大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立

目的 对大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVECs)离体培养方法进行改良,建立该细胞的缺氧模型.方法 取出7日龄左右的Wistar大鼠的心脏,用胰蛋白酶和胶原酶二次消化法获得MMVECs,密度梯度离心法纯化细胞,计算细胞纯度;用免疫细胞化学方法检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原;将原代培养的细胞置于持续通人体积分数为1％O2、5％ CO2和94％N2的自制缺氧装置中,并在37℃孵箱中分别缺氧处理4、6、12、18、24h,各时间段均设置正常对照组;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测缺氧对大鼠MMEVCs增值活力的影响,Hoechst33342染色观察缺氧诱导该细胞凋亡形态学变化.结果 细胞形态特征及相关抗原检测证实:与仅用二次消化法培养细胞相比,密度梯度离心纯化后所得MMVECs纯度提高(P＜0.01);MTT比色实验:随着培养时间的延长,与正常对照组相比,各缺氧组OD值均有所降低,其中缺氧12、18和24h的OD值降低显著(P均＜0.01);从缺氧12h开始,各缺氧组的OD值逐渐降低,与12h相比均有显著差异(P＜0.01或P＜0.05);Hoechst33342染色:缺氧12h细胞开始出现核固缩、碎裂、蓝色浓染等典型的凋亡形态学变化,随着缺氧时间延长该变化更为明显.结论 该原代离体培养方法可以获得纯度较高的MMVECs;缺氧对MMVECs的增殖有抑制作用,本方法可以简便、有效地建立MMVECs的缺氧模型.     

中性粒细胞粘附对烧伤大鼠肺微血管内皮细胞［Ca ++ / ］i的影响

严重烧伤后早期肺组织微血管内有中性粒细胞的粘附贴壁现象，中性粒细胞对肺血管内皮细胞的粘附能使肺血管通透性增加，并依赖于粘附分子的介导［１］。血管通透性增加的机理主要为内皮细胞间隙增加，而这种改变则依赖于内皮细胞内钙离子浓度的增加。本研究则在上述研究的...     

雷公藤内酯醇对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞和中性粒细胞黏附的影响

目的 研究雷公藤内酯醇(TRI)对缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞和中性粒细胞黏附的影响。方法 培养分离大鼠心脏微血管内皮细胞,建立内皮细胞缺氧再给氧模型,分离大鼠的中性粒细胞,通过凝胶电泳迁移率(EMSA)测定核转录因子-κB(NF-κB)的活性,内皮细胞和中性粒细胞的黏附模型测定内皮细胞和中性粒细胞的黏附率。结果 大鼠心脏微血管内皮细胞在缺氧刺激后内皮细胞和中性粒细胞的黏附增加,NF-κB活性明显增高,再给氧后升高更明显;TRI组内皮细胞NF-κB活性明显降低(P<0.01),内皮细胞和中性粒细胞的粘附率显著下降(P<0.01),且呈剂量依赖效应。结论 TRI能明显抑制缺氧再给氧大鼠心脏微血管内皮细胞NR-κB活性,抑制内皮细胞和中性粒细胞的粘附。     

缺氧复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞活力的影响及机制研究

目的:研究缺氧复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)活力的影响及机制。方法:培养大鼠MMECs,制作缺氧复氧模型模拟缺血再灌注损伤。随机分为4组(n=24),正常对照组(N组)不作任何处理、缺氧复氧组(HR组)、LY294002预先给药+缺氧复氧组(LY294002组)、PDTC预先给药+缺氧复氧组(PDTC组),均进行缺氧2 h复氧2 h。复氧2 h时后MTT法测定细胞活力,Hoechst染色观察凋亡细胞显微结构。结果:与N组比较,HR组细胞活力降低(P<0.01);与HR组比较,LY294002组细胞活力降低(P<0.05),PDTC组细胞活力降低(P<0.01);与LY294002组比较,PDTC组组细胞活力降低(P<0.01)。结论:缺氧复氧可导致MMECs活力明显降低;PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与了缺氧复氧调控过程,该通路可促进MMECs活力增强。     

二氮嗪预处理对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞HIF-1α mRNA表达及增殖的影响

目的:观察二氮嗪(DZ)预处理对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)增殖和HIF-1α mRNA表达的影响.方法:培养SD大鼠MMECs,随机分为4组(n=24):正常对照组(N组)、缺氧/复氧组(H/R组)、二氮嗪组(DZ组)、DZ+Mito KATP特异性阻断剂5-羟葵酸(5-HD)预处理组(DZ+5-HD组).DZ组加入100 μmol/L DZ,DZ+5-HD组加入100 μmol/L DZ前2 h加入100 μmol/L 5-HD预处理2 h,然后和缺氧复氧组同样进行缺氧2 h复氧2 h.Hoechst染色观察凋亡细胞形态,MTT法测定细胞活力,RT-PCR检测HIF-1α mRNA转录水平.结果与N 组比较,细胞增殖率H/R组显著降低(P<0.01),HIF-1α显著升高(P<0.01);与H/R组比较,DZ组细胞增殖率显著升高(P<0.05),HIF-1α显著升高(P<0.01);DZ+5-HD组与H/R组比较差异无统计学意义.结论:DZ可上调HIF-1α mRNA的表达,促使细胞增殖,从而实现促进心肌微血管的新生.     

丹参对兔烧伤早期中性粒细胞与内皮细胞粘附抑制作用的实验研究

目的 研究丹参对严重烧伤早期中性粒细胞（PNM）与内皮细胞粘附的作用及机制。方法 采用兔30%Ⅲ度烧伤模型，24只日本大耳兔随机分为丹参组和生理盐水组，分别烧伤后即刻、2、4、8、16、24、48h取血分离获得PMN，与体外培养的兔血管内皮细胞作用测定PMN-EC粘附率及其PMN表面粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18值。结果 烧伤后即刻两组粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18及PMN-EC粘附率均升高，生理盐水组伤后4h达高峰；丹参组伤后2、4、8、16、24h的CD11a/CD18、CD11b/CD18显著低于生理盐水组。结论 丹参能降低粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18表达，抑制PMN-EC粘附，改善微循环及减轻PMN-EC粘附所致的组织损伤。     

阿魏酸钠对培养大鼠大脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究缺氧对脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）的损伤及阿魏酸钠（Sodium ferulate）对它的保护作用.方法：取体外培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞,置于95%N2和5%CO2的缺氧盒中12h造成内皮细胞缺氧.用透射电镜观察BMEC的超微结构变化.用内皮细胞线粒体活性和内皮细胞死亡率来评价内皮细胞活力,并用乳酸脱氢酶（LDH）漏出量作为评价损伤的指标.结果：体外培养大鼠脑皮质BMEC缺氧12h后,细胞超微结构损伤,细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加.阿魏酸钠可显著对抗缺氧对BMEC的损伤.结论：阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用.     

油茶皂苷对缺氧-复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的影响

目的研究油茶皂苷(SQS)对缺氧-复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的作用及可能的机制。方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧-复氧损伤模型,取培养细胞上清液测定LDH活性,分别测定HU-VEC存活率,中性粒细胞黏附率、线粒体丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。同法检测中性粒细胞黏附。结果缺氧-复氧可导致HUVEC损伤及中性粒细胞黏附的增加,表现为LDH活性、MDA水平及中性粒细胞黏附率显著升高,而SOD和GSH-Px活性显著下降;SQS呈浓度依赖性地对抗上述改变。结论SQS对缺氧-复氧诱导的HUVEC损伤有保护作用,其机制可能与其抗脂质过氧化和抑制白细胞黏附有关。     

丹参对兔内毒素血症中性粒细胞与内皮细胞粘附抑制作用的实验研究

目的 研究丹参对内毒素血症中性粒细胞(PMN)与内皮细胞(EC)粘附的作用及机制。方法 采用兔内毒素血症模型，将24只日本大耳兔随机分为内毒素血症组和丹参治疗组，分别于造模后即刻、2、4、8、16、24、48h取血分离获得中性粒细胞，与体外培养的兔血管内皮细胞作用，测定PMN—EC粘附率及其PMN表面粘附分子CD11a／CD18、CD11b／CD18值。结果 造模后即刻两组粘附分子CD11a／CD18、CD11b／CD18及PMN—EC粘附率均升高，内毒素血症组造模后4h达高峰，丹参治疗组造模后2、4、8、16、24h的CD11a／CD18、CD11b／CD18显著低于内毒素血症组。结论 丹参能降低粘附分子CD11a／CD18、CD11b／CD18表达，抑制PMN—EC粘附，改善微循环及减轻PMN—EC粘附所致的组织损伤。     

缺氧对家兔白细胞与肺微血管内皮细胞粘附的影响

目的：研究缺氧所至的兔多形核白细胞－肺微血管内皮细胞占附与缺氧时间的关系及探讨缺氧所致粘附分子变化在其中的作用。方法：利用培养的家兔微血管内皮细胞及体外缺氧模型,测定家兔多形核白细胞微血管内皮细胞的粘附率,运用免疫组化及流式细胞技术测定ＣＤ１８一ＣＤ５４的表达。结果：随着缺氧时间的延长,粘附率进行性增加,缺氧可明显加强ＣＤ１８和ＣＤ５４的表达,ＣＤ１８和ＣＤ５４单抗能明显降低粘附率的增加。结论：缺     

体外实验中缺氧对中性粒细胞凋亡的影响

目的：通过在缺氧条件下体外培养中性粒细胞,探讨缺氧对中性粒细胞凋亡的影响。方法：用全反式维甲酸诱导NB-4细胞分化获得中性粒细胞并建立缺氧模型,用流式细胞技术检测缺氧对中性粒细胞凋亡和坏死的影响以及缺氧后CD11b^＋细胞百分率的变化,用免疫荧光技术检测缺氧对中性粒细胞的细胞膜TNFR1表达强度的影响。结果：缺氧后中性粒细胞增殖减缓,凋亡和坏死受到抑制,细胞膜TNFR1表达下降,CD11b^＋细胞百分率稍有增高。结论：缺氧可以减缓中性粒细胞增殖,同时抑制中性粒细胞的凋亡。     

脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达的影响

目的:观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3d后,心脏内采血分离出血清;用新生7d SD大鼠脑内分离培养的微血管内皮细胞（RCMEC）移入厌氧培养箱造成缺氧模型;MTT法测定细胞活性;免疫细胞化学及Werstern blotting研究脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达。结果:缺氧18h脑溢安组OD值较对照组增高（P<0.05）。缺氧损伤的脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白表达增强,脑溢安血清组VEGF蛋白的表达水平高于对照组(P<0.01)。结论:缺氧可诱导脑微血管内皮细胞VEGF蛋白的表达;脑溢安可以上调VEGF蛋白的表达,这可能是脑溢安对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

缺氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞对共培养的人间充质干细胞分化的影响

目的 探讨缺氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endotheiial cells,BMECs)对人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响.方法 分离、培养并鉴定人骨髓MSCs和大鼠BMECs,在正常和缺氧两种条件下,分别以间接和直接共培养两种方式对MSCs进行诱导分化,用流式细胞术和免疫荧光细胞化学法观察和分析诱导后MSCs的胎肝激酶-1(fetal liver kinase-1,Flk-1)和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的表达.结果 正常间接共培养未能诱导MSCs表达vWF和Flk-1蛋白,缺氧间接共培养和正常条件下的直接共培养均能诱导MSCs开始表达Flk-1蛋白,而vWF染色仍为阴性,缺氧条件下直接共培养表达Flk-1蛋白的MSCs比正常条件增多,而且部分Flk-1阳性细胞开始同时表达vWF蛋白.结论 BMECs能够通过细胞直接接触诱导共培养的MSCs开始向内皮分化,缺氧条件下的直接共培养BMECs能诱导更多的MSCs更彻底地向内皮分化.     

缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞中钠氢交换体-1的表达及活性影响

目的 探讨缺氧-复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(rat myocardial microvascular endothelial cells,RMMEVCs)中缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)表达以及钠氢交换体-1(hydrogen exchanger-1,NHE1)的...     

血管内皮生长因子对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨缺氧对培养人静脉内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预性影响。方法 （1）人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定。（2）建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型,TUNEL法观测不同缺氧时间（0、12、24、48h）对内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预作用。结果 随缺氧时间延长,NUVECs凋亡率显著升高,血管内皮生长因子抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡。结论 内皮细胞的过渡凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素,血管内皮生长因子通过抑制内皮细胞凋亡,而具有内皮细胞保护作用。     

血管生成因子对心脏微血管内皮细胞分泌血管形成蛋白-2的影响

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血管形成蛋白-1(Ang-1)对人源性心脏微血管内皮细胞(HCMECs)分泌血管形成蛋白-2(Ang-2)的影响。方法在正常或缺氧缺血清培养条件下,分别将100 ng/ml VEGF或Ang-1加入HCMECs中,孵育24 h,采用酶联免疫吸附法检测Ang-2水平。结果在正常培养条件下,VEGF处理组Ang-2水平高于空白组(P<0.05),而Ang-1处理组Ang-2水平低于空白组(P<0.05);在缺氧缺血清培养条件下,Ang-2分泌量显著性增加,VEGF处理组Ang-2水平高于缺氧缺血组、Ang-1处理组、空白组(P<0.05)。结论缺氧缺血清和VEGF处理均提高HCMECs分泌Ang-2,Ang-1处理可以降低HCMECs分泌Ang-2。     

缺氧对培养的肺动脉内皮细胞血管紧张素转换酶释放的影响

肺血管局部的肾素血管紧张素系统在缺氧性肺动脉高太的发生中所起的作用尚不清楚，为此，动态观察了缺氧对培养的新小牛肺人皮细胞（ＰＡＥＣ）的血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）活性的影响，结果发现：培养的ＰＡＥＣ在２．５％Ｏ２缺氧１．５ｈ末，培养液ＡＥＣ活性明显增高（与常氧组及０％，Ｏ２组相比Ｐ〈０．００１），随缺氧时间延长３ｈ～１２ｈ，ＡＣＥ活性与１．５ｈ相比有所降低，但仍高于常氧组（Ｐ〈０．０５），２４和４８     

苦豆碱对缺氧/复氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨苦豆碱对缺氧/复氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法：培养人脐静脉内皮细胞,随机分为对照组、缺氧/复氧组、苦豆碱（20、50和100 mg/L）预处理组和苦豆碱预处理+LY294002组,并进行相应处理。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,比色法检测Caspase?3活性,Western blot法检测Bax、Bcl?2、Akt和p?Akt蛋白表达。结果：苦豆碱可提高缺氧/复氧抑制的人脐静脉内皮细胞增殖（P < 0.05）,显著减少缺氧/复氧诱导的细胞凋亡（P < 0.05）,逆转缺氧/复氧引起的Caspase?3活性和Bax表达的增加、Bcl?2表达的降低,提高Bcl?2/Bax值（P < 0.05）。此外,苦豆碱预处理可明显上调缺氧/复氧降低的p?Akt蛋白表达（P < 0.05）,而PI3K/Akt抑制剂LY294002明显逆转苦豆碱抗缺氧/复氧诱导的凋亡作用（P < 0.05）。结论：苦豆碱通过激活PI3K/Akt通路抑制缺氧/复氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。