功能差异细胞模型筛选抗肺癌功能性单克隆抗体及其抗原

目的:筛选获取抗肺癌细胞膜的功能性单克隆抗体及其靶抗原，为肺癌靶向治疗提供候选治疗剂及靶标。方法: 将新鲜人肺癌组织细胞免疫BALB/c小鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单克隆抗体库。建立肺癌细胞增殖、侵袭、迁移等定向功能差异细胞模型，采用活细胞免疫荧光与功能差异模型筛选其抗原在定向功能（细胞增殖、迁移、侵袭）差异模型细胞膜上差异表达的单抗，再经体外相应功能实验筛选具有抑制作用的功能性单抗，Western blotting鉴定这些单抗的抗原，裸鼠体内抑瘤实验鉴定部分单抗对肺癌的抑制作用。结果: 细胞融合后共获得2 893株杂交瘤克隆，其中与肺癌细胞膜结合反应的309株。分别建立了3种体外肺癌细胞增殖、侵袭、迁移差异模型用于筛选，筛选获得20株单抗能显著抑制肺癌细胞增殖、10株单抗能显著抑制肺癌细胞侵袭、5株单抗能显著抑制肺癌细胞迁移（P<0.05或P<0.01）。Western blotting鉴定了其中6株的抗原。选取其中2株单抗均能在裸鼠体内显著抑制肺癌移植瘤的生长（P<0.05或P<0.01）。结论: 采用大容量功能性单抗库技术结合功能差异细胞模型可批量筛选获得具有体内外抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗，为筛选肺癌靶向治疗剂及靶标提供了一种潜在的新方法。     

肺癌抑制性抗体及其抗原的鉴定

目的：鉴定抑制肺癌细胞生长的功能性单克隆抗体1E2及其抗原，为治疗肺癌提供有潜力的靶向抗体治疗剂和分子靶位。方法：采用活细胞荧光、MTT细胞增殖实验、ELISA、动物体内治疗实验等方法检测鼠单克隆抗体1E2对人肺癌细胞增殖的抑制、单抗与癌细胞的结合部位、单抗的亚类和单抗对肺癌移植瘤的抑制，以Western blotting和MALDITOF质谱方法鉴定该功能性单抗的抗原。结果：单抗1E2能够与肺癌细胞GLC82和NCI-H520的细胞膜结合，在体外能够明显抑制肺癌细胞的增殖。动物实验表明单抗1E2能够抑制肺癌移植瘤的生长，抑制率达49％。Western blotting显示其抗原相对分子质量约110000，质谱鉴定该抗原为氨甲酰磷酸合成酶（carbamoyl-phosphate synthetase1，CPS1）。结论：单抗1E2能够在体内外抑制肺癌的生长，具有成为肺癌靶向治疗剂的潜力。该抗体识别的抗原CPS1可表达于肺癌细胞的细胞膜，可能是一个肺癌靶向治疗的新靶位。     

抗内毒素噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建一个鼠源性的抗内毒素单链噬菌体抗体库,从中筛选出对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。方法从小鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因（VH,VL）,用Linker将VH,VL交联形成单链抗体可变区片段（ScFv）。经NotⅠ,SfiⅠ双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经ELISA检测抗内毒素ScFv。结果小鼠血清中抗内毒素的效价为1∶12800。提取的总RNA浓度为12.3813μg/ml,纯度较好。扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。结论成功地构建了一个库容量为1.9×107的鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库,并从中筛选出了2株抗内毒素ScFv。     

肺癌的抗体治疗的研究进展

肺癌的传统疗法效果不够理想，用抗体治疗肺癌是一较为有效的方法。目前主要有5类抗体用于治疗肺癌：（1）西妥昔单抗(Cetuximab)、ABXEGF(Panitumumab)、Matuzumab（EMD72000）和曲妥珠单抗(Herceptin)等，这类抗体通过结合肿瘤细胞表面分子抑制细胞生长，具有较好的疗效，     

肺癌导向治疗浅谈

单克隆抗体可作为多种“弹头”的理想导向载体用于肿瘤的导向治疗，我们用放射性同位素^131I标记抗肺癌单抗进行肺癌临床放射免疫显像，在一组肺部可疑“块影”病例中，诊断准确性达93．5%(29／31)。肺癌单抗交联化学药物、毒素、放射性核素构建的“导向药物”都已进入临床Ⅰ-Ⅱ期研究。通过筛选高效“弹头”，介入给药、腔隙给药等方式提高肿瘤局部药物浓度，在部分病例中看到了一定的治疗作用．基因工程抗体发展迅速，人-鼠嵌合抗体，小分子抗体日趋成熟，噬菌体抗体库技术给单抗的研制带来了全新的概念，有很大的应用前景，部分基因工程抗体已进入临床研究。双功能抗体因其可结合两个不同抗原而介导的细胞毒作用格外引人注意。肿瘤导向药物还面临许多问题，克服问题的新技术也在不断发展。     

双特异性抗体在肺癌治疗中的应用

肺癌是当今世界发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤．到20世纪90年代初,在全世界大多数国家肺癌发病率和死亡率已跃居男性各类恶性肿瘤之首,女性发病率则居第一位．死亡率居第二位．在人类同肺癌的斗争中。人们不断探索新的治疗方法。1961年Nisonoff和Rivers发现了双特异性抗体(bispecific antibody,     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

抗体偶联药物在晚期非小细胞肺癌中的研究进展

尽管靶向、免疫等治疗策略已成为晚期肺癌患者的一线标准疗法,但在多数情况下,获得性耐药仍不可避免。抗体偶联药物（ADC）的问世提供了一个全新的选择。ADC是一类由靶向抗肿瘤的单克隆抗体与细胞毒药物偶联形成的新型抗癌药物。与化疗药物相比,ADC具有耐受性好、靶点识别准确、对非癌细胞影响小等优点,已在多种恶性肿瘤治疗方面显示出良好的临床获益。本文就新兴的ADC在晚期非小细胞肺癌中的应用作一综述。     

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。     

单克隆抗体MG9用于肺癌的免疫组化研究

用鼠抗人胃癌单克隆抗体MG_9对147例不同组织学类型的肺癌进行了免疫组织化学研究,探讨MG_9相关抗原在肺癌组织中的表达及其临床意义。结果表明,肺癌MG_9相关抗原表达总阳性率为51.7％(76/147);不同组织学类型肺癌间阳性率差异显著,其中腺癌阳性率92.1％(47/51),显著高于鳞癌的30.2％(13/43)和小细胞癌的30.2％(16/53),P<0.001。这提示:单抗MG_9对肺腺癌有较高特异性,可作为肺腺癌的一种新的标志物。     

人肺癌CEA单克隆抗体免疫组化研究

应用间接酶标法对人体不同组织类型的61例肺癌进行了CEA单克隆抗体的免疫组化研究,鳞癌阳性率为92％,腺癌86.7％。CEA在鳞癌呈明显的细胞异质性分布,在同一癌巢中,仅位于癌巢中心、分化较好的细胞CEA阳性。CEA在鳞癌呈膜性分布;腺癌为胞浆分布。尽管鳞癌和腺癌CEA阳性率较高,但对其应用于示踪导向疗法的价值尚有待探讨。     

T7噬菌体展示文库筛选肺癌早期检测分子标志群

目的从肺癌T7噬菌体展示文库筛选出能用于肺癌早期检测的分子标志群。方法亲和筛选肺癌T7噬菌体展示文库,对纯化后的富集肺癌相关肽的文库进一步行两轮ELISA检测,PCR扩增阳性噬菌体插入片段,测序后经过NCBI上的BLAST序列比对。结果筛选出13个有意义噬菌体,测序结果显示1个为未知功能的新基因,其余的均已确定与癌症相关;且13个基因中包含有三组相同的基因。结论从T7噬菌体构建的肺癌cDNA文库中筛选出的一组阳性噬菌体表达的抗原,可能是潜在的肺癌诊断分子标志群。     

肺小细胞癌与神经元Hu抗体免疫学研究

［目的］探讨肺小细胞癌导致的神经系统副肿瘤综合征的发病机理。（方法）用免疫细胞化学和免疫印迹技术测定13例肺小细胞癌件神经系统副肿瘤综合征患者血清及脑脊液中的神经元抗体——Hu抗体，并用Schuller公式计算鞘内免疫球蛋白IgG合成及Hu抗体特异活性。［结果］13例肺小细胞癌伴神经系统副肿瘤综合征患者血清及脑脊液中的Hu抗体阳性，11例中枢神经系统中有抗体合成，9例脑脊液中抗体特异活性增高。[结论]肺小细胞癌导致的神经系统副肿瘤综合征是一种自身免疫性疾病，Hu抗体在致病过程中起重要作用，而且对于肺小细胞癌的临床早期诊断有重要的临床价值。     

检测肺癌患者血清p53抗体的临床意义

目的:探讨检测肺癌患者血清p53抗体的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附法检测120例肺癌患者血清p53抗体,并以30例肺部良性疾病患者和120例正常健康人作对照。结果:肺癌患者血清p53抗体水平明显高于肺部良性疾病患者和正常人(P<0.05),而正常人与肺部良性疾病患者间无显著性差异(P>0.05)。120例肺癌中26例p53抗体阳性,阳性率为21.7%,而30例肺部良性疾病患者和120例正常人无1例阳性。肺癌者血清p53抗体与肺癌细胞分化程度和临床分期有密切关系(P<0.01)。结论:检测血清p53抗体水平有助于肺部良恶性疾病的诊断及鉴别诊断。     

双特异性抗体治疗小细胞肺癌的实验研究

目的：探讨双特异性抗体在小细胞肺癌免疫治疗中的应用价值。方法：制备既抗小细胞肺癌表面抗原又抗T细胞表面CD3抗原的双特异抗体（简称双抗，BSAb),分别进行体外实验与运输实验。结果：体外实验显示，加入双抗的较未加入双抗的LAK细胞对小细胞肺癌细胞杀伤活性明显提高（P＜0．05）。显示杀伤活性与效靶比例呈正相关。在肿瘤生长的动物实验中，接种后第7－10天双抗组肿瘤发生率明显低于未用双抗组（P＜0．05）；裸鼠生存动物实验中，双抗组平均存活为58．4天，是对照组的1．5倍。结论：双特异性抗体能提高LAK细胞对小细胞肺癌的治疗效果。     

异种免疫诱导中和性抗体抑制小鼠肺癌生长

目的 研究异种固定化完整细胞作为肿瘤疫苗的潜力,初步探讨其诱导的免疫反应的抗肿瘤机制。方法 分别使用固定的人肺癌细胞免疫小鼠,再接种小鼠自发肺腺癌鼠肿瘤进行肿瘤挑战,观察肿瘤细胞免疫后对小鼠肿瘤生长的影响。采用免疫组织化学法观察小鼠肿瘤浸润T细胞的情况,采用MTT法检测小鼠免疫血清对人肺癌细胞生长的影响。结果 采用人肺腺癌和鳞癌固定的完整细胞免疫小鼠后均明显地抑制小鼠肺腺癌肿瘤的生长（P<0.05）,抑瘤率分别为40.8%及49.2%,显著优于采用人肺腺癌和鳞癌细胞碎片免疫的效果。小鼠免疫血清在体外可抑制人肺癌细胞的生长。结论 异种人肺癌固定的完整细胞诱导了有效的小鼠抗鼠肺癌的体液免疫反应,显著抑制肿瘤生长,其抑制作用可能与诱导小鼠产生抗肺癌中和性抗体有关。     

Anti-murine Antibody Response to Mouse Monoclonal Antibodies in Cancer Patients

Although development of human anti-murine inununoglobulin antibody (HAMA) is often seen in patients receiving murine antibodies, the variety of methods used for detecting HAMA makes it difficult to compare directly the HAMA responses measured by different assays. In the present study, several parameters of the HAMA response to two murine monoclonal antibodies were evaluated. The anti-sialosyl Tn antibody MLS102 and anti-CA125 antibody 145-9, which were labeled with ¹¹¹ln, were injected intravenously into 17 colorectal cancer patients and 11 ovarian cancer patients for immnnoscintigraphy, respectively. HAMA was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. There was no difference in baseline HAMA levels before antibody injection between the two groups. HAMA developed more frequently in ovarian cancer patients receiving the 145-9 antibody than in colorectal cancer patients receiving the MLS102 antibody (9/11 vs. 6/17, P <0.05). No significant difference was observed in maximal HAMA levels between the two groups of patients. However, time to reach the maximal levels was delayed and the duration of the response seemed longer in ovarian cancer patients. Among 11 patients receiving the 145-9 antibody three patients became positive for HAMA more than 2 months after antibody injection and the other two had HAMA activity in their sera for more than 17 months. HAMA response was different between the two antibodies, and late onset or long duration of HAMA response against the 145-9 antibody suggests the importance of HAMA measurement in patients who receive a second injection of murine antibodies even after a long interval.