显高于空白对照组(P<0.05),FT₃和FT₄含量、甲状腺组织质量、凋亡指数及FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表达水平均低于空白对照组(P<0.05);阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠血清中TSH...     

扶正消症方（含药血清）诱导SGC-7901细胞凋亡的实验研究

探讨中药复方扶正消症方(含药血清)在体外对胃癌SGC-790l细胞凋亡影响。方法：通过血清药理学方法，选择不同浓度的含药血清与胃癌细胞共同培育12、24、36、48h后，应用荧光显位镜观察细胞形态，流式细胞仪检测凋亡峰(亚二倍体峰)。结果：扶正消症方含药血清可诱导胃癌细胞SGC-790l凋亡，这种作用呈时间，剂量依赖性，随含药血清浓度的增加细胞凋亡率增高。结论：中药复方扶正消症方通过血清药理学方法可诱导胃癌细胞SGC-790l发生凋亡，这将为胃癌治疗提供有用的实验室依据。     

清血消脂方含药血清调控自噬干预油酸诱导的脂肪细胞代谢性炎症反应

目的研究清血消脂方通过调控自噬干预油酸诱导的脂肪细胞代谢性炎症反应。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用油酸刺激脂肪细胞构建代谢性炎症模型。采用清血消脂方水煎剂灌胃大鼠制备含药血清,将不同浓度含药血清作用于脂肪细胞代谢性炎症模型24 h。采用CCK-8法检测脂肪细胞活性;CBA法检测细胞分泌炎症因子;免疫细胞荧光法检测细胞自噬相关蛋白LC3表达;Real-time PCR法检测细胞内自噬基因和炎症通路基因表达。结果与同浓度的空白血清比较,清血消脂方含药血清对脂肪细胞活性无影响;清血消脂方含药血清能显著降低细胞培养上清中IL-6、G-CSF、MCP-1及GM-CSF含量(P0.05,P0.01),10%清血消脂方含药血清能显著降低细胞IL-6、NF-κB mRNA的表达(P0.05);10%的清血消脂方含药血清可显著促进自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA的表达(P0.05)。结论清血消脂方可抑制油酸诱导的脂肪细胞代谢性炎症反应,其抑制作用是通过激活细胞自噬活性和抑制NF-κB基因表达实现的。     

乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬

目的 研究乌药挥发油对人胃癌细胞AGS凋亡和自噬的的影响,并探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。方法 利用水蒸气蒸馏法提取乌药挥发油,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测乌药挥发油对人胃癌细胞AGS细胞活力的影响,并根据半抑制浓度（IC₅₀）确定最佳给药浓度与时间,用于后续研究;设置空白组、乌药挥发油低、中、高质量浓度组（0、15、30、60 mg·L^-1）及阳性药环磷酰胺（CTX）组（350 mg·L^-1）。用不同浓度的乌药挥发油处理AGS细胞48 h,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖能力的变化、流式细胞仪检测细胞周期的变化、细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化、苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态的变化、Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染法检测AGS细胞凋亡率、吖啶橙（AO）染色观察自噬水平的变化、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测自噬效应蛋白Beclin-1、p62、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、B细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、剪切的多聚ADP-核糖聚合酶（cleaved PARP）、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、雷帕霉素机械靶蛋白（mTOR）及磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白表达水平的变化。结果 与空白组比较,AGS细胞经乌药挥发油干预24、48 h,细胞活性被明显抑制（P<0.05,P<0.01）,呈浓度和时间依赖性;乌药挥发油各浓度组细胞增殖与迁移能力明显降低（P<0.05,P<0.01）,且随浓度的上升抑制能力越明显;乌药挥发油将AGS细胞周期阻滞于G₂/M期（P<0.05,P<0.01）,呈浓度依赖性;乌药挥发油各浓度组出现细胞圆化,体积变小并伴随凋亡小体形成等现象,细胞凋亡率明显增加（P<0.05,P<0.01）;随着乌药挥发油浓度的增加,自噬体数量增加致红色荧光逐渐增强,提示自噬水平的提升;乌药挥发油各浓度组Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bax/Bcl-2及AMPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01）;p62与p-mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。结论 乌药挥发油通过调节AMPK/mTOR信号通路诱导AGS细胞凋亡和自噬介导的生长抑制。     

活血解毒方对HSG细胞凋亡及自噬表达的影响

目的 观察活血解毒方对HSG细胞凋亡及自噬表达的影响。方法 活血解毒方中药冻干粉干预IFN-γ+TRAIL联合诱导的HSG细胞凋亡,以白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)作为阳性对照组,实时荧光定量(quantitative real-time fluorescence, PCR)及蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞凋亡内源性途径中及自噬相关蛋白与m RNA的表达、激光共聚焦检测自噬情况。结果 与空白组比较,模型组Bax、LC3B蛋白相对表达量明显升高(P <0.01),而Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P <0.01);与模型组比较,两治疗组Bax、LC3B蛋白相对表达量明显降低(P <0.01),Bcl-2蛋白相对表达量明显升高(P <0.01);与TGP组比较,中药组LC3B蛋白相对表达量降低(P <0.05);与空白组比较,模型组Bax mRNA相对表达量明显升高(P <0.01),Bcl-2m RNA相对表达量明显降低(P <0.01);与模型组比较,两治疗组Bax mRNA...     

透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞线粒体凋亡通路的作用机制。方法:SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,Ⅱ型胶原原位杂交鉴定。第3代软骨细胞培养72h,SNP诱导软骨细胞凋亡,采用含药血清干预凋亡软骨细胞,Hocehst 33342染色检测软骨细胞的凋亡率,Real time RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达。结果:干预24h,软骨细胞的OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05);软骨细胞Bcl-2mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05);软骨细胞Bax、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。结论:透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因Bax、Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导。     

回药爱康方含药血清对肺癌A549细胞凋亡的影响

目的:探讨回药爱康方(HAKF)含药血清对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法:SD大鼠随机分为对照组、爱康方低、中、高剂量组、环磷酰胺(CTX)组、回药爱康方低、中、高剂量分别联合环磷酰胺化疗组,药物低、中、高剂量15.0,30.0,45.0 g·kg-1,连续灌胃15 d,麻醉后心脏取血,制备含药血清。培养细胞,将细胞分为实验组和对照组,实验组分别给予含5%,10%,20%3个体积分数的相应各组含药血清,对照组给予等体积分数的对照组大鼠血清,培养24,48,72 h后采用Annexin-VFITC/PI双染法测定各组含药血清对A549细胞凋亡的影响。结果:与对照组比较,各时段5%,10%,20%浓度含药血清可提高A549的凋亡率(P<0.05),72 h时,各浓度回药爱康方低、中、高剂量含药血清对细胞的凋亡率的提高程度小于CTX(P<0.05);72 h 10%体积分数回药爱康方低剂量联合环磷酰胺血清提高细胞的凋亡率大于单纯CTX(P<0.05);各浓度爱康方中剂量和高剂量血清组,72 h与24 h比较,两组A549细胞的凋亡率均升高(P<0.05);随着血清体积分数的提高,各组细胞的凋亡率和坏死率呈增大趋势。结论:回药爱康方可诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡,且有一定的剂量和时间依赖性。     

基于Notch/Treg/Th17通路探究活血消瘿方对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺功能和病理形态的影响

目的：探讨活血消瘿方（HXXYF）调控Notch/调节性T细胞（Treg）/辅助性T细胞17(Th17)通路对桥本甲状腺炎（HT）大鼠甲状腺功能和病理形态的影响。方法:将84只大鼠随机分为对照组（NC组）、模型组（Model组）、低剂量HXXYF组（HXXYF-L组,0.5 g/kg）、高剂量HXXYF组（HXXYF-H组,2 g/kg）、左旋甲状腺素钠组（LTSD组,0.1 mg/kg）、Jagged1(Notch激活剂)组（0.67 mg/kg Jagged1）、HXXYF-H+Jagged1组（2 g/kg+0.67 mg/kg）,每组12只。除NC组外,其他组大鼠均构建HT模型。全部造模成功后,进行给药处理,1次/d,持续4周。ELISA法检测大鼠血清中游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、白细胞介素（IL）-17、IL-10水平;流式细胞术检测大鼠外周血中Treg、Th17比例;HE染色检测大鼠甲状腺组织病理变化;Western blotting检测甲状腺组织中叉头框蛋...     

消癌解毒方含药血清对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用

目的 观察消癌解毒方的抗肿瘤作用机理.方法 采用人肝癌细胞SMMC-7721,经过细胞培养、MTT 法、流式细胞仪Annexin V-FITC法检测消癌解毒方含药血清对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.结果 消癌解毒方具有良好的抑制肝癌细胞生长、促进凋亡的作用,尤其以高剂量组[抑制率为35.8％,凋亡率为(23.0±1.6)％]的效果最佳,作用程度与化疗药物顺铂[抑制率为35.3％,凋亡率为(22.8±4.4)％]相似(P＞0.05).结论 消癌解毒方含药血清能抑制人肝癌细胞SMMC-7721生长,作用机制需要进一步的研究.     

中医药通过mTOR途径调节细胞凋亡与自噬的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其生物学功能主要是参与细胞的增殖、生长及分化,从而调节机体的代谢过程。诸多国内外研究表明,mTOR是细胞凋亡及自噬信号转导通路的交汇点,营养、药物及氧化应激等多种刺激均可通过mTOR介导的信号通路对细胞的凋亡和自噬起到关键性的调控作用。目前,诸多研究已经证明,mTOR信号通路的改变与多种人类疾病的发病机制密切相关,如癌症、代谢紊乱(肥胖和2型糖尿病)、心血管和神经退行性疾病、与年龄有关的疾病和卵泡发育障碍等。近年来,越来越多的医家以该通路为切入点,以细胞凋亡和自噬为研究载体,研究了中医药对细胞凋亡和自噬的调节。其中包括中药单体、中成药、中药复方以及针灸等药物及物理疗法调控凋亡及自噬的实验研究。本文从mTOR信号通路入手,探讨了mTOR与细胞凋亡及自噬的关系,综述了中医药经mTOR途径调节细胞凋亡与自噬的最新进展,为中医药在该领域的深入研究提供了思路与参考。今后,中医药领域仍可以mTOR信号通路为依托,在中医基础理论的指导下对细胞凋亡和自噬的时效关系进行探索,为中医药在机体的作用机制提供新的现代医学的理论支持和作用靶点。     

软坚消瘿汤对甲状腺细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的影响

目的观察软坚消瘿汤对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠甲状腺凋亡蛋白Bcl-2/Bax和细胞凋亡的影响,从细胞凋亡角度探讨其作用机制。方法运用甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合免疫注射法,联合饮用高碘水模拟大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎。免疫组化染色法检测大鼠甲状腺细胞Bcl-2/Bax变化,原位末端标记技术检测细胞凋亡。结果软坚消瘿汤能显著降低Bax表达,增加甲状腺细胞Bcl-2表达,减少甲状腺细胞凋亡。结论软坚消瘿汤可能通过降低滤泡上皮细胞Bax表达,提高Bcl-2表达从而减轻甲状腺细胞凋亡。     

白花丹素对乳腺癌细胞凋亡和自噬的影响

目的观察白花丹素对乳腺癌细胞凋亡及自噬的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用不同浓度白花丹素作用于乳腺癌MCF-7和BT549细胞,CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位(MMP),流式细胞术检测细胞凋亡情况,免疫荧光检测细胞内LC3B蛋白表达,Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2、LC3B、AMPK和p-AMPK蛋白表达。结果不同浓度白花丹素可抑制乳腺癌MCF-7和BT549细胞生长,抑制细胞克隆形成,其IC50分别为15.9μmol/L和13.51μmol/L;16、32μmol/L白花丹素处理后,MCF-7细胞MMP降低,ROS水平升高,Bcl-2蛋白表达降低,Bax、LC3BⅡ、p-AMPK蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。使用AMPK抑制剂(10μmol/L Dorsomorphin)或自噬抑制剂(5 mmol/L 3-MA)与白花丹素(32μmol/L)同时处理MCF-7细胞后,LC3BⅡ、p-AMPK蛋白表达较单独使用白花丹素(32μmol...     

补肾活血方含药血清对AGE-BSA诱导的HK-2细胞凋亡及PERK-ATF4-CHOP信号通路的影响

目的 观察补肾活血方（BSHXF）含药血清对糖基化终产物修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡的影响及其机制。方法 采用AGE-BSA诱导HK-2细胞建立凋亡损伤模型，将HK-2细胞分为牛血清白蛋白（BSA）组、AGE-BSA组、不同浓度（2.5%、5%、10%、20%）BSHXF含药血清组，CCK-8法检测各组细胞活力。确定10%、20%BSHXF含药血清可显著提高HK-2细胞活力后再将HK-2细胞分为BSA组、AGE-BSA组、BSHXF低剂量组（BSHXF-L,10%含药血清）和BSHXF高剂量组（BSHXF-H,20%含药血清），流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。以4-苯基丁酸钠盐为阳性对照，设BSA组、AGE-BSA组、BSHXF-L组、BSHXF-H组和4-PBA组，运用Western Blot和RT-PCR法检测补肾活血方对HK-2细胞葡萄糖调节蛋白78 (GRP78蛋白)及mRNA表达的影响。将蛋白激酶样内质网激酶（PERK）-shRNA转染HK-2细胞，采用RT-PCR和Western Blot检测各组PERK mRNA和蛋白的表达。...     

Cell Cycle Arrest, Apoptosis, and Autophagy Induced by Chabamide in Human Leukemia Cells

Objective To investigate the antitumor effect of chabamide in K562(human leukemia cell line) cells. Methods The cytotoxicity was assessed by a standard colorimetric assay using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT). The morphological changes were observed by Hoechst 33258 staining. Induction of apoptosis, loss of the mitochondrial membrane potential(ΔΨm), and cell cycle analysis were evaluated by flow cytometry(FCM) analysis. Levels of apoptosis-related proteins, cell cycle-related proteins, and LC3 protein were detected by Western blotting. Moreover, the autophagy induced by chabamide was also detected by MDC fluorescent staining. Results Chabamide significantly inhibited cell proliferation by cell cycle arrest in the G0/G1 phase. This phenomenon was associated with an obvious increase in p21 expression and decrease in cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 2/4/6 protein expression. Moreover, chabamide could regulate the changes in mitochondrial membrane potential, increase the expression of apoptosis-related proteins, such as Bax and cytochrome C, and decrease the protein expression of Bcl-2, caspase-9, caspase-3, and PARP-1. JNK, ERK1/2, and p38 were also regulated by chabamide in K562 cells. Furthermore, induction of autophagy, marked by autophagic vacuole formation, was detected. Conversion of LC3-I to LC3-II, a marker of active autophagosome formation, was also detected following chabamide treatment. Conclusion The antitumor activity of chabamide with the results of apoptosis and autophagy induction was confirmed in K562 cells.     

活血补肾方对大鼠退变腰椎间盘mTOR通路依赖性自噬的影响

目的 观察活血补肾方对大鼠退变腰椎间盘mTOR通路依赖性自噬的影响,探讨该方延缓腰椎间盘退变的作用机制。方法 将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、雷帕霉素组、活血补肾方组和雷帕霉素+活血补肾方组（简称联合组）5组。除对照组外,其余各组均采用去前肢诱导动静力失衡法复制腰椎间盘退变动物模型。建模成功后,分别给予相应处置。给药6周后,取L5/6椎间盘分别行HE和阿尔新兰-核固红染色,镜下观察腰椎间盘退变的形态学和基质变化,并检测mTOR通路下游蛋白p70S6K、4E-BP1和自噬相关蛋白beclin-1、lc-3b的表达情况。结果 ①腰椎间盘退变的程度（组织形态学观察）：模型组最严重,对照组最轻,雷帕霉素组、活血补肾方组和联合组三组相似,介于前两者之间;②细胞外基质中蛋白聚糖含量：对照组最高,联合组较对照组略少,雷帕霉素组和活血补肾方组次之,且两者差异不明显,模型组最低;③ mTOR信号通路下游蛋白：各实验组均与模型组含量存在显著差异（P＜0.05）,p70S6K表达水平：模型组>雷帕霉素组>活血补肾方组>联合组;4E-BP1表达水平为：模型组>活血补肾方组>雷帕霉素组>联合组;④自噬相关蛋白：beclin-1及lc-3b表达水平：联合组>活血补肾方组>雷帕霉素>模型组>对照组,并且各实验组含量均与模型组差异存在显著性（P＜0.05）。结论 活血补肾方具有延缓大鼠腰椎间盘退变的作用,其作用机制与其抑制mTOR信号通路,提高腰椎间盘内自噬水平有关。     

基于自噬途径观察飞龙掌血醇提物对NSCLCA549细胞凋亡的影响

目的：观察飞龙掌血醇提物对NSCLCA549细胞自噬和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：体外培养A549细胞,采用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测细胞增殖的情况,并计算A549细胞的存活率,筛选出药物的浓度。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)法检测各组及加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组及加入3-MA后凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、活化的胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、活化的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP1)及PARP1、活化的死亡激动剂(t-Bid)及Bid、泛素结合蛋白p62的表达情况。结果：与空白组比较,干预24 h,0.25 g·L^-1飞龙掌血醇提物组细胞存活率明显下降(P<0.05),0.5、1、2、4 g·L^-1飞龙掌血醇提物组细胞存活率显著下降(P<0.01);48 h...     

桦木酸通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人结肠癌细胞SW620凋亡及自噬

目的 研究桦木酸对人结肠癌细胞SW620凋亡和自噬的影响及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。方法 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性,确定最佳给药时间及给药浓度,用于后续实验;设置空白组、桦木酸低、中、高浓度组。采用苏木素-伊红（HE）染色观察桦木酸对SW620细胞形态的影响。采用Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染法检测SW620细胞凋亡率。分别采用Hoechst33258染色及细胞自噬染色（MDC）观察细胞凋亡和自噬体发生情况。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-9（Caspase-9）、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）,微管相关蛋白Ⅰ轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、自噬关键分子酵母Atg6同系物-1（Beclin-1）、p62、磷酸化（p）-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果 桦木酸以浓度、时间依赖性的方式抑制SW620、HT29、HCT116细胞的活性;与桦木酸给药24 h比较,W620、HT29、HCT116细胞给药48 h细胞活性明显降低（P<0.05,P<0.01）,给药48 h的半数抑制浓度（IC₅₀）显著降低（P<0.01）,其中SW620细胞给药48 h的IC₅₀最小。HE染色、Hoechst33258染色显示,桦木酸组可见浓度依赖性细胞凋亡;MDC染色可见细胞自噬体数量增加。与空白组比较,桦木酸低、中、高浓度组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）。与空白组比较,桦木酸低、中、高浓度组Bax、Caspase-9、cleaved Caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01）,桦木酸中、高浓度组Beclin-1蛋白表达显著升高（P<0.01）;桦木酸低、中、高浓度组p62、p-Akt、p-PI3K、p-mTOR蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 桦木酸对SW620细胞活性有明显的抑制作用,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而诱导人结肠癌细胞SW620的凋亡及自噬有关。     

基于Pink-1/Parkin信号通路补青颗粒含药血清对高糖诱导人晶状体上皮细胞线粒体自噬的影响

目的:探讨补青颗粒含药血清对高糖诱导的人晶状体上皮(HLE)细胞线粒体自噬的影响。方法:体外培养HLE细胞,空白组将HLE细胞在正常培养液中培养48 h,模型组在空白组培养液中添加30 mmol·L~(-1)葡萄糖,实验组在模型组基础上加入不同含药血清刺激培养48 h。采用CCK-8法检测不同含药血清对高糖诱导的HLE细胞增殖活力的影响;利用免疫荧光技术及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Pink-1,Parkin,p62蛋白表达。结果:CCK-8法结果显示模型组较空白组HLE细胞增殖活力增强(P0.01);与模型组比较,杞菊组与补青颗粒高、中、低剂量组细胞增殖活力均降低(P0.01);与杞菊组比较,补青颗粒中剂量组细胞增殖活力明显降低(P0.01);补青颗粒不同剂量组间比较,补青颗粒中剂量组细胞增殖活力显著降低(P0.01)。细胞免疫荧光结果显示Pink-1,Parkin,p62蛋白主要在细胞胞浆表达,细胞核内亦有少量表达。Western blot结果显示与空白组比较,模型组Pink-1,Parkin表达增加(P0.01),p62表达降低(P0.01);与模型组比较,杞菊组与补青颗粒中剂量组Pink-1,Parkin表达增加(P0.01),p62表达降低(P0.01);与杞菊组比较,补青颗粒中剂量组Pink-1,Parkin表达增加(P0.01,P0.05),p62表达降低(P0.01)。结论:补青颗粒对高糖诱导的HLE细胞线粒体自噬相关蛋白的表达有显著影响,线粒体自噬的改变可能是补青颗粒改善白内障发病的机制之一。