LncRNA LINC00525调控miR-338-3p/RUNX2轴对子宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA长基因非蛋白质编码RNA 525(LncRNA LINC00525)调控miR-338-3p/核心结合因子(RUNX2)轴对子宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法:样本选自2018年10月至2020年10月期间石家庄市第四医院的52例子宫颈癌组织和52例癌旁组织，以及子宫颈癌细胞HeLa、C33A、SiHa和人正常子宫颈上皮细胞Ect1/E6E7。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LINC00525、miR-338-3p、RUNX2 mRNA的表达；通过细胞计数试剂8(CCK8)、Transwell、蛋白印迹(Western blot)实验检测HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭、RUNX2蛋白的表达；采用双荧光素酶报告基因、RNA下拉实验验证LINC00525与miR-338-3p、miR-338-3p与RUNX2的关系。结果:(1)与癌旁组织比较，子宫颈癌组织中LINC00525、RUNX2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),miR-338-3p表达水平显著降低(P<0.05);与人正常子宫颈上皮细胞Ect1/E6E7比较，子宫颈癌He...     

顺铂对沉默β-catenin的卵巢癌SKOV3增殖、凋亡的影响

目的:通过沉默Wnt/β-catenin信号转导通路的核心蛋白β-catenin,探讨顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响,为卵巢癌的耐药逆转提供新思路。方法:用包含β-catenin基因特异RNA序列的慢病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞,沉默β-catenin蛋白表达。分组:SKOV3组、SKOV3-neg组(转染空载体)、SKOV3-RNAi组(转染β-catenin-RNAi慢病毒)。Western blot法检测转染前后SKOV3细胞中β-catenin蛋白的表达。12.5μg/ml顺铂作用48h后,用MTT法检测顺铂对各组SKOV3细胞增殖抑制率的影响;流式细胞术检测各组中SKOV3细胞的凋亡率。结果:(1)Western blot结果显示,SKOV3-RNAi组中β-catenin蛋白表达水平显著低于SKOV3-neg和SKOV3组(P<0.05)。(2)相同浓度顺铂作用下,SKOV3-RNAi组的增殖抑制率显著高于SKOV3组及SKOV3-neg组(P<0.05),而后两组的增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。(3)流式细胞术检测结果显示,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(18.8±4.3)%、(1.8±0.3)%、(1.9±0.3)%,SKOV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.008<0.05)。顺铂作用后,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(67.7±2.5)%、(33.3±2.6)%、(32.3±2.1)%;顺铂作用后,各组凋亡率均显著升高(P均<0.05),且SK-OV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.000<0.05)。结论:沉默β-catenin蛋白能有效增强SKOV3对cDDP的敏感性,β-catenin有可能成为逆转卵巢癌化疗耐药的治疗靶点。     

慢病毒介导的EZH2靶向RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:通过慢病毒介导的EZH2-shRNA干扰载体,沉默人卵巢癌SKOV3细胞中果蝇zeste基因的人类同源物(EZH2)的表达,探讨靶基因EZH2对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:设计含EZH2基因序列的shRNA慢病毒干扰载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞株;利用CCK-8比色法检测EZH2基因沉默后对SKOV3细胞增殖的影响;利用RT-PCR、Western blot分别检测EZH2、PCNA mRNA及蛋白的表达情况。结果:EZH2-shRNA载体感染SKOV3细胞后,可显著抑制SKOV3细胞生长(P<0.05),并下调EZH2、PCNA mRNA和蛋白的表达(P均<0.05),而在空白对照组和空载体转染组中,无抑制作用。结论:沉默EZH2基因可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,可能是一种新的基因治疗方法。     

长链非编码RNA PVT1抑制miR-31表达并促进卵巢癌细胞侵袭转移的实验研究

目的:探讨长链非编码RNA PVT1能否抑制卵巢癌细胞侵袭转移,明确其影响可否通过抑制miR-31的方式实现。方法:qRT-PCR法检测长链非编码RNA PVT1及miR-31在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系SKOV3中的表达,同时分别设定正常卵巢组织和卵巢正常上皮细胞系IOSE80作为对照。研究PVT1表达水平与卵巢癌患者临床病理参数的相关性。SKOV3细胞中转染PVT1 siRNA下调PVT1表达,qRT-PCR检测PVT1表达对miR-31表达的影响,Transwell实验检测PVT1表达对SKOV3侵袭转移能力的影响。"反义"实验验证下调miR-31能否逆转PVT1 siRNA对SKOV3侵袭转移能力的抑制效应。荧光素酶报告基因实验检测miR-31与PVT1的靶向结合作用。结果:卵巢癌组织及细胞系中,PVT1表达显著增高,miR-31表达显著降低,两者表达呈明显负相关。PVT1高表达与卵巢癌患者的高临床分期及腹膜后转移密切相关。转染PVT1 siRNA可明显下调SKOV3中PVT1表达,促进miR-31表达,抑制SKOV3细胞的侵袭转移能力;转染miR-31 inhibitor可明显逆转PVT1 siRNA对SKOV3侵袭转移能力的抑制效应;荧光素酶报告基因实验证实miR-31可与PVT1靶向结合。结论:PVT1可通过抑制miR-31的方式促进卵巢癌细胞侵袭转移。     

WWOX基因干扰对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响

目的 研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞中WWOX基因的表达,并探讨WWOX基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系.方法 将设计合成的针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体瞬时转染法将其转染进WWOX基因高表达的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/SB细胞中,用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别测定转染前后SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna及蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测转染前后SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数;应用流式细胞仪检测转染前后SKOV3/SB细胞的生长周期,高效液相色谱仪测定转染前后SKOV3/SB细胞中顺铂的药物浓度.实验分为5组:(1)SKOV3组:接种SKOV3细胞;(2)SKOV3/SB组:接种SKOV3/SB细胞;(3)SKOV3/SB阴性对照转染组:接种转染阴性对照序列的SKOV3/SB细胞;(4)SKOV3/SB脂质体转染组:接种转染脂质体的SKOV3/SB细胞;(5)SKOV3/SB siRNA转染组:接种转染siRNA的SKOV3/SB细胞.结果 转染48 h后,SKOV3、SKOV3/SB、SKOV3/SB阴性对照转染、SKOV3/SB脂质体转染、SKOV3/SB siRNA转染组细胞中WWOX Mrna的表达水平分别为0.647±0.025、2.239±0.030、2.392±0.041、2.379±0.047、1.219±0.032,WWOX蛋白的表达水平分别为1.368±0.028、1.639±0.031、1.580±0.025、1.552±0.034、0.653±0.017,SKOV3/SB siRNA转染组与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).转染siRNA前、后,SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数由5.04降至3.89;细胞周期中G1期由39.2%增至45.6%,S期由50.4%降至37.5%;耐药细胞内顺铂浓度由9.43 ns/L升至23.45 w/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 针对WWOX基因合成的特异性siRNA能明显抑制SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna和蛋白的表达,并能在一定程度上恢复其对顺铂的敏感性,推测WWOX基因可能参与了卵巢癌细胞的顺铂耐药过程.     

单链抗体导向卵巢上皮癌进行靶向基因转移的实验研究

目的 :探讨靶向性基因转移载体—含抗MUC 1单链抗体的慢病毒对MUC 1+卵巢上皮癌细胞系SKOV 3细胞进行基因转移的特异性 ,为卵巢上皮癌的靶向性基因治疗提供实验基础。方法 :将针对SKOV 3细胞上抗原MUC 1的单链抗体基因构建到慢病毒包膜结构质粒 (pM .TC .G) ,以报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因作为目的基因。用磷酸钙沉淀法进行Anti MUC 1(ScFv)慢病毒包装 ,感染共培养的卵巢癌细胞SKOV 3(MUC 1+)和正常人成纤维细胞GF(MUC 1- ) ,荧光显微镜下观察感染效果。竞争抑制实验即病毒感染前加入Anti MUC 1单抗是否抑制病毒感染。结果 :荧光显微镜下观察到Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒对共培养的SKOV 3(MUC 1+)和GF(MUC 1- )细胞的感染有明显差别 ,非Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒对共培养的SKOV 3(MUC 1+)和GF(MUC 1- )的感染未见显著性差别 ,证明Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒可对MUC 1+的卵巢细胞靶向性转染。病毒感染前加入Anti MUC 1单抗则可抑制病毒靶向性感染。此竟争抑制实验表明 ,病毒感染是由其抗体组成部分介导 ,故有抗体靶向性。结论 :Ani MUC 1(ScFv)介导的慢病毒可对MUC - 1+卵巢上皮癌细胞靶向性基因转移。     

survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3生长的抑制作用

目的观察survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用及其对裸鼠皮下种植瘤成瘤能力的影响。方法构建能在真核细胞中稳定表达survivin反义RNA的载体pcDNA3-SVVas,应用基因重组技术,将pcDNA3-SVVas经脂质体lipofectam ine 2000介导转染卵巢癌细胞株SKOV3(SKOV3/SVVas),同时以空载体pcDNA3转染SKOV3细胞(SKOV3/neo)作为对照;绘制细胞生长曲线,采用免疫组化、RT-PCR和流式细胞仪检测SKOV3/SVVas、SKOV3/neo和SKOV3细胞survivin mRNA及蛋白的表达和细胞凋亡率。将24只裸鼠随机分为3组,每组8只,分别将SKOV3/SVVas、SKOV3/neo、SKOV3细胞接种于裸鼠皮下,观察成瘤情况及肿瘤体积变化。结果与SKOV3细胞比较,SKOV3/SVVas细胞增殖能力明显降低;SKOV3/SVVas细胞survivin蛋白阳性细胞率及survivin mRNA表达量分别为(37.5±1.0)%、0.407±0.022,与SKOV3细胞的(81.2±0.4)%、0.793±0.042和SKOV3/neo细胞的(80.4±0.8)%、0.734±0.039比较,差异均有统计学意义(P<0.01);SKOV3/SVVas细胞凋亡率显著增加,为(27.4±9.6)%,与SKOV3和SKOV3/neo细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3/SVVas组裸鼠成瘤率降低,出现目检可见肿瘤的平均时间延长为(14.0±1.0)d,与SKOV3/neo组的(6.1±0.8)d和SKOV3组的(5.8±0.9)d比较,差异有统计学意义(P<0.01);与SKOV3、SKOV3/neo组比较,SKOV3/SVVas组裸鼠肿瘤生长速度缓慢,肿瘤体积的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论稳定表达的survivin反义RNA能够有效抑制SKOV3细胞生长,降低survivin的表达,诱导SKOV3细胞凋亡;转染survivin反义RNA的SKOV3/SVVas细胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低。     

SphK2促进人卵巢癌细胞侵袭转移及其机制探讨

目的:研究鞘氨醇激酶2(SphK2)对人卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨其可能调控机制。方法:设计并体外合成靶向SphK2的shRNA(short hairpin RNA)序列(shRNA SphK2)及阴性对照序列(shRNA NC),并与LV3(H1/GFPPuro)慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒后分别转染SKOV3和HO8910细胞系。分别用Real-time PCR和Western blot法检测shRNA SphK2病毒颗粒转染后在mRNA及蛋白水平的沉默效率。Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力变化;Western blot法检测SphK2敲降后细胞中MMP-9蛋白表达。结果:用构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HO8910细胞后,SphK2 mRNA和蛋白表达水平显著下降。SKOV3和HO8910细胞中,shRNA SphK2转染组的迁移和侵袭细胞数均显著少于shRNA NC组和未转染组,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示,转染后48h,shRNA SphK2转染组中MMP-9蛋白表达明显下降(P0.05)。结论:SphK2可促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭,其分子机制可能与调节MMP-9表达有关,提示SphK2在卵巢癌的发展转移中起着重要的作用。     

RNA干扰技术沉默survivin基因逆转卵巢癌细胞株SKOV3/ADM耐药性的研究

目的检测survivin基因在卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞株SKOV3/ADM及其亲本细胞株SKOV3中的表达水平,探讨以survivin基因为靶向的RNA干扰(RNA i)能否有效沉默survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达,并能否有效逆转SKOV3/ADM细胞对化疗药物的耐药性。方法半定量RT-PCR、免疫荧光法检测survivin mRNA、蛋白在SKOV3/ADM及SKOV3细胞中的表达。以survivin基因为靶向的重组质粒pshRNA-survivin及紫杉醇作用于SKOV3/ADM细胞,将SKOV3/ADM细胞分为4组,即对照组、RNA i组、紫杉醇组、RNA i+紫杉醇组,RT-PCR技术检测各组细胞的survivinmRNA表达水平,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法及末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)检测各组细胞的凋亡情况。结果survivin mRNA在SKOV3/ADM、SKOV3细胞中的表达水平分别为99.1%、75.3%,SKOV3/ADM、SKOV3细胞的荧光细胞数分别为(59±5)、(42±3)个,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。RNA i后SKOV3/ADM细胞中mRNA的表达水平由99.1%降低至7.9%。AO/EB荧光染色法、TUNEL法检测各组细胞凋亡数,紫杉醇组为(10.2±1.0)、(9.8±0.8)个,RNA i组为(48.5±4.9)、(49.5±4.3)个,RNA i+紫杉醇组为(71.5±6.8)、(68.3±5.7)个,RNA i+紫杉醇组与RNA i组比较,差异有统计学意义(P<0.05),RNA i+紫杉醇组与紫杉醇组比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达显著高于SKOV3细胞。以survivin基因为靶向的RNA i可有效抑制SKOV3/ADM细胞中survivin基因的表达,有效增加了SKOV3/ADM细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性,显著上调了SKOV3/ADM细胞的凋亡活性。     

慢病毒介导短发夹状RNA沉默生存素基因对人异位内膜细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究慢病毒介导生存素(survivin)基因特异性短发夹状RNA(shR-NA)对人异位内膜细胞中survivin基因表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向survivin基因的shRNA慢病毒表达载体,将重组慢病毒感染原代培养的异位内膜细胞,以未转染及空载慢病毒感染异位内膜细胞为对照。采用RT-PCR、Western blot法分别检测各组异位内膜细胞中survivin mRNA和蛋白表达的变化,用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的增殖,Cy5-Annexin V/PI双染标记流式细胞仪测定细胞凋亡。结果:与未转染细胞及空载慢病毒转染细胞相比,shRNA慢病毒感染人异位内膜细胞后survivin mRNA及蛋白表达水平明显下降,survivin mRNA及蛋白表达抑制率分别为64%和59%。转染后1～5天实验组细胞生长速度较阴性对照组及空白对照组明显减慢,除第1天外,差异均有统计学意义(P0.01);阴性对照组及空白对照组细胞生长速度的差异无统计学意义(P0.05)。流式细胞仪分析显示,实验组细胞凋亡率为(41.61±3.64)%,明显高于阴性对照组的(9.14±1.88)%和空白对照组的(7.07±1.16)%(P0.01),后两组的差异无统计学意义(P0.05)。结论:慢病毒介导survivin基因特异性shRNA可有效沉默异位内膜细胞中survivin基因表达,明显抑制异位内膜细胞的增殖并促进细胞凋亡。     

PRMT5对卵巢癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响

目的:研究精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)对卵巢癌A2780及SKOV3细胞增殖及侵袭转移能力的影响,探讨其可能机制。方法:设计并体外合成靶向PRMT5的siRNA序列(si P)及阴性对照序列(si C),分别转染卵巢癌细胞A2780、SKOV3。Brd U掺入实验检测细胞增殖能力;Transwell小室技术检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot法检测PRMT5降调后E-cadherin蛋白表达变化。结果:转染si P后,卵巢癌细胞中PRMT5表达明显降低。A2780细胞中,si P组的Brd U阳性率明显低于si C组[(11.7±1.5)%vs(33.3±1.5)%,P0.001];SKOV3细胞中,si P组的Brd U阳性率明显低于si C组[(18.0±2.0)%vs(35.3±1.5)%,P0.001]。A2780和SKOV3细胞中,si P组的迁移和侵袭细胞数均显著少于si C组和N组,差异均有统计学意义(P0.001)。Western blot法显示,转染后72h,si P组中E-cadherin蛋白表达明显上调。结论:PRMT5参与了卵巢癌细胞的生长增殖和迁移侵袭的过程,干扰其表达能显著减慢细胞的增殖,减弱其迁移和侵袭能力。PRMT5可能通过调控E-cadherin表达参与卵巢癌细胞的迁移和侵袭过程。     

内皮祖细胞对卵巢癌细胞SKOV3生物学功能的影响

目的:通过在卵巢癌细胞SKOV3中使用血管内皮生长因子(VEGF)抗体贝伐单抗,了解脐血内皮祖细胞(EPCs)对卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移、黏附和凋亡能力的影响。方法:在成功建立EPCs和卵巢癌细胞SKOV3体外培育模型后,将实验分为SKOV3单独培养组(SKOV3组),SKOV3+EPCs共培养组(SKOV3+EPCs组),SKOV3+100μg/ml的贝伐单抗共培养组(SKOV3+贝伐单抗组)和SKOV3+EPCs+100μg/ml的贝伐单抗共培养组(SKOV3+EPCs+贝伐单抗组),并比较4组SKOV3的增殖、凋亡、迁移和黏附能力的变化。结果:①SKOV3+EPCs组SKOV3的增殖能力、穿膜细胞数和OD值高于SKOV3组(P0.05,P0.01);②SKOV3+贝伐单抗组SKOV3的增殖能力、穿膜细胞数、凋亡率低于SKOV3组(P0.05,P0.01):③SK—OV3+EPCs+贝伐单抗组SKOV3的增殖活性、穿膜细胞数、凋亡率低于SKOV3+EPCs组(P0.05,P0.01),而OD值显著高于SKOV3+EPCs组(P0.01)。结论:共培养条件下EPCs能促进SKOV3生物学功能,贝伐单抗则相反,EPCs能协同贝伐单抗抑制SKOV3的生物学功能。     

靶向沉默Gata3对妊娠期哮喘小鼠树突状细胞表型及效应T细胞失衡表达的影响

目的:研究慢病毒介导siRNA靶向沉默Gata3基因表达对妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)抗原递呈及其免疫生物学特性的影响。方法:以脂质体DNA沉淀法将重组慢病毒干扰质粒与包装质粒共转染AD293细胞,包装生成慢病毒感染体外诱导DC,RT-PCR、Western blot分析其对siGata3基因的整合转录效果;流式细胞术观察细胞表型变化。通过尾静脉注射将pSH1/siGata3转移至小鼠体内,ELISA法测定其肺泡灌洗液(BALF)中的炎性因子含量;MTT法验证混合淋巴细胞反应(MLR)后T细胞增殖能力。结果:经重组、包装携有Gata3特异siRNA慢病毒感染DC成功,其siRNA靶点Gata3 mRNA及蛋白的转录表达分别下调87.30%和81.33%(P0.05);同时降低DCs膜表面CD86荧光强度(P0.05)。减少pSH1/siGata3组小鼠BALF中IL-5、IL-17分泌而提升IL-12水平(P0.05);MLR证实,共培养感染DC激活T细胞的能力明显不足(P0.05)。结论:siRNA干扰可有效抑制模型小鼠免疫微环境特定Gata3通路,阻遏T细胞及其亚群分化由此来诱导DC免疫耐受,为妊娠期哮喘防治奠定基础并提供新的思路和手段。     

带hTERT启动子的腺病毒干扰ERCC1基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究带hTERT启动子的腺病毒通过干扰ERCC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药的作用。方法:以1、10、50、80感染复数(MOI)的重组腺病毒分别感染卵巢癌细胞株SKOV3、卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3/DDP和脐静脉内皮细胞ECV304,同时以相同滴度的空载体腺病毒感染细胞,将感染前的细胞作为对照,以RT-PCR方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1 mRNA表达,以Western blot方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1蛋白表达,并以MTT法检测肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性的影响。结果:(1)在SKOV3及SKOV3/DDP细胞中,不同剂量Ad-hTERT-ERCC1 shRNA转染组与转染前相比,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.01)。而在空载体腺病毒转染组及ECV304细胞中,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平无改变,差异无统计学意义(P>0.05);(2)重组腺病毒转染后,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。结论:带hTERT启动子的腺病毒能够通过干扰ER-CC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药,并且具有剂量依赖性。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

长链非编码RNA在子痫前期胎盘中的差异表达研究

目的:研究子痫前期(PE)胎盘长链非编码RNA(LncRNAs)的差异表达情况。方法:选取妊娠20周以后诊断为子痫前期的孕妇作为研究组(n=20),同期足月(≥37周)采用剖宫产终止妊娠的孕妇作为对照组(n=24)。采用基因芯片技术分析两组胎盘的LncRNAs的差异表达情况,通过q-PCR技术对筛选的LncRNAs进行验证。结果:与正常对照组相比,PE组胎盘差异表达的LncRNAs共174条,其中107条LncRNAs表达上调,67条LncRNAs表达下调。q-PCR验证结果显示,LncRNAs(ENST00000593000和NR002161)在PE胎盘组织中的表达显著高于正常妊娠胎盘组织(P0.05),ENST00000593000升高3.24倍,NR002161升高2.67倍,且均定位于Y染色体。女婴胎盘组织中均不表达ENST00000593000和NR002161。结论:PE组胎盘LncRNAs表达存在显著改变,Y染色体上LncRNAs的改变是男婴PE发生可能危险因素。     

CTHRC1在卵巢癌中促进巨噬细胞招募的研究

目的:探讨胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)在卵巢癌巨噬细胞招募中的作用及其相关机制。方法:用佛波酯(PMA)诱导人单核细胞(THP-1)分化为巨噬细胞。构建以CTHRC1为靶标的sh RNA,lenti慢病毒转染卵巢癌SKOV3细胞,下调细胞中CTHRC1表达。Western blot法检测SKOV3细胞中CTHRC1蛋白表达。将SKOV3细胞培养上清、重组人CTHRC1蛋白(rCTHRC1)分别与巨噬细胞共培养,Western blot法检测巨噬细胞中趋化因子受体CX3CR1表达,Transwell实验检测巨噬细胞体外迁移能力。结果:lenti-shCTHRC1转染SKOV3细胞可显著抑制细胞中CTHRC1表达(P0.05)。与未转染组相比,转染组SKOV3-shCTHRC1细胞上清招募巨噬细胞的能力明显降低(P0.05);SKOV3-shCTHRC1细胞上清中添加rCTHRC1,可显著增强其招募迁移巨噬细胞的能力。经rCTHRC1处理后,巨噬细胞体外迁移能力明显增强且呈浓度依赖性(P0.05),并促进巨噬细胞中趋化因子受体CX3CR1表达明显上升(P0.05)。结论:外泌蛋白CTHRC1促进巨噬细胞的招募和迁移,这可能与其上调巨噬细胞中趋化因子受体CX3CR1表达有关,为CTHRC1可能成为卵巢癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。     

microRNA-142-3p对TET2基因的调控及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响

目的:研究miR-142-3p慢病毒载体对TET2的调控作用及其对SKOV3细胞增殖作用的影响。方法:构建pSicoR-miR-142-3p及pMIR-Report-TET2过表达载体,包装重组慢病毒,应用实时荧光定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因系统检测方法验证miR-142-3p与TET2的靶向作用关系,应用MTT法检测miR-142-3p慢病毒颗粒对SKOV3细胞增殖的影响。结果:成功构建了pSicoR-miR-142-3p和pMIR-Report-TET2重组质粒,以及可携带miR-142-3p的慢病毒颗粒。miR-142-3p过表达明显抑制TET2蛋白及mRNA表达水平(P0.05);抑制miR-142-3p表达则明显上调TET2蛋白及mRNA表达水平(P0.05);MTT试验证实,miR-142-3p可显著抑制SKOV3细胞增殖。结论:过表达miR-142-3p可有效抑制SKOV3细胞中TET2 mRNA和蛋白水平表达,并抑制SKOV3细胞增殖。     

X染色体相关凋亡抑制蛋白的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生长的影响

目的 探讨X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系SKOV3细胞生长的影响.方法 设计和合成长度为64 nt的脱氧寡核苷酸链,克隆至pSUPER质粒,转化大肠埃希菌DH5α菌株,构建重组质粒pSUPER-siXIAP,对其进行双酶切和DNA序列分析鉴定.间接免疫荧光染色法鉴定SKOV3细胞XIAP蛋白的表达.实验分为4组:分别用重组质粒pSUPER-siXIAP(pSUPER-siXIAP组)及阴性无关序列重组对照质粒pSUPER-nsRNA(pSUPER-nsRNA组)及空载体质粒pSUPER(pSUPER组)转染SKOV3细胞,以未转染质粒的SKOV3细胞为空白对照组.RT-PCR技术检测各组细胞XIAP mRNA的表达,蛋白印迹法检测各组细胞XIAP蛋白的表达,流式细胞仪分析各组细胞细胞周期的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞生长的变化.结果 本实验成功构建了XIAP特异性的RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒.间接免疫荧光染色法检测证实SKOV3细胞中存在XIAP蛋白的过度表达.转染后72 h,SKOV3细胞XIAP蛋白表达水平降低,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组的相对密度值分别为3584±124、2138±65、1973±80和110±12,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0334);转染后72 h,SKOV3细胞XIAP mRNA表达水平明显下降,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组各组的相对密度值分别为6674±274、4532±107、2322 ±57和1864±78,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0127).流式细胞仪检测结果显示,pSUPER-siXIAP组G1期细胞较空白对照组、pSUPER组明显增加(P＜0.05);pSUPER-siXIAP组S期细胞较空白对照组、pSUPER组明显减少(P＜0.05).MTT比色法检测结果显示,pSUPER-siXIAP组细胞生长增殖被抑制,生长速度较空白对照组细胞明显减慢(P=0.0237);pSUPER-nsRNA组和pSUPER组细胞生长速度较空白对照组细胞也明显减慢(P=0.0441,P=0.0472).结论 本研究成功构建了XIAP RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒,将其转染SKOV3细胞后可有效降低其XIAP mRNA及蛋白的表达水平,并将SKOV3细胞阻滞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为卵巢癌基因治疗提供一个新的有希望的分子靶点.     

AD-hTERT-3E-EGFP-IRES-ELA构建及其对卵巢癌细胞体外抑制作用的研究

目的:构建溶瘤腺病毒载体系统AD-h TERT-3E-EGFP-IRES-ELA,观察ADh TERT-3E-EGFP-IRES-ELA在卵巢癌SKOV3细胞中的表达及对SKOV3细胞的体外杀伤、抑制迁移的作用。方法:利用基因重组技术构建腺病毒AD-h TERT-3E-EGFP-IRESELA。使用OLYMPUS共聚焦显微镜系统,观察EGFP在SKOV3细胞中的表达情况。通过MTS、流式细胞仪检测AD-h TERT-3E-EGFP-IRES-ELA对SKOV3细胞的杀伤效果及作用方式。通过划痕实验、Transwell检测重组病毒对SKOV3细胞体外迁移的作用。结果:成功构建AD-h TERT-3E-EGFP-IRES-ELA。AD-h TERT-3E-EGFP-IRES-ELA在卵巢癌细胞(SKOV3)中可表达EGFP,其荧光强度随时间增加而增强。AD-h TERT-3E-EGFP-IRESELA对卵巢癌细胞具有杀伤效果(P0.05)及抑制细胞迁移的特性(P0.05),主要作用是导致SKOV3细胞出现早期凋亡。结论:成功构建了一种新型的肿瘤特异的溶瘤腺病毒载体系统AD-h TERT-3E-EGFP-IRES-ELA,其在体外对卵巢癌细胞具有杀伤及抑制肿瘤迁移的作用。