基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

左卡尼汀注射液中三甲胺分离提取及其离子色谱测定法研究

目的 建立分离提取左卡尼汀注射液中三甲胺含量的方法,及采用离子色谱法对三甲胺进行检测研究。方法 以L₉(3⁴)正交试验优化提取条件,采用0.25 mol·L^-1NaOH溶液创造碱性环境,40 ℃加热20 min,连接N₂流量为0.4 L·min^-1,用0.1 mol·L^-1甲磺酸溶液吸收气体,有效实现左卡尼汀注射液中三甲胺的分离提取;采用DionexIonPac^TM CS12A(4.0 mm×250 mm)色谱柱,DionexIonPac^TM CG12A(4.0 mm×50 mm)保护柱,以17 mmol·L^-1甲磺酸溶液为淋洗液,流速0.5 mL·min^-1,柱温30 ℃,电导检测。结果 三甲胺在0.30~48.64 μg·mL^-1内线性关系良好,相关系数为0.999 3,检出限为0.012 μg·mL^-1(S/N=3),定量限为0.3 μg·mL^-1(S/N=10),精密度良好,溶液置于室温24 h或2~8 ℃48 h内稳定。平均加样回收率在97.33~100.82%内,相对标准偏差(RSD)为1.07%(n=9)。结论 该方法能够有效提取分离左卡尼汀注射液中的三甲胺,离子色谱检测方法灵敏度高,回收率和重现性良好。     

基于PCR-核酸试纸条快速鉴定鹿茸及其伪品的实验研究

目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^-1。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。     

檀香及其混淆品的鉴别与数字化研究

目的 通过对正品檀香及其市售混伪品进行比较研究,找出特征性鉴别点。方法 采用性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、挥发油含量测定及气相色谱-质谱联用自动解卷积定性系统(GC-MS-AMDIS)自动智能化成分鉴定等手段,对正品檀香及其市售混伪品进行比较研究。结果 性状鉴别中,檀香独有的奶香味为其鉴别点;显微鉴别中油脂的颜色,分布及方晶数量可用于区分正伪品;伪品的挥发油成分与正品檀香差异较大,且不以檀香醇为主要成分;挥发油的含量测定可作为最准确、简便的检验手段,用以判断檀香样品是否符合药典标准的规定。结论 建立正品檀香及市售混伪品的鉴别方法,并给檀香的质量评价提供依据。     

鹿胎阳性质控品DNA检测试剂盒的开发与应用

目的 研发鹿胎DNA阳性质控品,组装检测试剂盒.方法 提取鹿胎及其伪品DNA,设计通用鹿引物并进行PCR扩增,克隆种属特异性目的片段,构建鹿胎DNA阳性质控品并组装DNA检测试剂盒,进行试剂盒性能实验并应用于市售鹿胎样品检测.结果 应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)分析测序比对结果,正确率为100％,在526 b...     

中药材鹿心分子鉴定方法及检测试剂的研究

目的建立中药材鹿心DNA指纹鉴定方法,研发鹿心DNA检测试剂盒。方法以梅花鹿和马鹿mtDNA Cytb基因作为靶基因,设计小片段特异性引物,研制鹿心DNA提取及PCR检测试剂;应用分子克隆及测序技术,克隆鹿心对照药材;并对试剂的特异性、重现性、稳定性及灵敏度进行考察;对市售鹿心样品进行真伪鉴定。结果自主研发的试剂提取鹿心的DNA浓度纯度均达到PCR的要求;在退火温度为63℃时引物的特异性最强;克隆测序后的鹿心DNA序列与鹿心mtDNA Cytb特异指纹区段序列一致;自主研发的试剂重现性、稳定性良好,灵敏度达到0.5%;对市售30个鹿心样品进行检测,伪品率为40%。结论建立的鹿心DNA指纹鉴定方法特异、准确、可靠,研制的鹿心DNA检测试剂盒操作简便、结果稳定。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化。结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05~1 ng,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

毛冬青基因组DNA提取方法及ISSR-PCR

目的:优化毛冬青基因组DNA提取方法,建立稳定性高、重现性好、适合其遗传差异分析的ISSRPCR反应体系。方法:对比CTAB法、mCTAB法、SDS法、蛋白酶K法及植物基因组提取试剂盒的提取效果后,选择mCTAB法结合蛋白酶K法提取毛冬青基因组DNA,并优化了蛋白酶K用量。利用正交试验设计,对毛冬青ISSR-PCR反应的5个因素(Mg²⁺、dNTPs、Primer、DNA、Taq酶)进行优化,PCR结果使用SPSS16.0软件进行分析,基于优化后体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物进行筛选,确定退火温度。结果:采用蛋白酶K-mCTAB法实现了4 h内提取高纯度毛冬青基因组DNA,蛋白酶K用量为20 ng·mL^-1时DNA平均提取量较传统CTAB法提升9.5倍;毛冬青ISSR-PCR最终反应体系为Mg²⁺2.5 mmol·L^-1,dNTPs 0.15 mmol·L^-1,Primer 0.4μmol·L^-1,DNA 70 ng,Taq酶0.5 U。实验从100条引物中筛选出16条引物并确定退火温度,绘制出毛冬青ISSR指纹图谱。结论:蛋白酶K-mCTAB法适合毛冬青基因组DNA的提取,筛选出的反应体系、引物及退火温度能够满足毛冬青ISSR-PCR实验的要求。     

基于巢式PCR方法联合Sanger测序技术对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪的鉴定

目的 基于DNA条形码技术建立一种可以实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品鉴定的方法。方法 首先以COⅠ通用引物对大黄庶虫丸中成药DNA进行一轮聚合酶链式反应(PCR)扩增,随后采用自行设计和筛选出的水蛭通用引物对一轮PCR反应液进行二轮PCR扩增,联合Sanger测序技术,对二轮PCR扩增产物测序,最后对测序结果峰图采用seqman软件进行序列拼接,将拼接后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST在线比对软件进行比对判定,进而鉴定水蛭成分真伪。结果 本实验建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术通过了对9份经COⅠ通用引物鉴定的水蛭干药材的验证,结果验证两方法鉴定结果一致。同时采用本研究建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术对收集的14批大黄庶虫丸进行鉴定,共有5批鉴定出含有伪品水蛭成分。结论 本实验建立的的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术能够实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品的鉴定,对中成药的质量控制具有一定的意义。     

炒苦杏仁饮片指纹图谱研究

目的:建立炒苦杏仁饮片的高效液相指纹图谱,提高药材质量控制水平.方法:采用高效液相色谱法,C18色谱柱,流动相乙腈-0.1％磷酸,流速1 mL· min -1,检测波长225 nm.采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算处理,确定了炒苦杏仁饮片指纹图谱研究方法.结果:各批次药材共获得10个共有峰,超过总面积95％,所得指纹图谱方法学考察结果良好,采用色谱指纹图谱相似度评价软件,对炒苦杏仁饮片指纹图谱进行相似度计算,其10批样品相似度在0.5 ～0.9.结论:指纹图谱的运用实现了炒苦杏仁饮片的全面和整体评价,能体现炒苦杏仁饮片的多个成分的指纹信息,为有效提高炒苦杏仁饮片质量控制提供参考.     

苦杏仁油的超声提取

目的：从苦杏仁中提取脂肪油。方法：运用超声技术提取，并对提取的苦杏仁油进行理化常数的检测。结果：用超声技术提取苦杏仁油的出油率为47．08％。结论：用超声技术从苦杏仁中提取苦杏仁油，可提高提取率，节省提取时间。     

正交试验优选苦杏仁的（火单）制工艺

目的：优选苦杏仁的(火单)制工艺。方法：以苦杏仁苷含量和灭酶程度的综合评分为指标,在单因素试验基础上,通过正交试验考察(火单)制时间、加水量对苦杏仁(火单)制工艺的影响。采用HPLC测定苦杏仁苷含量,色谱条件为Luna 5u C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相乙腈-0.1%磷酸水（15：85）,检测波长210 nm。结果：苦杏仁最佳(火单)制工艺为(火单)制时间10 min,加水量10倍。结论：优选的苦杏仁(火单)制工艺稳定可行,对规范苦杏仁的(火单)制工艺具有一定意义。     

苦杏仁药材质量评价法的研究

目的 :建立苦杏仁药材综合质量评价方法。方法 :用HPLC法测定了苦杏仁药材 14个市售样品、不同年度贮存品及自制炮制品中苦杏仁苷含量 ,并考察了市售药材的常规理化试验项目。结果 :市售药材生品的苦杏仁苷含量与炮制品间差异明显 ,且去皮品中含量均低于药典标准 ,但自制炮制品的含量均达到药典标准 ;不同贮存年度的市售药材生品带皮妥善保存 ,苦杏仁苷含量至少 10年内变化不大 ;市售药材的常规试验项目测定结果表明各种炮制品间的差异较大。结论 :炮制加工过程是影响苦杏仁药材质量的关键因素 ,同时有必要制订其常规理化试验项目 ,加强综合质量控制。     

不同产地苦杏仁质量的化学模式识别研究

目的:建立苦杏仁药材质量评价的化学模式识别方法。方法:采用RP-HPLC法定量分析23个不同产地的苦杏仁中苦杏仁苷的含量,并对水浸出物含量、脂肪油含量进行了分析,结合系统聚类分析法对其进行化学模式识别研究。结果:方法学考察结果表明,本研究建立的苦杏仁苷分析方法有较好的重现性,不同产地苦杏仁中苦杏仁苷的含量存在较大差别。利用系统聚类分析法对其指标成分含量进行聚类,结果表明,23个产地的苦杏仁样品按其质量等级划分为二类,河北和内蒙部分地区的苦杏仁质量较好。结论:该方法可用于苦杏仁药材的质量评价。     

不同走油程度苦杏仁“电子鼻”气味与止咳药效的相关性分析

目的 分析不同走油程度苦杏仁“电子鼻”气味与止咳药效的相关性.方法 运用电子鼻建立苦杏仁气味的数字化检测方法,采用小鼠氨水引咳法对不同走油程度苦杏仁止咳药效进行评价,最后基于SAS分析平台,开展苦杏仁气味的数字化测量值与止咳药效的相关性分析.结果 未走油、轻微走油的炒品、燀品与空白对照组比较,均具有显著地止咳作用;完全走油的炒品具有止咳作用,但完全走油的燀品已不具有止咳作用.电子鼻中传感器S2、S3、S4、S5、S6、S9、S10的响应值和苦杏仁止咳作用之间存在显著相关,传感器S2、S3、S4、S5、S6响应值越大,传感器S9、S10响应值越小,药材的感官气味越重,苦杏仁止咳效果越差.结论 通过气味数字化信息推断苦杏仁止咳作用的变化趋势,气味测量可用于苦杏仁的质量评价.     

中药苦杏仁的资源及其分布

调查了14个省区的苦杏仁原植物和杏属植物资源,发现了杏属植物一新种——志丹杏Arme-niaca zhidanensis。同时,将我国苦杏仁植物资源归纳为7个分布区。     

桃仁的本草考证

对中药的本草考证,是推动经典名方开发与上市的前期工作。查阅现代文献发现,近年对桃仁的研究大多集中在药理成分、药代动力学、医案等方面,鲜有从古籍文献出发对桃仁的基原、炮制、性味归经及功效主治等方面进行研究。经考证发现,桃仁的常用名有"桃仁""桃核仁",产地较广;从品种而言,桃仁的植物来源古今变化不大,清代以前,桃仁的植物来源为山桃或毛桃的种子,近代以来桃或山桃的种子成为主流,不同著作关于桃仁植物来源的拉丁学名有所不同,笔者认为桃Amygdalus persica,山桃A. davidiana拉丁学名较为合理。桃仁行血,宜连皮、尖,生用;桃仁润燥,宜去皮、尖,炒黄。桃核承气汤和桃红四物汤原方中桃仁的炮制方法应当皆为"去皮、尖,炒黄",身痛逐瘀汤中桃仁的炮制方法则应为"连皮、尖,生用"。桃仁主治闭经、瘕邪、小虫、胸痹、咳喘、便秘等多个病证,血虚者、血燥者、孕妇等群体慎用或勿用。现代临床应用仅是对古籍记载的部分继承,提示桃仁还有许多功效可供考证研究,值得进一步深入挖掘以扩大临床应用。古籍关于桃仁的性味归经、品质评定与现代《中华人民共和国药典》内容较一致。因桃仁外观与杏仁相似,尤以粉碎后难以区分,需耗费大量时间和财力予以鉴别,建议医疗机构采购桃仁时尽量采购未经粉碎的桃仁,药房根据临床需求再进行加工炮制。     

杏仁组织中蛋白质实验室提取方法优化

目的:优选杏仁组织中蛋白质的实验室提取方法.方法:采用盐析法、分离蛋白法、反胶束法、碱溶酸沉法、盐碱法提取杏仁组织蛋白,通过凯氏定氮法测定杏仁组织蛋白含量,对比分析蛋白含量和蛋白提取率,应用一维SDS-PAGE电泳对提取蛋白的种类进行测定.结果:盐析法、分离蛋白法、反胶束法、碱溶酸沉法、盐碱法提取的组织蛋白提取率分别为39.41％,25.63％,0.326％,40.02％,41.85％,蛋白质量分数分别为75.667％,44.986％,5.372％,60.056％,51.379％,蛋白粉质量分别为8.6,9.1,0.823,9.8,6.259 g,盐析法提取杏仁组织中蛋白质含量和提取率最高.SDS-PAGE电泳图谱显示碱溶酸沉法、分离蛋白法、反胶束法的电泳条带均为4条,盐析法有5条,盐碱法只有3条,说明盐析法提取的蛋白质种类最多.结论:在实验室条件下采用盐析法从杏仁组织中提取蛋白质效果最佳.     

杏仁和桃仁的电泳鉴别研究

根据杏仁和桃仁可溶性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带的数目和染色深浅可以区别杏仁和桃仁。