濒危药用植物麻花秦艽和粗茎秦艽cpDNA提取研究

目的：对麻花秦艽和粗茎秦艽叶绿体基因组进行提取研究,为进一步研究秦艽叶绿体的基因组序列特征、遗传多样性以及资源保护研究奠定基础。方法：本文以麻花秦艽、粗茎秦艽为对象,采用改良的蔗糖密度梯度离心方法进行提取,优化纯化方法,分离得到秦艽叶绿体后测定cpDNA浓度,检测其OD值并扩增ITS2序列验证其纯度。结果：获得高质量、高纯度的cpDNA（0．1～0．4μg／10g）,扩增ITS2序列验证其无核污染,满足后续测序要求。结论：cpDNA的纯度和质量对叶绿体基因组测序的正确率和可信度具有重要的影响。本文获得了高纯度、高质量的秦艽cpDNA,为秦艽叶绿体基因组全序列的获得提供保障。     

基于ISSR标记的麻花艽遗传多样性分析

目的探讨秦艽基原植物之一麻花艽Gentiana straminea的遗传多样性,并构建DNA指纹谱。方法在其自然分布区广泛取样,共涉及西藏、青海、甘肃及四川等地28个居群83份样本,应用ISSR分子标记技术,POPGEN软件分析遗传信息参数,NTSYS软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。结果从100条引物中筛出7条多态性好、条带清晰的引物用于ISSR分析。共检测到95个条带,其中多态性条带88个,多态性条带百分率(PPL)为92.63%;麻花艽居群间的期望杂合度(H_e)为0.288 2,多样性信息指数(I_m)为0.437 1,种群间基因分化系数(G_(st))为0.678 3,基因流(N_m)为0.237 1,遗传距离为0.074 3~0.490 0。UPGMA树将麻花艽居群主要分为2大支。结论麻花艽种群遗传多样性水平较高,居群间遗传多样性水平高于居群内;其遗传变异主要存在于居群间;遗传特性与地理分布具有一定相关性。该工作可为麻花艽品种鉴定、物种就地保护、探讨环境等因素对于遗传分化的影响及药材道地性研究提供基础资料。     

基于叶绿体DNA序列和ISSR分子标记的菘蓝不同种质遗传变异分析

目的 对47个菘蓝种质进行序列变异和遗传多样性分析,开展其遗传分化和遗传结构研究。方法 采用试剂盒提取法提取菘蓝基因组DNA,用2条叶绿体DNA（cp DNA）序列和5条简单重复序列（ISSR）引物进行扩增并测序,通过软件Chromas、Mega 7.0、DanSP5、GenALEx对得到的序列进行校正、拼接及序列特征分析,利用软件PERMUT、PopGen1.31进行遗传多样性参数和遗传结构分析,最后利用NTSYS软件得到47个菘蓝种质的非加权组平均法（UPGMA）聚类树状图。结果 菘蓝47个种质的129个样本被成功扩增和测序,2个cp DNA序列经拼接后长度为1 412 bp,共有377个多态性变异位点,单倍型数为36个,Fu and Li''s D*检验在P<0.01水平上显著;基于cp DNA的核苷酸多样性（Pi）、平均遗传多样性（H_S）和总遗传多样性（H_T）分别为0.119 89、0.787和0.891,遗传分化系数遗传分化系数（Gst）、核苷酸分化系数（Nst）和群体间遗传分化指数（Fst）分别为0.117、0.468和0.488,基因流（Nm）值为0.615;基于ISSR的多态位点百分率（PPB）、香农（Shannon）信息多样性指数(I)、Nei''s基因遗传多样度指数(H)和Gst平均值为78.85%、0.334 8、0.218 6和0.754 4,Nm值为0.162 8。结论 菘蓝在物种水平上遗传多样性较高,具有丰富的单倍型类型,不同种质居群间遗传分化较明显,且基因交流不频繁,遗传变异主要存在于居群间,种群近期积累了较多的低频基因突变,推测其历史上曾经历了显著的区域扩张。     

西部地区濒危药用植物秦艽遗传多样性的RAPD分析

目的:对甘肃、陕西、宁夏、四川及青海5个主产地秦艽的遗传多样性进行分析。方法:用随机扩增多态性DNA标记(RAPD)技术对11个秦艽种群90个个体基因组DNA的遗传多样性进行检测。结果:RAPD 8条引物检测到65条扩增条带,其中有59条是多态的,多态位点百分比达到97.78%。通过聚类分析可将秦艽的11个种群聚为两类,四川和陕西两省4个种群聚为一类;甘肃、宁夏和青海省7个种群聚为一类。结论:甘肃省环县种群、子午岭种群和华亭种群应作为秦艽的重要种群加以优先重点保护。     

基于SRAP分子标记的天麻遗传多样性研究

目的 利用SRAP分子标记技术对天麻种质资源进行遗传多样性研究,为天麻不同亲缘物种间的分类及其优良种质资源的筛选提供依据。方法 采集7个不同生态区域的天麻种质资源,包括红杆G.elata f.elata、乌杆G.elata f.glauca和绿杆G.elata f.viridis 3种变型和红乌杂交天麻,共24份样品。运用SRAP分子标记方法构建天麻种质的DNA指纹图谱,从分子水平检测其遗传多样性。结果 33对引物扩增出637条多态性条带,多态性百分率达73.16%。24份天麻种质样品间相似度分布于0.404 0~0.908 0,整个群体之间的相似程度差异较大。其中红天麻样品间的相似度在0.906 6~0.996 4,遗传差异较小;乌天麻、杂交天麻和绿天麻样品间的相似度分别在0.410 4~0.999 6、0.541 0~0.950 4和0.578 2,遗传差异较大。AMOVA分析结果显示,天麻变型内变异大于变型间变异,天麻各变型间有很大的遗传分化(FST=0.33,P<0.05)。另外,人工栽培对遗传分化有影响,但不显著。结论 SRAP分子标记方法得到的24份天麻样品多态性丰富,能有效地反映出天麻的遗传多样性。红杆天麻的遗传性状较为稳定,与其他变型间缺乏基因交流,遗传多样性匮乏;其他2个变型具有较高的遗传多样性。     

ISSR分子标记对金荞麦8个野生居群的遗传多样性分析

目的对野生金荞麦进行遗传多样性研究。方法通过ISSR技术对8个野生金荞麦居群的共92个个体进行遗传多样性分析。结果用12个随机引物共扩增出103条清晰条带,其中90条具多态性,平均多态性位点比率为87.38%,Nei′s基因多样性指数H=0.374 7,Shannon多样性指数I=0.572 8,遗传分化指数Gst=0.171 8。遗传距离和遗传一致度分别为:0.043 1~0.384 9和0.684 3~0.954 5。结论金荞麦种内具有较高的遗传多样性,遗传变异主要存在于居群内部,遗传多样性与地理关系表现出明显的相关性。ISSR可以作为研究遗传多样性及遗传分化的有效标记。     

基于叶绿体DNA序列的多基原黄精分子鉴定

目的 通过分析rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列变异特点,评价其对3种不同基原黄精的鉴定能力。方法 分别提取3种基原黄精总DNA,以rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用MEGA 5软件寻找其特异位点,计算样品K2-P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树。结果 rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列长度分别为722~737、293、457~531 bp,简约信息位点占比分别为0.4%、1.0%和2.4%。rpl20-rps12和psbA-trnH序列中种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离。基于3个序列构建的NJ树显示,3种基原黄精都表现出良好单系性,能明显区分。结论 从序列特点和种内、种间变异性综合分析,rpl20-rps12序列更适宜黄精的基原鉴定。     

基于cp DNA的当归野生与栽培种质鉴定与遗传变异分析

目的 基于叶绿体基因（cp DNA）对甘肃省11个当归栽培品种（系）及7个野生当归居群进行了遗传变异分析,为当归的种质鉴定和新品种的选育提供参考。方法 利用3对cp DNA 引物对当归样品进行聚合酶链式反应（PCR）扩增并测序,利用MegaX软件对序列特征进行统计,并计算当归居群间平均遗传距离,利用NTSYS 2.10e软件构建遗传距离非加权组平均法（UPGMA）聚类图。利用DanSP v6软件计算当归序列多态性及Tajima中性检验;利用PERMUT软件计算当归居群结构;利用Arlequin v3.5软件进行分子变异分析;最后利用PopART 1.7软件构建TCS单倍型网络图。结果 3对cp DNA 引物扩增、测序、比对、合并后的序列长度为1 759 bp,野生当归检测到1个变异位点,栽培当归检测到480个变异位点,其中单一突变位点97个,简约信息位点383个,插入-缺失位点152个。在野生组和栽培组当归cp DNA 的matK、psbA-trnH和rbcL 3个区域中,多态性最高的区域均为matK。全部当归联合序列的Tajima中性检验均为不显著负值,但在栽培当归中psbA-trnH和rbcL基因中呈显著负值,说明当归整体上遵循中性进化,而psbA-trnH和rbcL基因经历过选择。野生居群间的遗传分化程度（Fst=0）低于栽培当归居群间的分化程度（Fst=0.114 19,P<0.05）,且二者之间遗传分化程度较高（Fst=0.942 55,P<0.01）。栽培当归居群中变异主要来源于居群内部（89%）。遗传距离UPGMA聚类树显示野生当归和栽培当归各自聚为一支,亲缘关系较远,栽培当归中居群3距离其他栽培当归居群较远。TCS单倍型网络图由15个单倍型和4个未知单倍型构成,分为3部分,各部分间变异次数较多,共享单倍型仅分布于野生或栽培组之内,组间不存在共享单倍型。结论 当归在物种水平上遗传多样性偏低,野生当归居群多样性低于栽培当归,野生与栽培当归组间的遗传分化程度高,而野生当归居群内和栽培当归居群内的分化程度均较低,栽培当归中遗传变异主要存在于居群内。     

基于ISSR的甘肃中麻黄遗传多样性研究

目的研究甘肃不同居群中麻黄Ephedra intermedia的遗传多样性。方法应用ISSR分子标记技术对甘肃省11个居群的中麻黄样本进行分析,利用POPGENE 32软件分析Nei’s基因多样性指数(H)等遗传信息参数,应用NTSYS软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。结果 12条引物共检测到175个位点,其中多态性位点150个,多态位点百分率(PPL)为85.71%。中麻黄居群间的H为0.211 4,Shannon’s多样性信息指数(I)为0.332 1,种群间基因分化系数(Gst)为0.259 3,基因流(Nm)为1.428 6,遗传距离0.014 4~0.159 8。结论甘肃中麻黄种群遗传多样性水平较高,但居群内遗传多样性水平低于居群间;中麻黄种群的遗传变异主要存在于居群内;亲缘关系与地理分布具有一定的相关性。     

栀子遗传多样性及遗传分化的RAPD分析

 目的应用随机扩增多态性DNA(random amplifed polymorphic DNA,RAPD)标记技术对栀子8个种群遗传多样性和遗传分化进行研究。方法18种随机引物对92个个体进行检测,应用POPGENE软件和AMOVA软件对结果进行处理。结果共得到120个可重复的位点,其中多态位点75个,多态百分率为62.5%。各种群内多态位点百分率在39.17%～68.83%之间,平均为56.98%。河南南阳(POP1)种群最高,其次是江西新干县野生种群(POP7),最低是江西抚州水栀子种群(POP3)。Shannon指数和Nei指数均反映出栀子各种群具有较高的遗传多样性。Shannon指数为0.431 3,各种群Shannon指数在0.2256～0.380 6之间,Nei指数为0.289 2,各种群Nei指数在0.148 2～0.263 0之间。AMOVA揭示种群内遗传多样性占总遗传多样性的76.05%,而种群间遗传多样性只占23.95%。运用POPGENE也得出种群内遗传变异(69.34%)大于种群间(30.66%)的结论。种群间的遗传分化系数为0.306 6。栀子种群间的基因流为1.130 6,遗传相似度平均为0.129 09,遗传距离平均为0.880 72。根据遗传距离聚类分析,河南南阳种群(POP1)与江西樟树新干种群(POP4,POP5,POP6,POP7)聚为一类,湖南种群(POP8)与江西抚州栀子种群(POP2)聚为一类,江西抚州水栀子种群(POP3)与其他各种群间的遗传关系较远。结论目前,虽然野生资源逐年减少以及多年栽培中的品种选育,栀子遗传多样性仍较丰富,且种群内大于种群间,种群间存在较少的遗传分化。     

小秦艽和秦艽核型的比较研究

 目的首次对小秦艽和秦艽的核型进行比较研究,为其遗传和进化提供了进一步的细胞学证据。方法根尖用0.002mol·L^-1的8-羟基喹啉溶液预处理5.7h,用2.5%混合酶液,于25℃下酶解1.6h,低渗处理3h(置于冰箱内),然后用空气干燥法制片。结果小秦艽的核型公式是K(2n)=26=2M+24m,属于"1A"型,染色体相对长度组成为2n=26=2L+10M₂+12M₁+2S;秦艽的核型公式是K(2n)=26=2M+20m+4sm,属于"2B"型,染色体相对长度组成为2n=26=6L+6M₂+8M₁+6S。结论小秦艽的核型与秦艽相比较,秦艽较为进化。     

紫金砂化学成分研究

 目的 研究紫金砂的化学成分。方法 药材采用体积分数80％乙醇提取,氯仿萃取,利用硅胶柱,RP-18反相柱,Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化,并根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果 分离鉴定13个化合物,分别为异欧前胡素（1）、水合氧化前胡素内酯（2）、拐芹色原酮（3）、佛手柑内酯（4）、欧前胡素（5）、ledebouriellol（6）、二氢欧山芹素（7）、isopimpinellin（8）、osthol（9）、3′(R)-+-亥茅酚（10）、oxypeucedanin ethanolate（11）、β-谷甾醇（12）、豆甾醇（13）。结论 化合物6~11为首次从紫金砂中分离得到,其中化合物6、11为首次从当归属植物中分离得到。     

蛹虫草活性成分的提取分离及体外抗氧化作用研究

目的 以抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)活性为导向,筛选蛹虫草子实体有效部位,分离纯化单体化合物,并检测其体外抗氧化作用。方法 通过硅胶色谱柱,半制备高效液相等色谱技术对蛹虫草子实体进行分离纯化,检测各组分对PTP1B的抑制活性;应用核磁碳谱、氢谱数据分析鉴定单体化合物结构;利用MTT法检测单体化合物对PC12细胞的增殖作用,及其对过氧化氢(H₂O₂)损伤的PC12细胞存活率的影响,试剂盒检测单体化合物对细胞乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的影响。结果 发现5个对PTP1B具有较强抑制作用的活性成分,将其中活性最高的成分进一步分离纯化,获得单体化合物,经鉴定为β-D-吡喃葡萄糖基-9-甲基-4,8鞘氨醇(5),其对PTP1B具有较强的抑制活性,半抑制浓度(IC₅₀)为(3.42±0.59) μmol·L^-1。该单体化合物对H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤具有明显的保护作用。结论 首次以抑制PTP1B活性为导向,在蛹虫草中分离得到脑苷脂类单体化合物,其具有抑制PTP1B作用和体外抗氧化活性,为蛹虫草用于糖尿病的预防和治疗奠定理论基础。     

双三元液相色谱串联ICP-MS对中国东北和西南地区的4种松茸的砷形态分析

目的 松茸中砷含量很高且含有不同的砷形态,包括:砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、三价砷(AsⅢ)、五价砷(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三甲基氧化砷(TMAO)和砷糖.然而,有机砷化合物被认为毒性较小,甚至无毒,所以总砷含量不能提供关于其毒性的全部有效信息,需分析其具体的砷酸盐形态.方法 我们...     

青蒿富倍半萜提取物的稳定性及光物质转化的初步研究

目的 考察青蒿富倍半萜提取物在高温、高湿和强光照射条件下的稳定性,并初步探究在光照条件下倍半萜组分间的转化规律。方法 根据《原料药物与制剂稳定性试验指导原则》,对提取物进行高湿(相对湿度90%)、高温(60 ℃)、强光照射(4 500 lx)试验,考察其重量及含量变化,并对提取物、原药材及青蒿乙素(arteannuin B)、青蒿素(artemisinin)、青蒿酸(artemisinic acid)及二氢青蒿酸(dihydroartemisinic acid)的对照品进行30 d光照试验(4 500 lx),检测各倍半萜组分的含量变化,并应用液质联用(LC-MS)方法对光照后各对照样品进行定性分析。结果 提取物在高湿条件下于10 d内各检测成分无明显变化,高温及强光照条件下青蒿酸及二氢青蒿酸含量降低,强光照条件下青蒿素及青蒿丙素含量有所升高。经30 d照射后提取物及原药材中青蒿酸及二氢青蒿酸均显著降低,青蒿素明显升高,光照5 d后即可在二氢青蒿酸的对照品中检测到青蒿素,并随时间的增加,其含量持续上升。提取物、原药材及二氢青蒿酸对照品组的青蒿素平均转化率分别为75.33%、59.10%和1.29%。LC-MS定性结果显示二氢青蒿酸和青蒿酸经过30 d强光照射,分别产生了青蒿素与青蒿乙素。结论 作者首次发现了青蒿富倍半萜提取物的光反应转化现象,这提示该提取物在高温及光照条件下将导致物质组成的变化,应避光保存于阴凉处。此外,在以提取青蒿素单一化合物为目标时,原药材在采收后适当增加光照有助于提高其得率。     

HPLC指纹图谱分析不同产地天麻中酚类成分差异

目的 构建57批天麻样品的HPLC指纹图谱,结合含量测定、聚类分析和主成分分析综合评价不同产地天麻中代表性酚类成分含量。方法 采用VisionHT-C₁₈-HL色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.8 mL·min^-1,检测数长220 nm,柱温30 ℃。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”和SPSS 23.0软件进行指纹图谱研究和化学计量学分析。结果 建立的指纹图谱共标定了10个共有峰,通过与对照品比对指认了天麻素、天麻苷元、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷A 6个色谱峰,57批样品相似度大于0.81。基于含量测定结果的聚类分析与主成分分析结果一致,可将药材分为两大类,其中吉林露水河产天麻的酚类成分含量最高。结论 所建立的综合分析方法稳定可靠,可为后续天麻的质量差异评价提供参考。     

已公布的卡马西平片参比制剂在体内外的相关性研究

目的 以2家企业、2种规格的卡马西平片作为参比制剂进行体内外相关性研究,指导国内仿制药企业更好地开展仿制药一致性评价工作。方法 测定北京诺华和太阳药业(日本)生产的卡马西平片参比制剂在5种不同溶出介质中的溶出曲线,随后应用Gastro Plus软件建模、人工仿生膜结合Macro Flux^TM 型药物溶出度与渗透速率测试系统进行体内外相关性研究,预测2家参比制剂的体内生物等效性。结果 2家企业的卡马西平片参比制剂在5种溶出介质中的溶出曲线均不相似,Gastro Plus软件虚拟生物等效性(BE)与溶出-渗透测定结果显示2家制剂在空腹和饱腹2种状态中均存在生物不等效风险。结论 本研究发现2家企业的卡马西平片参比制剂体外溶出不一致,软件建模预测及人工仿生膜技术预测其体内存在生物不等效的风险,对同时生产两种规格制剂的企业而言,可能导致同一企业不同规格的仿制药在一致性评价中存在生物不等效的风险,建议国家药监局确定唯一企业的参比制剂。本研究为卡马西平片参比制剂的选择提供了数据基础,也为窄治疗窗口药物参比制剂的遴选和确定提供参考,同时为仿制药一致性评价提供技术支撑。     

RP-HPLC同时测定不同采集地紫丁香树枝中丁香苷和橄榄苦苷的含量

 目的建立反相高效液相色谱法同时测定紫丁香树枝中丁香苷和橄榄苦苷含量的方法。方法Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-水,梯度洗脱,流速1.0mL·min^-1;柱温30℃,检测波长232nm。结果丁香苷和橄榄苦苷均有较好的分离度,二者分别在0.021～1.05g·L^-1(r=1.0000)之间和0.093～0.72g·L^-1(r=0.9992)之间有良好的线性范围;平均回收率分别为101.1%和99.4%;具有良好的精密度和重现性。结论本方法准确、精密度高、专属性好,可用于紫丁香树枝及其制剂的质量控制。     

林下参与栽培参扩增片段长度多态性指纹图谱鉴定

 目的探讨林下参与栽培参DNA直接扩增片段长度多态性（directamplificationoflengthpolymorphisms,DALP）特征,建立林下参与栽培参直接扩增片段长度多态性指纹鉴定图谱。方法采用改进十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）法提取林下参和栽培参基因组DNA,设计6条随机引物,优化直接扩增片段长度多态性体系,进行PCR扩增。结果采用改进的十六烷基三甲基溴化胺法从人参样品中提取到约为19kb左右的基因组DNA,其纯度在（1.80±0.23）之间,并获得林下参与栽培参的直接扩增片段长度多态性指纹图谱。结论获得的林下参直接扩增片段长度多态性图谱具有指纹特征,可以作为林下参与栽培参的特异鉴定方法。     

HPLC测定北五味子果实、藤茎超临界萃取物中木脂素的含量

 目的 采用HPLC同时测定北五味子果实、藤茎超临界萃取物中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的含量。方法 采用ODS-C₁₈(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-水（75∶25）为流动相,流速：1.0 mL·min-1,检测波长为254 nm。结果 五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的线性范围分别为0.10～2.00 μg(r=0.999 4)、0.10～2.00 μg(r=0.999 7)、0.12～2.40 μg (r=0.999 2),平均加样回收率分别为99.11%、101.18%、101.23%（RSD分别为1.57%、2.68%、2.80%)（n＝10）。结论 本方法简便准确、重现性好,能有效测定北五味子果实、藤茎超临界萃取物中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的含量。