胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础.方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AEC Ⅱ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant protein c,SPC)的表达.结果:每3～5只胎鼠可获得AEC Ⅱ(36 ± 5)× 106,活力98%±2%.镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形.透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上.结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AEC Ⅱ,能满足体外进一步实验的需要.     

新生鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化与鉴定

目的从新生SD大鼠体内分离提取肺泡Ⅱ型上皮细胞,为肺部相关疾病提供体外模型方法胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ消化分离细胞,差速贴壁法和大鼠IgG免疫黏附法纯化。采用倒置显微镜、透射电镜、共聚焦显微镜以及BCIP/NBT碱性磷酸试剂盒对细胞进行观察和鉴定。结果采取胰蛋白酶、胶原酶消化得到细胞,活力为(94.82±1.64)%,纯度为(95.96±0.90)%。倒置显微镜观察细胞内呈立方形,岛状生长,胞浆内有黑色颗粒;透射电镜下观察到特异性板层小体;共聚焦显微镜下可看到表面活性蛋白C表达;BCIP/NBT碱性磷酸试剂盒鉴定后可观察到细胞胞浆内有深蓝色颗粒。结论用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ消化可得到高纯度的肺泡Ⅱ型上皮细胞,可满足体外实验的需要。     

大小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养方法

肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)是肺泡上皮细胞的"祖细胞",可分化为AECⅠ,其作用与肺组织的生理功能密切相关,获取AECⅡ将为肺部疾病的研究提供良好的实验模型和基础。大鼠和小鼠是常用的制备AECⅡ的动物,胎肺的消化方法和消化酶的种类、分离纯化的方法、鉴别的方法以及培养方法等是AECⅡ研究的重点和难点,虽然已经进行了广泛研究,但目前尚未形成一套完善的胎鼠AECⅡ分离、纯化与鉴定的方法。此外,AECⅡ的产量、纯度和传代等都是需要将来继续探索的问题。     

胎鼠肺细胞的分离纯化及原代培养

目的 建立一套可靠的胎鼠肺细胞分离、纯化和培养技术，用于体外研究肺发育和早产儿肺部疾病。方法 采用胰酶和胶原酶消化19d胎鼠肺组织块，经差速离心和反复贴壁法，分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)和肺成纤维细胞(LF)，并进行原代培养。用细胞角蛋白(cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)免疫细胞化学染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果 该方法所得细胞产量大、纯度高。免疫细胞化学鉴定，AECⅡ细胞cytoker—atin染色阳性，vimentin染色阴性，LF则相反。透射电镜观察AECⅡ，可见细胞内板层小体。结论 该方法是一种可靠的胎鼠肺细胞的分离纯化培养技术，可用于体外研究肺发育与早产儿肺部疾病。     

鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养

目的：探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离，鉴定和培养。方法：采用改良法（酶消化与碳铁颗粒相结合）、分离、鉴定和培养了肺泡Ⅱ型上皮细胞。结果：使用上述方法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，经流式细胞仪、鞣酸染色和电子显微镜鉴定，其纯度达７０％以上。结论：经改良法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，可满足一般试验需求。     

新生大鼠Ⅰ型肺泡上皮细胞原代培养方法的改进

【摘要】 目的 改进体外SD大鼠Ⅰ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅠ,ATⅠ)的原代培养方法,用更为简单的培养方法获得较高纯度的ATⅠ。方法 选用新生1d的SD大鼠,消毒后待新生大鼠呼吸停止后断头取肺,采用胶原酶Ⅰ和DNaseⅠ消化分离法获取原代细胞,将细胞接种在Ⅰ型鼠尾胶原蛋白包被过的细胞板中,利用差速贴壁法纯化AT Ⅰ,同时细胞培养48 h后进行换液,倒置显微镜下观察细胞的生长状态,用细胞水通道蛋白5（AQP5）、肺表面活性物质相关蛋白（SPC）、植物凝集素（BSI）、波形蛋白（Vimentin）4种肺细胞的特异性表达产物鉴定细胞。结果 接种2 d时,细胞开始贴壁生长。4～6 d时细胞开始增殖,呈现梭形、立方形、多角形等多种形态。8 d时细胞增殖能力达到最大,细胞活力为（87±8）%,细胞纯度为（87±5）%。结论 对组织取材、分离和培养进行改进可获得产量高、生长状态好、纯度高的ATⅠ。     

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的:建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)分离、纯化和培养技术,为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞(BASC)的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础。方法:采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AECⅡ,并进行原代培养。用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果:该方法所获得细胞产量大、纯度高。AECⅡ比例约为(80±2.6)%(n=5),Clara细胞约(6.7±1.2)%(n=5),并能维持培养3~5 d。透射电镜观察AECⅡ,细胞内可见板层小体。结论:该方法是一种可靠的小鼠AECⅡ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求。     

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养和鉴定

目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（简称ＡＴ－Ⅱ）的改良体外原代培养法，并比较其鉴定方法的优劣。方法 ＡＴ－Ⅱ分离、用胰蛋白酶消化地并用ＩｇＧ包被的培养瓶粘附纯化，原代培养后通过鞣酸多彩、碱性磷酸酶（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＫＰ）、肺表面活必不知所措霜关蛋白Ａ（ＳＰ－Ａ（）免疫组化三种染色法和电镜鉴定ＡＴ－Ⅱ。结果 胰酶消化加ＩｇＧ粘附纯化后所得的ＡＴ－Ⅱ纯度为９０％。ＡＫ 色鉴定     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长状况及ABCA3表达变化的初步研究

目的:观察原代培养胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell,AECⅡ) 的生长状况及AECⅡ特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白A3(ATP binding cassette transporter A3,ABCA3)的表达变化,为有关新生儿肺发育及肺部疾病的研究奠定一定基础?方法:采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,差速离心及差速贴壁法纯化细胞;电子显微镜鉴定AECⅡ细胞;倒置相差显微镜观察不同时间点细胞生长状态;MTT法绘制细胞生长曲线;免疫荧光技术观察 ABCA3动态表达变化?结果:电镜下观察到AECⅡ特征性板层小体,大小及数量不等,胞膜外缘分布有刺状微绒毛;MTT法测得铺板后第24?36?48?72?96?120 h的吸光度值分别为0.177 ± 0.009,0.193 ± 0.011,0.212 ± 0.019,0.253 ± 0.019,0.243 ± 0.012,0.192 ± 0.011?光学显微镜下细胞形态逐渐拉长,变扁平,细胞内颗粒逐渐减少?免疫荧光示ABCA3表达逐渐下降?结论:原代培养的胎鼠AECⅡ在培养早期生长状况最佳,ABCA3表达最丰富,故在早期(即培养72 h以内)进行肺发育疾病相关机制的研究较为理想?     

胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定

目的建立较理想的SD大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法孕18 d(E18)SD大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络。结论该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。     

表皮生长因子对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长的影响

目的研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(TypeⅡalveolar epithelial cells,AECⅡ)生长、细胞周期的影响。方法原代培养胎鼠AECⅡ,将培养细胞分为对照组及EGF干预组,各组再根据培养时间点分为0、2、4、6、8d 5个亚组,绘制AECⅡ生长曲线并检测细胞周期。结果 EGF干预组细胞生长增殖速度较对照组快,差异有统计学意义(P<0.05),EGF可减少G1期细胞比例,增加S期细胞比例,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EGF可有效促进AECⅡ分裂增殖。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离与培养

肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离与培养赵勇１综述曾庆富２审校（１郧阳医学院病理学教研室十堰４４２０００２湖南医科大学病理学教研室）作为肺泡结构细胞之一的肺泡Ⅱ型上皮细胞（ＡＴⅡ）在肺内具有重要功能：调节表皮活性物质代谢、肺泡环境的维持、肺损伤时向Ⅰ型上皮的转化...     

构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法

目的：建立可靠稳定的小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)的分离、原代培养技术,为进一步研究AECⅡ转分化分泌生长转化因子β1(TGF-β1)等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。方法采用传统的方法和改良后方法分别提取20只小鼠AECⅡ,将其所提取的细胞数量进行对比。结果传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个,改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个,差异有统计学意义(P<0.05),而两组小鼠在体质量、年龄以及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论此改良方法可成功获得大量稳定的AECⅡ,为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。     

Percoll密度梯度离心法分离大鼠肺Ⅱ型上皮细胞

目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)的改良体外原代培养法.方法 采用循环冲洗、支气管灌洗、胰蛋白酶消化、滤网过滤并用轻比重及重比重Percoll密度梯度离心,分离AT-Ⅱ.原代培养后通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP) 法和电镜鉴定AT-Ⅱ.结果 经AKP染色和电镜鉴定所得的AT-Ⅱ纯度为(80.2±6.3)%,每只大鼠可分离出1×107 AT-Ⅱ.结论 采用Percoll密度梯度离心法能分离出较高纯度的AT-Ⅱ.     

ICR胎鼠原代神经元细胞培养及鉴定

目的 建立较理想的胎鼠神经元细胞体外原代培养方法。方法 取13.5 d ICR胎鼠的大脑皮层,经剪碎消化得到单细胞悬液进行培养,观察细胞形态并作PCR及Western blotting等进行神经元相关的基因及蛋白Tuj1和Map2的鉴定。结果 细胞生长状态良好,细胞胞体明显,周围有明亮光晕,细胞突触交错形成网络样,通过PCR及Western blotting验证证明所分离培养的细胞是神经元细胞。结论 本培养方法简单易行,可获得典型和纯度较高的ICR胎鼠大脑皮层神经元细胞。     

兔膀胱上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的 建立一种有效、简便的兔膀胱上皮细胞体外原代培养方法。方法 以DMEM／F12（1：1）为基础培养基，添加10％FCS、EGF等营养成分，在37℃、5％CO2的孵箱内培养，并行细胞形态学、免疫组化检测。结果 细胞在10－14d融合形成单层，细胞形态呈多角形，经HE染色、免疫组化、透射电镜证实为移行上皮细胞。结论 此培养方法能在短时间内大量获得移行上皮细胞，具有细胞纯度高、成功率高、适用范围广的特点。     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NADH脱氢酶亚单位4、5表达的影响

目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位4、5表达的影响.方法 原代培养Sprague-Dawley（SD）胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至接近汇合状态时随机分为高氧组和正常对照组,高氧组持续暴露于常压高浓度氧中（氧浓度〉90%.CO2浓度5%）,正常对照组仍置于5%CO2培养箱中,两组均继续分别培养6、12、24h;采用免疫细胞化学染色SP法检测NADH脱氢酶亚单位4（DN4）蛋白的表达.采取半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定ND4、NADH脱氢酶亚单位5（ND5）mRNA的表达.结果 （1）SP法结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达增强,12h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达减弱,但差异均无统计学意义（均P〉0.05）,24hAEC Ⅱ ND4蛋白的表达显著减弱（P〈0.05）;（2）RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA表达增强,差异均无统计学意义（均P〉0.05）.12、24h AECⅡ ND4、ND5 mRNA表达显著减弱（P〈0.05）.结论 持续高氧下调胎鼠AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA和AEC Ⅱ ND4蛋白的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程.     

妊娠期糖尿病对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

目的 明确孕鼠妊娠期糖尿病(GDM)对胎鼠原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)形态、功能的影响及意义.方法 SD孕鼠分为对照组和GDM组,GDM组孕鼠建立GDM模型.分离、纯化两组胎鼠的AECⅡ细胞.台盼蓝染色判断胎鼠AECⅡ活力;透射电镜观察胎鼠AECⅡ超微结构改变.苏木素-伊红(HE)染色胎肺组织计算AECⅡ和AECⅠ数量及比例;油红O染色检测胎鼠AECⅡ脂质的变化;免疫荧光检测胎鼠AECⅡ中肺泡表面活性物质相关蛋白C(SP-C,AECⅡ标记物)的表达变化;免疫细胞化学检查胎鼠AECⅡ肺泡表面活性物质相关蛋白A(SP-A)的表达变化.结果 原代培养可得到高产量、高纯度的AECⅡ.透射电镜下可见GDM组胎鼠AECⅡ中板层小体数较对照组胎鼠明显减少,细胞表面的微绒毛明显减少.GDM组胎鼠AECⅡ和AECⅠ细胞数量较对照组胎鼠均降低.GDM组胎鼠AECⅡ中脂滴数较对照组胎鼠明显减少.GDM组胎鼠原代培养的AECⅡ中SP-A表达低于对照组胎鼠(P＜0.001).结论 GDM时,AECⅡ细胞形态的改变,功能的抑制是新生儿容易出现呼吸窘迫综合征的重要原因.