TLR2在胶质瘤细胞GL261的高表达及其激活后增强迁移的作用

目的探讨小鼠胶质瘤细胞系GL261主要高表达的Toll样受体（TLRs）家族成员及其在GL261细胞迁移中的作用。方法运用实时荧光定量PCR检测TLRs在GL261细胞的表达情况;GL261细胞经TLR2配体Pam3CSK4刺激后,应用Transwell迁移实验检测其对迁移能力的影响;慢病毒稳定干扰TLR2表达后,观察Pam3CSK4刺激对GL261细胞迁移能力的改变。结果GL261细胞主要高表达TLRs家族中的TLR2;Pam3CSK4激活TLR2后显著增强GL261细胞迁移能力;沉默TLR2基因表达后,Pam3CSK4促进GL261细胞迁移能力的作用消失。结论小鼠GL261胶质瘤细胞TLRs家族中主要高表达TLR2,其激活具有促进GL261细胞迁移的作用,下调TLR2可抑制该细胞的迁移。     

杨梅黄酮对小鼠脑胶质瘤GL261细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察杨梅黄酮对小鼠脑胶质瘤GL261细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,为杨梅黄酮应用于胶质瘤的治疗提供理论依据。方法：体外培养小鼠脑胶质瘤GL261细胞,实验分为对照组和不同浓度杨梅黄酮组,应用CCK-8法检测细胞的存活率,流式细胞术检测各组GL261细胞的细胞周期,Hoechst 33342染色及流式细胞术检测各组GL261细胞的细胞凋亡情况,应用Transwell小室检测各组GL261细胞迁移数目和进入小室下部的细胞数量,应用RT-PCR法检测杨梅黄酮处理前后GL261细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）mRNA的表达水平。结果：CCK8法检测,与对照组比较,20 μmol·L^-1杨梅黄酮组细胞存活率明显下降（P<0.01）。细胞周期检测,与对照组比较,40 μmol·L^-1杨梅黄酮处理组GL261细胞G₁期比例升高（P<0.05）,S期比例降低（P<0.05）。Hoechst 33342染色,杨梅黄酮组GL261细胞出现凋亡小体。流式细胞术AnnexinⅤ/PI荧光双染检测,与对照组比较,杨梅黄酮组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均增加（P<0.05）。Transwell小室迁移和侵袭实验,与对照组比较,5、10和20 μmol·L^-1杨梅黄酮组发生迁移的细胞数目明显减少（P<0.05）。Transwell小室检测,与对照组比较,杨梅黄酮组进入下室的细胞数目明显减少（P<0.05）,且随着杨梅黄酮浓度的增加,穿过Matrigel的细胞数目逐渐减少。与对照组比较,5和10 μmol·L^-1杨梅黄酮组GL261细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平均降低（P<0.05）。结论：杨梅黄酮可抑制胶质瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,并抑制其迁移及侵袭。     

重组Klotho蛋白对骨髓来源M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转变的影响

目的:探究重组Klotho蛋白对小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞表型转变的影响.方法:分离并鉴定小鼠骨髓来源性巨噬细胞,用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)转变为巨噬细胞M0,流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定细胞,普通光镜观察M0细胞形态.将成熟骨髓来源巨噬细胞细胞M0分成LPS组、LPS+Klotho组和空白组.LPS组用 100ng/mL LPS处理,LPS+Klotho组给与 1 μg/mL Klotho和 100ng/mL LPS+LPS共同处理.RT-qPCR检测巨噬细胞极化相关分子:M1亚型巨噬细胞相关标志物(IL-1β、IL-6、iNOS)mRNA和M2亚型巨噬细胞相关标记物(Arg-1、IL-10)mRNA表达.Western blotting检测iNOS、Arg-1蛋白表达水平,细胞免疫荧光检测细胞肿瘤坏死因子(TNF-a)和Arg-1蛋白含量.结果:流式细胞术显示骨髓巨噬细胞纯度为98.4％,光镜和细胞免疫荧光显示骨髓巨噬细胞呈现不规则形态.与空白组相比,LPS组IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA和iNOS、TNF-a蛋白相对表达量明显提高(P＜0.001).而与LPS组相比,LPS+Klotho组降低Ml亚型巨噬细胞标记物IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA和iNOS、TNF-α蛋白相对表达量(P＜0.001),显著提高了M2型巨噬细胞标志物Arg-1、IL-10 mRNA和Arg-1的蛋白的表达(P＜0.001).结论:重组Klotho蛋白可促进骨髓来源性巨噬细胞由Ml表型向M2表型转变.     

热疗对巨噬细胞M2极化作用及其对肺癌细胞侵袭、迁移影响的体外实验研究

背景　热疗是一种安全的辅助治疗方法,通过抑制肿瘤细胞DNA修复、促进其凋亡、提高机体免疫等作用阻碍其发生、发展。但是,对于热疗是否可以通过干预巨噬细胞间接影响肿瘤细胞的研究并不多。目的　通过体外模拟热疗产生的温热作用,探讨在热疗条件下M2型肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞（LLC）的调控作用。方法　本研究于2019年6-12月实施。10 000 ng/L的干扰素γ（INF-γ）和100 000 ng/L的脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞48 h成为M1型巨噬细胞,20 000 ng/L 白介素（IL）-4诱导RAW264.7细胞48 h成为M2型巨噬细胞;通过流式细胞术和ELISA法分别检测M1、M2巨噬细胞表面标志抗原CD86、CD206的表达率和细胞因子IL-10、IL-12的分泌水平;采用CCK-8法检测不同热疗温度（41 ℃、42 ℃、43 ℃）干预对M2型巨噬细胞在24 h、48 h和72 h的增殖活性作用;采用实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测M0、M2型巨噬细胞及热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、Ym-1 mRNA相对表达水平;Western blotting法检测M2型巨噬细胞及热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、Ym-1蛋白相对表达水平;Transwell法检测LLC+M2、LLC+M2+热疗（42 ℃）中LLC的侵袭、迁移能力。结果　IFN-γ和LPS可诱导RAW264.7细胞向M1型极化,IL-4可诱导RAW264.7细胞向M2型转化。流式细胞术检测结果显示,M2型巨噬细胞CD86、CD206的表达率高于M0型巨噬细胞和M1型巨噬细胞（P<0.001）。ELISA法检测结果显示,M2型巨噬细胞IL-10的分泌水平较M0、M1型巨噬细胞高（P<0.001）;M1型巨噬细胞IL-12分泌水平较M0、M2型巨噬细胞高（P<0.001）。CCK-8法检测结果显示,42 ℃时热疗抑制巨噬细胞的能力高于41 ℃及43 ℃时（P<0.001）。RT-PCR检测结果显示,与M0型巨噬细胞相比,M2型巨噬细胞的Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相对表达水平升高（P<0.001）。热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞的Ym-1、Arg-1 mRNA和蛋白相对表达水平降低（P<0.001）。Transwell法检测结果显示,M2型巨噬细胞与LLC共培养后LLC侵袭、迁移数量增加（P<0.001）;热疗（42 ℃）后LLC侵袭、迁移数量减少（P<0.001）。结论　热疗可能通过下调M2型巨噬细胞的Arg-1、Ym-1 mRNA的表达水平从而抑制LLC的侵袭与迁移能力。     

siRNA干扰整合素β4的表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响

目的采用RNA干扰（Small interference RNA,siRNA）技术抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中整合素β4（integrinβ4）基因表达,观察其对细胞侵袭和迁移能力的影响。方法选用MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象,应用siRNA技术沉默癌细胞Integrinβ4 mRNA的表达,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测未转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称空白对照组）及转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称Integrinβ4 RNA干扰组）的Integrinβ4 mRNA和蛋白表达水平;Transwell实验检测两组细胞的侵袭及迁移能力。结果与空白对照组相比,Integrinβ4 RNA干扰组Integrinβ4的mRNA及蛋白表达水平分别降低了86%（P〈0.01）和89%（P〈0.01）,细胞侵袭和迁移能力下降（P〈0.05）。结论应用siRNA干扰技术抑制Integrinβ4表达可使MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力降低,提示Integrinβ4在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。     

利拉鲁肽极化M2型巨噬细胞改善非酒精性脂肪肝的机制

目的：探讨利拉鲁肽改善2型糖尿病伴随的非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用机制。方法：小鼠随机分为正常组、模型组和利拉鲁肽组3组,每组15只。模型组和利拉鲁肽组采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素的方法,构建2型糖尿病NAFLD的小鼠模型,利拉鲁肽组皮下注射利拉鲁肽（100 μg/kg）,每日1次,连续4周。检测各组小鼠的体质量、肝指数、ALT、AST和TG指标;HE染色及油红O染色观察肝组织病理改变;ELISA法检测血清中IL-4和IL-10的含量;流式细胞术检测M2型巨噬细胞比例;RT-PCR检测IL-4、IL-10、CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1 mRNA表达。结果：与模型组比,利拉鲁肽组小鼠体质量、肝指数、TG、AST和ALT均明显下降,肝组织中脂肪变性减轻,M2型巨噬细胞比例显著上升（P＜0.001）,IL-4、IL-10蛋白表达显著上升（P＜0.05）,IL-4、IL-10、CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1 mRNA表达也显著上升（P＜0.01）。结论：利拉鲁肽对2型糖尿病NAFLD具有保护作用,其机制可能与促进IL-4和IL-10的表达,极化M2型巨噬细胞有关。     

siRNA沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响*

目的 探讨沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNFAIP2）表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响。方法 使用Lipofectamine 2000介导siRNA转染胶质瘤细胞U87和U251下调TNFAIP2 mRNA的表达;运用细胞划痕及Transwell实验检测沉默TNFAIP2表达对U87及U251细胞迁移、侵袭的影响;通过CCK-8实验检测沉默TNFAIP2表达对胶质瘤细胞U87及U251增殖的影响。结果 Lipofectamine 2000介导si-TNFAIP2转染U87及U251细胞可下调TNFAIP2 mRNA的表达;沉默TNFAIP2表达可降低胶质瘤细胞U87和U251迁移侵袭的能力;沉默TNFAIP2表达可抑制U87及U251细胞的增殖。结论 siRNA沉默TNFAIP2表达可抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖。     

靶向SDF-1通过调控肿瘤相关巨噬细胞亚型增强结直肠癌化疗敏感性的作用

探究靶向基质细胞衍生因子-1（SDF-1）调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）亚型转化增强结直肠癌（CRC）化疗敏感性的作用。方法 使用PMA和IL-4体外诱导THP-1细胞为TAMs细胞,流式细胞仪检测M1/M2型特异表面标志物CD86和CD206表达;使用5 μg/mL SDF-1抑制剂AMD3100处理TAMs细胞24 h,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测SDF-1表达,qRT-PCR检测iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表达;建立人结直肠癌细胞LoVo和TAMs细胞共培养体系,并使用不同浓度0、0.5、5、50、500 μmol/L奥沙利铂处理LoVo细胞,具体分组包括空白对照组、奥沙利铂组、TAMs+奥沙利铂组、AMD3100+TAMs+奥沙利铂组,CCK-8法检测LoVo细胞存活率;构建动物结直肠癌移植瘤模型,待肿瘤长出后选择肿瘤大小为100 mm3的12只裸鼠,按随机数字表法分为对照组、奥沙利铂组、AMD3100+奥沙利铂组,每组4只,奥沙利铂组腹腔注射8 mg/kg奥沙利铂,AMD3100+奥沙利铂组腹腔注射5 mg/kg SDF-1抑制剂AMD3100和8 mg/kg奥沙利铂,对照组注射等体积生理盐水,每日一次,持续18 d,首次给药后的第0、3、6、9、12、15、18 d测量裸鼠肿瘤体积,18 d解剖取肿瘤组织并称重,制备肿瘤组织单细胞悬液,流式细胞仪分选M1/M2型巨噬细胞,免疫组织化学染色检测iNOS和Arg-1表达。结果 体外成功诱导获得TAMs细胞,经过SDF-1抑制剂AMD3100处理后,TAMs细胞中SDF-1在mRNA和蛋白上的表达水平均下调,iNOS、TNF-α的mRNA相对表达量升高,TGF-β、Arg-1的 mRNA相对表达量降低（P＜0.01）;0.5、5、50、500 μmol/L奥沙利铂处理后LoVo细胞存活率下降,与TAMs共培养再经过奥沙利铂处理后LoVo细胞存活率升高,而与SDF-1抑制剂AMD3100处理的TAMs共培养再经过奥沙利铂处理后LoVo细胞存活率则下降（P＜0.01）;经过奥沙利铂处理的移植瘤裸鼠肿瘤组织生长减缓,肿瘤重量减小,经过SDF-1抑制剂AMD3100和奥沙利铂联合处理的移植瘤裸鼠肿瘤组织生长进一步减缓,肿瘤重量减小,同时,肿瘤组织中F4/80+CD11c+表达增加,iNOS表达增加,F4/80+CD206+表达减少,Arg-1表达也减少。结论 通过SDF-1抑制剂AMD3100靶向SDF-1可在体外、体内增强结直肠癌的化疗敏感性,其作用机制可能与调控肿瘤相关巨噬细胞M1/M2亚型转化相关     

siRNA沉默CAPN1基因对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、侵袭及Bcl-2和Bax表达的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）沉默钙蛋白酶1（CAPN1）基因对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、侵袭及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达的影响。方法将siRNA序列、CAPN1siRNA序列分别转染MG-63细胞,分为CAPN1siRNA组与siRNA组,以未转染的细胞作为对照组。采用qRT-PCR法检测细胞中CAPN1mRNA表达水平;采用四唑盐比色法检测细胞增殖率;采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭率;采用Westernblot法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果CAPN1siRNA组细胞CAPN1mRNA表达水平、在培养12、24、36和48h的增殖率、侵袭率、Bcl-2蛋白表达水平均低于对照组和siRNA组,而Bax蛋白表达水平高于对照组和siRNA组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;对照组和siRNA组细胞上述指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论siRNA沉默CAPN1表达抑制了MG-63细胞增殖和侵袭能力,并促进其凋亡,其机制可能与调控Bcl-2和Bax蛋白表达有关。     

siRNA沉默TRIM65基因对脑胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡及STAT3信号通路的影响

目的探讨siRNA沉默三结构域蛋白65（TRIM65）基因对脑胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡及STAT3信号通路的影响。方法采用qRT-PCR、Western Blot检测TRIM65在正常脑胶质细胞HEB及胶质瘤细胞株U251、TJ861、A172中的表达;转染siRNA NC、siRNA TRIM65,STAT3信号通路激活剂SD19处理胶质瘤细胞株U251,采用MTT法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果与正常脑胶质细胞HEB比较,胶质瘤细胞株U251、TJ861、A172中TRIM65的mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.05）。与siRNA NC组比较,siRNA TRIM65组U251细胞24、48、72 h增殖抑制率、凋亡率显著升高（P<0.05）,侵袭和迁移数目显著降低（P<0.05）;U251细胞中TRIM65、cyclin D1、MMP-2、p-Jak2、p-STAT3蛋白水平显著降低（P<0.05）,Caspase-3蛋白水平显著升高（P<0.05）。与siRNA TRIM65组比较,siRNA TRIM65+SD19组U251细胞中p-Jak2、p-STAT3蛋白水平显著升高（P<0.05）。结论 siRNA沉默TRIM65基因表达可降低脑胶质瘤细胞增殖率、侵袭和迁移能力,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与调控STAT3信号通路有关     

巨噬细胞移动抑制因子介导MPP+/MPTP诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）/κb（NF-κB）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）/1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）激活小胶质细胞NLRP3炎症小体的影响和机制,进而对神经元的影响。方法 慢病毒MIF-shRNA感染Bv-2细 胞,敲低MIF表达。Western blot检测MPP+干预的Bv-2 NLRP3和MIF表达水平、转染病毒后细胞NLRP3、p65、caspase-1表达水平及细胞核、浆蛋白p65表达水平。ELISA检测细胞培养上清液IL-1β、IL-18表达水平。将细胞培养上清液作为条件培养基培养MN9D细胞,Western blot检测TH蛋白表达水平。C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型,向中脑黑质致密部立体定位注射腺相关病毒MIF-shRNA（AAV-MIF-shRNA）敲低MIF表达。对小鼠进行旷场实验、爬杆实验、悬挂实验行为学评估,组织免疫组化检测小鼠多巴胺能神经元细胞数目和小胶质细胞活化情况,Western blot 检测小鼠黑质 MIF、NLRP3及TH表达情况。结果 感染病毒的细胞MIF mRNA（P<0.001）和MIF蛋白（P=0.014）明显降低。Western blot显示,0.2 mmol MPP+使Bv-2细胞NLRP3（P=0.012）和MIF（P=0.019）表达增高。与MPP组比较,MIF-shRNA组NLRP3（P=0.042） 和caspase-1（P=0.003）表达减少,细胞总蛋白中p65表达没有差异（P=0.978）。ELISA检测细胞上清液发现MIF-shRNA组较MPP组IL-1β（P<0.001）、IL-18（P=0.002）水平降低。与MPP组比较,MIF-shRNA组核蛋白p65表达降低（P=0.016）,浆蛋白p65表达升高（P<0.001）。相较于MPP+的条件培养基,MN9D细胞在MIF-shRNA条件培养基中TH（P=0.01）表达增加。与MPTP 组比较,注射 MIF-shRNA 的小鼠爬杆实验（P=0.024）和旷场实验（P=0.026）评分显著降低,悬挂实验评分显著升高（P=0.001）。组织免疫组化结果显示,相较于MPTP组,AAV-MIF-shRNA组小鼠TH阳性神经元细胞数量增多（P=0.004）,小胶质细胞数量减少（P=0.049）。MIF（P=0.033）、NLRP3表达减少（P=0.045）,TH蛋白明显增多（P=0.043）。结论 抑制MIF表达可以减少MPP+/MPTP干预所引起的小胶质细胞NLRP3炎症小体表达和炎症因子释放,减轻小胶质细胞激活,减轻炎症反应,改善MPTP引起的黑质多巴胺能神经元损伤,在帕金森病神经炎症方面具有保护作用。     

雌二醇通过上调IRE1α-XBP1信号轴抑制小鼠腹腔巨噬细胞的分化

目的 研究雌二醇其通过内质网应激通路影响巨噬细胞免疫特性的可能机制。方法 提取C57小鼠腹腔巨噬细胞,IFN-γ60 ng/mL作用下体外培养巨噬细胞,分组检测雌激素对巨噬细胞影响：实验组为雌二醇（1.0 nmol/L）处理;抑制剂组为雌二醇（1.0 nmol/L）和雌激素受体拮抗剂（Acolbifene, 4 nmol/L）同时作用;对照组加等量PBS处理,培养48 h后通过Western blot法检测比较巨噬细胞极化蛋白MHC-II、iNOS和内质网应激标志性蛋白IRE1α、eIF2α和ATF6的表达水平,通过RT-PCR法检测巨噬细胞TGF-β、IL-6、IL-10、TNFα mRNA水平变化。随后分组检测内质网应激对巨噬细胞的影响：雌激素处理组;雌激素和内质网IRE1α信号抑制剂（4 μ 8 C,50 μmol/L）处理组;IRE1α激动剂组（TG,0.2 nmol/L）处理组;对照组加等量PBS处理,随后检测巨噬细胞的分化情况。结果 和对照组比较,雌激素处理后巨噬细胞M1相关蛋白MHC-II （P=0.021）和iNOS（P<0.001）表达显著降低,促炎细胞因子TNF-α（P=0.003）和IL-6 mRNA（P=0.004）表达下调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P=0.002）和IL-10（P=0.008）mRNA表达上升,同时发现内质网相关的IRE1α（P<0.001）蛋白活化水平升高,其下游转录因子XBP-1（P<0.001）表达上调,加入雌激素受体阻断剂能够改变这种变化。和单纯雌激素处理组比较,在培养基中加入雌激素的同时加入IRE1α抑制剂4 μ 8 C会导致巨噬细胞 M1 相关蛋白 MHC-II（P=0.002）和 iNOS（P=0.003）表达显著上调,促炎细胞因子 TNF-α（P=0.003）和 IL-6mRNA（P=0.024）表达上调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P<0.001）和IL-10（P<0.001）mRNA表达下调,而激动IRE1α通路会矫正这种变化。结论 雌激素能够通过上调IRE1α-XBP-1信号轴抑制巨噬细胞促炎表型的分化,从而对炎症反应发挥抑制作用。     

P2X7受体通过激活AKT信号通路促进小鼠Lewis肺癌细胞的迁移和侵袭

目的 探究P2X7受体(P2X7R)对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞迁移和侵袭能力的影响及其作用机制,同时探究体内P2X7R对荷LLC小鼠成瘤能力的影响。方法 体外实验：RT-PCR检测LLC细胞P2X7R表达。将LLC细胞分别给予P2X7R激动剂三磷酸腺苷(ATP)、2’-3’-O-(4-苯甲酰-苯甲酰)ATP(BzATP)干预或预先给予P2X7R拮抗剂oxATP、A438079然后再给予激动剂干预,共分为7组。使用细胞划痕实验和Transwell实验检测LLC细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测蛋白激酶B(AKT)信号通路关键蛋白的活化水平。将LLC细胞给予BzATP、A438079、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路抑制剂LY294002干预,共分为5组。利用Transwell实验检测LLC细胞的迁移和侵袭能力。体内实验：构建荷LLC细胞的皮下移植瘤的野生(WT)型和P2X7R基因敲除(P2X7^-/-)型小鼠模型,比较两组肿瘤的体积及质量。结果 LLC细胞中表达P2X7R。划痕实验和Transwell实验结果显示：与对照组相比,激动...     

P2X7受体在类风湿关节炎中的诊断价值及炎症反应中的作用

目的研究P2X7受体在类风湿关节炎中诊断价值及在炎症反应中作用。方法以骨关节置换病人滑膜组织为对照组（n= 25）,类风湿关节炎患者滑膜组织为病例组（n=25）,qRT-PCR法检测骨关节置换病人和类风湿关节炎患者滑膜组织中P2X7受体 相对表达;特异性敲低P2X7受体的小分子干扰RNA干扰P2X7受体研究其对炎症细胞因子分泌作用;ELISA检测炎症细胞因 子白细胞介素IL-1β、IL-6、IL-8水平。结果类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平明显高于骨关节置换手术患者滑膜组织 P2X7受体水平,其对类风湿关节炎诊断具有较好的价值;类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平与血清中炎症细胞因子 IL-1β、IL-6、IL-8水平呈正相关,且有统计学意义（P<0.001）;干扰P2X7受体后明显抑制MH7A滑膜细胞的IL-1β和IL-6分泌。 结论类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平升高,对类风湿关节炎具有诊断价值,阻断P2X7受体后抑制炎症细胞因子的 分泌和炎症反应。     

IL-1β对HepG2细胞核受体RXRα蛋白表达的影响

目的研究白细胞介素1β（interleukin 1 beta,IL-1β）诱导人肝癌细胞HepG2维甲酸X受体α（retinoid Xreceptor alpha,RXRα）蛋白核-胞浆转移现象及其基因水平变化。方法 IL-1β处理HepG2细胞,收集不同时间点RXRα总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白及mRNA;同时用蛋白酶体抑制剂,MG132预处理HepG2细胞后IL-1β诱导细胞,收集细胞蛋白及mRNA,应用Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR）检测RXRα总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白及mRNA水平的变化。结果总胞核RXRα蛋白表达量降低（P〈0.05）,胞浆RXRα蛋白表达量增高（P〈0.05）,RXRαmRNA水平在6、12 h升高（P〈0.05）。MG132可以抑制IL-1β对细胞核、胞浆RXRα蛋白表达水平的变化。结论 IL-1β可以诱导HepG2细胞RXRα核-胞浆转移,RXRα核-胞浆转移可能与泛素-蛋白酶体降解途径相关。     

P4HA2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌的发生和发展

目的 探讨脯氨酸4-羟化酶II（P4HA2）在肝癌细胞发生发展中的作用及相关机制。方法 利用GEPIA、Human Protein Atlas数据库预测P4HA2在肝癌中的表达情况,利用K-M plotter在线数据库分析P4HA2的表达情况与肝癌预后的关系,采用qRT-PCR和Western blot检测肝癌细胞和正常肝细胞中P4HA2的表达。构建慢病毒载体,用携带P4HA2 shRNA和Con shRNA的慢病毒载体分别转染肝癌SNU-449和Hep-3B细胞系,建立沉默表达P4HA2的细胞株（shP4HA2组）和对照组细胞株（NC组）。采用CCK-8、集落形成试验、划痕实验和Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。采用Western blot实验检测上皮-间质转化和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达情况。结果 在线数据库分析结果显示,肝癌组织中P4HA2表达高于正常肝组织（P<0.05）。同时,肝癌细胞系中P4HA2 mRNA和蛋白表达水平也高于正常肝细胞（P<0.01）。慢病毒干扰后,与NC组相比,shP4HA2组中mRNA和蛋白表达水平下降（P<0.05）。P4HA2基因表达沉默后,细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制。Western blot显示,相对于NC组,shP4HA2组的E-cadherin蛋白表达上升,N-cadherin、Snail蛋白表达下降（P<0.05）,在PI3K/AKT/mTOR通路中,磷酸化的PI3K（P-PI3K）、AKT（P-AKT）和mTOR（P-mTOR）显示出较低的水平（P<0.05）。结论 P4HA2通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路影响肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭,促进肝癌的发生发展。     

NLRC4在具核梭杆菌诱导巨噬细胞焦亡中发挥调控作用

目的 探讨具核梭杆菌感染引起巨噬细胞焦亡的作用及机制。方法 巨噬细胞RAW264.7与具核梭杆菌共同培养,设置未感染组和具核梭杆菌感染组（以MOI和感染时间设置梯度）。乳酸脱氢酶和荧光双染检测细胞坏死率;Western blot检测焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD和IL-1β的活化情况;qRT-PCR分析NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP1炎症小体激活情况,采用siRNA敲低可能参与调控的关键分子,分为siRNA敲低组与阴性对照组,比较两组细胞在具核梭杆菌感染时的焦亡和坏死率,验证其调控作用。结果 具核梭杆菌感染组的细胞肿胀破碎、胞内出现空泡,乳酸脱氢酶释放增加,PI阳性细胞数增多,坏死率升高（P<0.05）;Western blot结果显示caspase-1、GSDMD和IL-1β被活化且呈MOI和时间依赖性升高（P<0.05）;qRT-PCR筛选出NLRC4可能参与调控,siRNA敲低NLRC4可抑制具核梭杆菌引起的caspase-1/GSDMD通路的激活,减少细胞坏死率和炎症因子IL-1β的表达（P<0.05）。结论 具核梭杆菌感染能够诱导巨噬细胞RAW264.7经caspase-1/GSDMD信号通路发生焦亡并释放炎症因子,且NLRC4炎症小体发挥关键的调控作用。     

IL-1β预处理脂肪间充质干细胞促进VEGF蛋白分泌和巨噬细胞M2型极化的研究

目的探讨白细胞介素（IL）-1β预处理脂肪间充质干细胞（ADMSCs）对血管内皮生长因子(VEGF)蛋白分泌和巨噬细胞M₂型极化的影响及作用机制。方法IL-1β预处理ADMSCs 24 h,Western blot法检测ADMSCs中环氧合酶-2（COX-2）蛋白表达,ELISA法测定ADMSCs培养基中前列腺素E₂(PGE₂)和VEGF蛋白质量浓度; IL-1β预处理的ADMSCs细胞培养基培养丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）-U937巨噬细胞（M0巨噬细胞）72 h后,实时荧光定量PCR法检测PMA-U937细胞CD163（巨噬细胞M₂型极化标志物）和IL-10 mRNA表达。慢病毒干扰ADMSCs细胞中COX-2表达后,观察ADMSCs培养基中VEGF蛋白质量浓度（ELISA法）和PMA-U937巨噬细胞中CD163和IL-10 mRNA的表达（实时荧光定量PCR法）。结果IL-1β预处理ADMSCs细胞后上调其COX-2蛋白表达,增加PGE₂和VEGF蛋白分泌（P<0.05）;IL-1β预处理的ADMSCs细胞培养基可上调PMA-U937巨噬细胞中CD163和IL-10 mRNA表达水平（P<0.01）。干扰ADMSCs细胞中COX-2蛋白表达后,可抑制IL-1β预处理的ADMSCs细胞中VEGF蛋白分泌（P<0.05）,亦可抑制其对PMA-U937巨噬细胞中CD163和IL-10 mRNA表达的影响（P<0.05）。结论IL-1β预处理ADMSCs细胞可通过COX-2-PGE₂信号轴,增加VEGF蛋白分泌,以及诱导PMA-U937巨噬细胞M₂型极化,提示IL-1β预处理能够增强ADMSCs细胞抗炎活性。     

CXCL12-CXCR4轴促进胶质母细胞瘤前神经间质转化

［摘要］目的: 探讨CXC趋化因子配体12-CXC趋化因子受体4(CXC chemokine ligand 12 CXC chemokine receptor 4,CXCL12-CXCR4)轴对脑胶质母细胞瘤前神经间质转化的作用。方法: 分析TCGA GBM基因数据库中CXCR4 mRNA在不同胶质瘤分子分型肿瘤组织中的水平差异及其对肿瘤患者生存率的影响;人胶质瘤LN428、U87MG细胞经不同浓度CXCL12 (0、20、40、60、80、100 ng/mL)及20 μmol/L普乐沙福(选择性CXCR4拮抗剂)预处理48 h,免疫印迹实验检测细胞内OLIG2、E-钙黏蛋白、YKL-40、N钙-黏蛋白和波形蛋白表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,CCK8法和克隆形成实验检测肿瘤细胞增殖能力。结果： TCGA GBM数据库分析结果显示,与健康者相比,胶质瘤患者CXCR4 mRNA表达显著增高,且与患者生存率呈负相关;间质型胶质母细胞瘤组织标本中CXCR4 mRNA水平显著高于前神经型胶质母细胞瘤(P均＜0.05)。与对照组相比,CXCL12组细胞间质型相关蛋白YKL-40、N-钙黏蛋白、波形蛋白表达水平显著升高,而前神经型相关蛋白OLIG2、E-钙黏蛋白表达水平显著降低,人胶质瘤LN428、U87MG细胞迁移和侵袭能力、增殖能力显著增强(P均＜0.05);给予普乐沙福处理后,与CXCL12组相比,人胶质瘤LN428、U87MG细胞迁移和侵袭能力、增殖能力显著降低,且间质型相关指标蛋白表达显著降低,前神经型相关指标蛋白表达显著升高(P均＜0.05)。结论： CXCL12-CXCR4轴具有促进胶质母细胞瘤前神经间质转化,及迁移和侵袭、增殖的作用。     

UHRF1调控雌激素受体表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

  目的  观察泛素样含PDH和环指域1 (UHRF1)对雌激素受体（ER）α和ERβ表达比率的影响,探讨UHRF1影响甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移的机制。  方法  应用Western blot、实时荧光定量（qRT）-PCR检测正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1和甲状腺乳头状癌细胞BCPAP中UHRF1、ERα和ERβ的蛋白及mRNA表达。分别用Scrambled siRNA、UHRF1 siRNA处理BCPAP细胞,qRT-PCR检测各组细胞中ERα和ERβ的mRNA表达;MTT、Transwell分别检测各组细胞增殖、侵袭和迁移。  结果  与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP细胞中UHRF1和ERα蛋白及mRNA表达水平上调（P<0.05）,而ERβ蛋白和mRNA表达水平下调（P<0.05）。与空白对照组和Scrambled siRNA组相比,转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞中ERα mRNA表达降低（P<0.05）,ERβ mRNA表达升高（P<0.05）;转染UHRF1 siRNA的BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移降低（P<0.05）。  结论  UHRF1可上调ERα/ERβ的表达比率,促进甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、侵袭和迁移。