运动量对糖尿病动脉粥样硬化大鼠TLR2、TLR4的影响

目的:探讨不同强度的运动对糖尿病动脉粥样硬化大鼠主动脉组织Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)的影响.方法:选取健康SD大鼠100只,随机分成对照组20只及糖尿病动脉粥样硬化组80只,糖尿病动脉粥样硬化模型采用高糖高脂饮食加链脲佐菌素(STZ)(30 mg/kg)注射建立.其中糖尿病动脉粥样硬化组又分成模型组、小运动量组、中等运动量组和大运动量组(每组20只).经过估计力竭运动时间及游泳训练后,小运动量组(12 min/次),中等运动量组(21 min/次),大运动量组(30 min/次),进行6周的运动干预,1次/d,一周6次.用PCR法测定各组大鼠主动脉组织的TLR2、TLR4mRNA的表达.结果:模型组较对照组血管组织中TLR2、TLR4水平升高;运动干预后,各运动组TLR2、TLR4水平较模型组降低,以中等运动量、大运动量组下降明显.结论:糖尿病动脉粥样硬化大鼠主动脉组织中TLR2、TLR4水平升高,TLR2、TLR4水平的升高可能是糖尿病动脉粥样硬化的发病机制之一,运动能够降低TLR2、TLR4的表达.     

转染bcl-2基因对心肌细胞活力的影响

目的：研究转染抗凋亡基因bcl-2对心肌细胞活力的影响。方法：提取含有人bcl－2基因的逆转录病毒真核表爱载体pDOR-SB质粒，用脂质体介导的基因转染法分别将pDOR-SB质粒和pDOR质粒（不含bcl-2基因）转染心肌细胞，观察转染心肌细胞在缺氧环境下的存活能力。结果：（1）原位杂交可见bcl-2基因转染了心肌细胞；（2）转染bcl-2基因能明显提高心肌细胞在缺氧条件下的存活能力，提高对岂氧的耐受力。结论：转染bcl-2基因能显提高心肌细胞对缺氧的耐受性。     

溃疡性结肠炎小鼠结肠中TLR2、TLR3、TLR5和TLR9的表达

目的 通过研究溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠结肠组织中TLR2、TLR3、TLR5和TLR9的表达随时间变化的关系,探讨Toll样受体家族在UC致病机制中的作用.方法 60只BALB/c小鼠随机分为3组,第1组不予处理,第2组予5％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液自由饮用7d造模,第3组予5％ DSS溶液自由饮用14 d造模.取各组小鼠的结肠标本,用RT-PCR和Western blotting的方法半定量检测TLR2、TLR3、TLR5、TLR9的表达.结果 ①正常小鼠结肠中无TLR2、TLR3、TLR5和TLR9表达;②造模7d小鼠结肠中无TLR3和TLR5表达,而TLR2和TLR9出现明显表达;③造模14d小鼠结肠中仍然无TLR3和TLR5表达,而TLR2和TLR9的表达则继续增加.结论 TLR2和TLR9可能参与了溃疡性结肠炎的致病机制,而TLR3和TLR5可能未参与UC的致病机制.     

早期脓毒症大鼠肝TLR4和MD-2基因的表达及丙泊酚对其的影响

目的 观察早期脓毒症大鼠肝Toll 样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)基因的表达,并以丙泊酚进行干预,比较肝TLR4、MD-2基因表达的差异.方法 采用大鼠尾静脉注射脂多糖复制脓毒症模型.按完全随机化原则分为正常对照组(N组)、脂多糖组(L组)、脂多糖+丙泊酚组(LP组),每组20只.每组再依照注药后1...     

TLR2与TLR4在大肠癌组织中的表达特点

目的 观察Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)在大肠癌组织和大肠癌细胞株上的表达特点.方法 采用SP免疫组化法检测70例大肠癌组织和配对癌旁相对正常组织TLR2,TL4的表达,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2,TLR4在大肠癌细胞株Lovo和SW480细胞上表达的平均荧光强度及阳性细胞率.结果 TLR2在大肠癌组织上的表达明显强于癌旁组织(X2=13.629,P=0.003),而TLR4的表达在大肠癌组织与癌旁组织差异元显著性(P＞0.05).根据平均荧光强度及阳性细胞率,TLR2,TLR4在大肠癌细胞株Lovo和SW480上基本无表达.结论 TLR2可能与大肠癌的疾病过程密切相关.     

平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织TLR2和TLR4表达的影响

目的:观察平喘颗粒对哮喘小鼠肺组织Toll样受体2(toll-like receptor2,TLR2)和TLR4表达的影响.方法:将30只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、平喘颗粒(31.2 g·kg-1)组,每组10只.除对照组外,采用腹腔注射加雾化卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏液[100μgOVA...     

转染bcl-2基因对心肌细胞缺氧耐受性的影响

目的 探讨转染ｂｃｌ－２基因能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性。方法 ①重组真核细胞表达载体。将含编码人ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ寒带开放阅读框的ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ重组至逆转录病毒载体－ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲⅠ位点上,用脂质体包裹重度组质粒导入ＰＡ３１７细胞株,并经Ｇ４１８筛选阳性克隆;②用含高滴度重组病毒的上清感染心肌细胞,原位杂交鉴定其转染是否成功;③观察转染心肌细胞在缺氧环境下的生存率。结果 ①重组了含ｂ     

A族链球菌感染巨噬细胞激活TLR2及TLR4表达的研究

目的通过分析A族链球菌(GAS)感染巨噬细胞后TLR2及TLR4的活化情况,以此来研究GAS感染后产生炎症反应的信号通路,为GAS感染巨噬细胞的预防及治疗奠定基础。方法 GAS及热灭活GAS以感染复数(MOI)为100∶1感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞后1,2,4,6 h,提取总RNA采用real-time PCR技术检测TLR2/4的表达情况;同时GAS及热灭活的GAS注射C57小鼠腹腔,24 h后分离腹腔巨噬细胞并提取蛋白,利用Western blot及免疫荧光技术对TLR2和TLR4的表达量进行分析。结果巨噬细胞表面TLR2及TLR4在GAS感染后1 h活化不明显,但作用2 h后TLR2及TLR4表达明显升高(P<0.05),4 h时达到高峰,6 h后开始降低。热灭活GAS感染巨噬细胞TLR2的表达与GAS感染比较未见到统计学差异(P>0.05),但巨噬细胞表面TLR4的表达与GAS组具有明显的差异(P<0.05)。结论 GAS感染小鼠巨噬细胞可同时激活TLR2及TLR4受体,其中TLR4受体主要通过位于GAS表面及其分泌的活性蛋白成分激活,TLR2受体则主要由其菌体成分进行活化。     

用FRET技术研究TLR4和MD-2的相互作用

目的 利用荧光共振能量转移（FRET）技术在活体细胞研究人Toll样受体（TLR）4与髓样细胞分化蛋白2（MD-2）的相互作用。方法 用PCR方法扩增TLR4编码序列和MD-2编码序列（不包括信号肽序列）并分别亚克隆入带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白和增强型黄色荧光蛋白表达载体（pECFP-C1-SP，pEYFP-C1-SP）中，重组质粒经酶切、序列鉴定分析后分别或共同转染HEK293细胞．用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和分布情况，并用常规的方法和受体光漂白的方法对共表达青色荧光蛋白（CFP）-TLR4和黄色荧光蛋白（YFP）-MD-2的细胞进行FRET分析。结果 重组质粒在HEK293细胞中得到表达．仅转染pECFP／TLR4或pEYFP／MD-2的细胞可见青色或黄色荧光主要分布在胞质内，以核周较多：而共转染pECFP／TLR4和pEYFP／MD-2的细胞可同时检测到青色和黄色荧光，主要分布在细胞膜，同时胞质也有少量表达。无论是用常规的方法还是受体光漂白的方法，对共表达CFP-TLR4和YFP-MD-2的细胞进行FRET分析结果表明有FRET现象的发生．提示TLR4和MD-2有相互作用并形成复合物。结论 本研究为TLR4和MD-2在活体细胞中的相互作用提供了直接的证据。     

bcl—2基因克隆、转染及其在PC12细胞中的表达

目的：研究bcl-2基因（bcl-2)在PC12细胞中的表达。方法：构建真核表达载体pcDNA3-bcl-2，采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞，Western blot和原位免疫组化检测外源基因表达。结果：本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-bcl-2，并用脂质体介导的方法获得了稳定表达bcl-2的细胞克隆。Western blot显示有26ku的蛋白质表达，bcl-2单克隆抗体免疫组化染色呈阳性反应。结论：重组质粒pcDNA3-bcl-2经转染能够在PC12细胞中有交表达，为进一步研究bcl-2对PC12细胞的生物学功能奠定了基础。     

痛风泰颗粒对TOLL样受体基因TLR2、TLR3的调控作用

目的:分析痛风泰颗粒剂对Toll样受体基因TLR2、TLR3的调控作用,进而为解释该药物治疗痛风的作用机制提供理论依据。方法:首先痛风大鼠造模,获得原代炎性关节滑膜细胞。其次,将15只正常的SD大鼠随机分为生理盐水组,戴芬溶液组,低剂量、中剂量、高剂量痛风泰颗粒组,制备5种含药血清。最后,分别用上述5种血清刺激培养的炎性关节滑膜细胞,8 h后检测5组细胞TLR2和TLR3基因mRNA的表达。结果:经过不同条件的刺激后,TLR2基因只有中剂量痛风泰颗粒组的mRNA相对表达量与生理盐水组比较,具有显著差异(P0.05),但总体趋势不明显;TLR3基因的mRNA相对表达量无任何趋势及表达差异(P0.05)。结论:Toll样受体基因TLR2和TLR3可能并不是痛风泰颗粒剂治疗痛风的关键基因,更有价值的靶基因或调控因子有待于被发现。     

乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达及其意义

目的 检测乙肝患者血清标本中TLR2和TLR4的含量,关注其表达特征,探讨其表达的意义.方法 本实验以130例乙肝患者的血清标本作为观察组,60例正常体检成人的血清标本作为对照组,应用酶联免疫吸附实验检测二组中TLR2和TLR4的表达,分析其在不同临床病理特征之间意义及相互关系.结果 乙肝患者血清中TLR2和TLR4的表达明显高于对照组[(85.46±15.46) ng/L vs (28.75±2.35) ng/L;(100.23±23.25) ng/L vs (64.34±4.32) ng/L],血清中TLR2和TLR4的含量与乙肝患者病情的严重程度有关,乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达呈正相关(P=0.021 4,r=0.39).结论 乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4高表达,二者可能具有协同作用.联合检测血清中TLR2和TLR4的含量可能与判断病情的严重程度有关.     

TLR2和TLR4在单肺通气麻醉中的表达

目的:研究Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)在单肺通气麻醉过程中的表达变化并探讨其临床意义。方法:选择胸科肺癌行肺叶切除手术30例,随机分为两组,A组(n=11,双肺通气),B组(n=19,单肺通气组),收集开胸后/单肺通气后15(T1),30(T2),45(T3),90(T4)min血清,采用ELISA法检测两组血清中IL-8,TNF-α的表达;收集切除标本后的肺组织,电子显微镜观察细胞形态病理变化,采用RT-PCR检测TLR2mRNA和TLR4mRNA,免疫组化检测肺组织TLR2和TLR4蛋白的表达。结果:电镜检测表明:两组均发生肺细胞炎症反应,其中B组发生炎性反应明显比A组显著;两组TLR2mRNA和TLR4mRNA表达比较,B组的TLR2mRNA和TLR4mRNA表达明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B两组中的IL-8,TNF-α浓度在各时点均有不同程度的升高,其中组内比较T4时点的IL-8,TNF-α浓度明显高于T1时点,差异有统计学意义(P<0.05);A、B两组间比较,在T4时点IL-8,TNF-α浓度B组明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05),其余时点表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、B两组免疫组化比较,B组的TLR2和TLR4阳性率明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:单肺通气期间,随着时间的延长,炎症反应更为显著,TLR2、TLR4表达上调并参与炎症反应。     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

TLR2和TLR4在原因不明复发性流产绒毛和蜕膜中的表达及其意义

目的本实验通过检测原因不明复发性流产(URSA)患者和健康早孕者TLR2和TLR4在子宫绒毛和蜕膜中的表达,及外周血清中TNF-α及IL-10的水平,初步探讨TLR2和TLR4与URSA存在相关性,以及在URSA发生发展中的可能途径。方法前瞻性研究2008~2009年在浙江大学医学院附属妇产科医院和杭州市第一人民医院门诊患者。年龄在25~35周岁,孕龄<12周。将有≥3次自然流产的URSA患者作为研究组;将曾有正常生育史,本次要求行人工流产终止妊娠的早孕健康妇女作为对照组,分别选择20例。免疫组化检测TLR2和TLR4在两组绒毛和蜕膜中的表达;用ELISA法检测血清TNF-α及IL-10的水平,比较是否存在差异性。结果①TLR2在两组绒毛、蜕膜中表达差异无统计学意义(P>0.05);②TLR4在研究组绒毛、蜕膜表达明显增强,有显著统计学意义(P<0.05);③TNF-α在研究组中的水平明显增高,有显著统计学意义(P<0.05);IL-10在两组中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR4可能是通过释放过量的Th1型细胞因子,导致Th1/Th2失衡,从而极可能参与URSA的发病。     

TLR2和TLR4在大鼠光滑念珠菌肺部感染中的表达及意义

目的：研究Toll样受体2（TLR2）和TLR4在光滑念珠菌肺部感染大鼠中的作用。方法将36只大鼠分为3组,每组12只：对照组（A组）、未免疫抑制肺部光滑念珠菌感染组（B组）及免疫抑制肺部光滑念珠菌感染组（C组）。每组分别在造模成功后第1、3天各处死大鼠6只,观察肺组织病理变化,用逆转录PCR（RT-PCR）法检测肺组织 TLR2、TLR4 mRNA的表达、酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定TNF-α蛋白水平。结果 A组肺组织正常;B组部分肺泡塌陷、炎症细胞浸润,未见孢子或菌丝;C组大部分肺泡塌陷,部分扩张,大量炎症细胞浸润、并有孢子菌丝聚积。第1、3天 TLR2 mRNA和 TNF-α蛋白表达水平C组明显高于其他两组（P＜0．01）,B组高于A组（P＜0．05）;C组第3天 TLR2、TLR4 mRNA ,TNF-α表达水平高于第1天（P＜0．05,P＜0．01）,且TLR4表达高于A组（P＜0．05）。结论 TLR2和 TNF-α可能参与光滑念珠菌肺部感染的发生发展,TLR4可能起协同作用。     

Bcl—2基因增强表达对TNF诱导U937细胞凋亡的效应

目的：探讨Ｂｃｌ－２基因增强表达对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）诱导的Ｕ９３７细胞凋亡的生物学效应。方法：用磷酸钙沉淀法将Ｂｃｌ－２基因转染到Ｕ９３７细胞，用Ｇ４１８筛选稳定转染子，用不同剂量ＴＮＦ处理后观察未转染细胞的存活率。结果：用Ｂｃｌ－２稳定转洒的Ｕ９３７细胞经ＴＮＦ处理，存活率明显高于未转染细胞，结论：Ｂｃｌ－２基因增强表达阻抑ＴＮＦ诱导的Ｕ９３７细胞凋亡。     

IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

TLR2检测对结核性胸腔积液的诊断价值

目的探讨TLR2检测对结核性和恶性胸腔积液的鉴别诊断价值。方法收集55例（其中结核性胸腔积液30例,恶性胸腔积液25例）患者的胸水,应用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定胸水上清液中TLR2的浓度,并对测定结果进行统计学处理。结果结核性胸腔积液中TLR2水平明显高于恶性肿瘤性胸腔积液。结论胸腔积液TLR2可作为结核性、恶性胸腔积液鉴别诊断的参考依据。