体外培养表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究

目的探讨应用表皮干细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性。方法运用黏附实验将人表皮干细胞分选出来后大量培养，将成纤维细胞和表皮干细胞转移到真皮底物上构建组织工程皮肤，并将之移植于裸鼠皮肤缺损模型，于术后第1、2、4周处死动物，收集标本，进行组织学、透射电镜及免疫组织化学检查。结果组织工程皮肤移植后4周具备完整的表皮层和真皮层，表皮层中具备基底层、棘层、颗粒层和角质层。表皮细胞间还可以看到有桥粒、半桥粒、角质透明颗粒和粗张力微丝柬。表、真皮层间有连续的、完整的基底膜。真皮网架破坏明显，大量的成纤维细胞增殖活跃，胶原纤维排列整齐，有丰富的毛细血管。结论本研究所构建的组织工程皮肤组织学形态和超微结构上已接近于正常的皮肤，从而为临床修复皮肤缺损的研究打下了坚实的理论和实践基础。     

含表皮干细胞组织工程皮肤的构建研究

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞研制一种增殖能力强的具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞,用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞,接种在3T3细胞滋养层上,将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的Ⅰ型胶原基质网架的两侧,在液面下培养3周后,改为气-液界面培养,构建含表皮干细胞的复合皮肤,并进行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果表皮干细胞呈克隆状生长,G0/G1期细胞和α6briCD71dim细胞百分率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),实验组K19免疫细胞化学染色呈阳性,对照组呈阴性。光镜下观察可见体外培养的含表皮干细胞的人工复合皮肤,具有表皮和真皮,表皮层由基底至浅层可见3~5层细胞,角蛋白免疫组化染色阳性。结论表皮干细胞种植于胶原海绵膜上,可生成全层组织工程皮肤,具备了同正常皮肤类似的结构,表明其具有在体外分化成表皮的能力。     

角质干细胞及其在皮肤组织工程中的应用前景

表皮是一种持续更新的组织，其更新过程始于基底层的角质干细胞的增殖与定向分化。在向上迁移的过程中，经历程序化的终末分化，最后成为死亡的角化扁平细胞从皮肤表面脱落。在正常稳定状态下，干细胞的增殖与表层细胞的丢失保持着精确的平衡^[1]。角质干细胞有两个重要特征：一是在体内属于静止的或慢细胞周期的细胞；二是具有无限的增     

表皮干细胞的快速高效分离

目的 寻找一种快递高效分离组织工程化皮肤种子细胞-皮肤干细胞的方法.方法 取成人手术切除之包皮,利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法,快速分离表皮干细胞,并对其进行鉴定及相关的生物学特性的研究.结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶,可在3小时内快速分离到表皮干细胞及成纤维细胞,经流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定,表皮细胞群体中角蛋白19(K19)阳性表达的细胞即表皮干细胞约占18%,但是其体外短期扩增仍较困难.结论 利用胶原酶消化法可在短期内高效分离到用于构建组织工程化皮肤的种子细胞,这为快速构建组织工程化皮肤提供了可能.     

组织工程皮肤种子细胞的同期快速分离

目的 寻找一种快速可行的同期分离组织工程皮肤种子细胞——表皮细胞及成纤维细胞的方法。方法 取手术切除包皮，利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法，同期分离表皮细胞及成纤维细胞，观察细胞形态。对表皮细胞及表皮干细胞行PAN—FITC、K19-FITC荧光免疫染色及K19流式细胞仪鉴定；对成纤维细胞行波形蛋白FITC免疫荧光鉴定。并分别对两种细胞培养7d，观察其生长情况。结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶，在3h内快速分离得到表皮细胞及成纤维细胞，免疫荧光染色表皮细胞PAN—FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性，流式细胞仪鉴定其K19阳性表达的细胞接近17％。表皮细胞培养48h开始呈克隆样增长，至7d生长停滞，向终末的角细胞分化。成纤维细胞体外培养7d可扩增100倍，波形蛋白FITC免疫荧光染色呈阳性。结论 利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法可在3h内同期分离到用于构建复合型组织工程皮肤的种子细胞，为复合组织工程皮肤的快速构建提供了可能。     

利用胎儿表皮干细胞构建组织工程皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损创面

DMEM培养基、角质形成细胞无血清培养基、重组人表皮生长因子、霍乱毒素、dispase酶（美国Gibco公司），小鼠Ⅳ型胶原、L-谷氨酰胺、纤维蛋白、牛胰岛索（美国Sigma公司）．角蛋白14单克隆抗体、角蛋白19、整合素B，（美国ADI公司），重组人成纤维细胞生长因子2（FGF2，珠海亿胜生物制药有限公司）．凝血酶（奥地利Immuno AG公司），聚乙醇酸（PGA，日本Synthecon公司，[第一段]     

表皮干细胞活性复合皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞，研制一种增殖能力强具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞，用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞，接种在3T3细胞滋养层上，将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧，在液面下培养2周后，改为气-液界面培养，构建复合皮肤，移植到裸鼠全层皮肤缺损处，以表皮细胞胶原海绵复合皮肤和无细胞接种的胶原海绵膜作为对照。术后进行大体观察，在第7、14、21天取材行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强，新生的皮肤瘢痕轻，形态满意，创面愈合的速度和质量均优于对照组。结论在胶原海绵上用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强，较好地解决了种子细胞的老化问题，可望成为一种较为理想的皮肤替代物。     

组织工程皮肤构建的研究进展

组织工程学是生物工程领域的一门新兴学科,是目前学术界的研究热点。利用组织工程的原理构建人工皮肤替代物,用于皮肤移植,可以有效解决临床上皮肤缺损修复,供皮不足的难题。文中从表皮、真皮、复合皮三个方面就近年来组织工程皮肤构建的研究进展及干细胞在这一领域的应用作一综述,并分析组织工程皮肤目前存在的问题,展望未来发展方向。     

干细胞构建组织工程皮肤的研究进展

组织工程学是近年来细胞生物学、工程材料学和临床医学交叉发展起来的一门新兴学科。组织工程学最基本的思路是在体外将分离的种子细胞接种到具有一定空间结构的载体支架上,通过细胞与细胞之间的相互作用形成具有一定结构功能的组织或器官。从组织工程学的观点来看,人工皮肤主要有三类：①表皮替代物,即培养表皮片;②真皮替代物,即胶原凝胶、胶原海绵合成膜、     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

Donor variation and loss of multipotency during in vitro expansion of human mesenchymal stem cells for bone tissue engineering.

The use of multipotent human mesenchymal stem cells (hMSCs) for tissue engineering has been a subject of extensive research. The donor variation in growth, differentiation and in vivo bone forming ability of hMSCs is a bottleneck for standardization of therapeutic protocols. In this study, we isolated and characterized hMSCs from 19 independent donors, aged between 27 and 85 years, and investigated the extent of heterogeneity of the cells and the extent to which hMSCs can be expanded without loosing multipotency. Dexamethasone-induced ALP expression varied between 1.2- and 3.7-fold, but no correlation was found with age, gender, or source of isolation. The cells from donors with a higher percentage of ALP-positive cells in control and dexamethasone-induced groups showed more calcium deposition than cells with lower percentage of ALP positive cells. Despite the variability in osteogenic gene expression among the donors tested, ALP, Collagen type 1, osteocalcin, and S100A4 showed similar trends during the course of osteogenic differentiation. In vitro expansion studies showed that hMSCs can be effectively expanded up to four passages (approximately 10-12 population doublings from a P0 culture) while retaining their multipotency. Our in vivo studies suggest a correlation between in vitro ALP expression and in vivo bone formation. In conclusion, irrespective of age, gender, and source of isolation, cells from all donors showed osteogenic potential. The variability in ALP expression appears to be a result of sampling method and cellular heterogeneity among the donor population.     

组织工程皮肤修复皮肤缺损的初步实验研究

目的:探讨组织工程皮肤移植的手术方法、注意事项及临床效果。方法:2.5～3月龄约克猪6只,制备全厚皮肤缺损创面48个,随机分为三组,每组16例。A组:组织工程全层皮肤移植组;B组:组织工程真皮和自体表皮复合移植组;C组(对照组):自体全厚皮片移植组。观察实验组与对照组间的治愈率。结果:A组治愈率75.00%,B组治愈率87.50%,C组治愈率93.75%,三组比较无显著性差异(χ2=2.34,P>0.05)。结论:组织工程皮肤修复皮肤缺损是可行的。     

Human mesenchymal stem cell implantation and collagen modification as a tool for tissue engineering

Tissue engineering, in all its aspects, is a focus of increasing interest. Optimum vascularization has to be ensured ahead of transferring experimental designs to clinical applications. Our group searched for matrix modifications and cell sources liable to increase vessel formation in engineered tissue. Notwithstanding the ethical issues, adult human mesenchymal stem cells (hMSC) seemed to offer as unlimited a possibility of proliferation and differentiation as embryonic stem cells. These series of experiments focused on the differentiation capability of adult stem cells and organisation in modified collagen sponges. Adult mesenchymal stem cells were cultured to the second generation. Two different groups were formed: Group A cells remained in medium without additional growth factors. Group B cells were cultured in angiogenic differentiation medium. On day 21, the cells of both groups were detached and implanted into different collagen sponges: unmodified collagen sponges and EDC/NHS [1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinmide (NHS)] cross-linked and heparinized collagen scaffolds. Twenty-one days later, the sponges were prepared for the histological evaluation. After 3 weeks in culture, the cells of group B showed phenotypic endothelial cell characteristics and expressed von-Willebrand factor. Enhanced proliferation and invasion on cross-linked and heparinised matrices were obtained with both cell types (A and B). In addition, the stem cell derived endothelial cells formed organised structures throughout the scaffolds. Obtained data revealed the differentiation capability of adult MSC into endothelial cells and organisation in modified collagen matrices. This approach might lead to optimised vascular incorporation in tissue replacement.M. Markowicz, A. Heitland have contributed equally in this work.     

间充质干细胞在软骨组织工程中的应用

间充质干细胞具有高度自我更新能力,能够分化为各种类型的细胞.近20年间充质细胞在软骨组织工程中得到应用,动物实验显示了良好的软骨修复潜能,成为软骨组织工程的理想的细胞来源.组织工程和干细胞技术已经确定为对软骨缺损有效的治疗方法,间充质干细胞有望在软骨组织工程中得到更广泛的应用.本文对间充质干细胞的特性和在组织工程中的应用进行了综述.     

转基因骨髓间充质干细胞在软骨组织工程中的研究与应用

软骨组织工程学是用工程学和生命科学的原理和方法、依靠支架材料承载被分离的软骨细胞或其前体细胞并植入宿主体内、支架材料在宿主体内逐渐降解并释放细胞、从而形成新的有功能的软骨组织产品的技术。但目前存在的自身不足为：细胞因子的量控、种子细胞易老化、增值缓慢；细胞的定向分化、细胞与生物材料的亲和性以及动物组织基因人源化等。     

人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪的研究

目的：将体外以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）与蚕丝蛋白支架初步构建的组织工程脂肪移植到大鼠体内,观察其演变过程。方法：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培养10天后,进行成脂诱导;6周后将其移植到Wi st ar大鼠后肢肌肉内,同时,以同体积支架材料作为对照;分别于移植后4周和8周取材,行油红O染色、HE染色以及扫描电镜观察。结果：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培养及成脂诱导6周后,见大量成脂样细胞生成,并与支架牢固粘附。移植4周,移植物体积略小,质稍硬,表面有透明薄膜形成,膜中分布新生血管网;油红O染色见支架内新生脂肪组织及细胞呈橙红色;HE染色显示支架网眼内有新生脂肪组织,并可见少量炎性细胞浸润;扫描电镜见支架网眼内有球形、表面光滑的脂肪细胞。移植8周,移植物体积进一步缩小,质变软,表面薄膜内血管网丰富;油红O染色见支架中着橙红色组织较前明显增多,部分呈片状融合;HE染色显示新生脂肪明显增多,仍有少量炎性细胞浸润;扫描电镜显示脂肪细胞较前增生明显。对照组同样可见炎性细胞浸润,未见新生脂肪组织生成,支架材料8周时较4周时降解更加明显。结论：随着时间推移,蚕丝蛋白支架网眼内脂肪细胞逐渐增多,支架材料在体内呈现逐步降解趋势,说明体内环境有利于组织工程化脂肪的进一步形成。同时,也提示支架材料在组织相容性方面尚存不足。     

复合骨髓间充质干细胞的组织工程皮肤修复烧伤创面的实验研究

目的：探讨用复合骨髓间充质干细胞（MSCs）的组织工程皮肤修复烧伤创面的可行性。方法：利用自行研制的烫伤仪制备烫伤创面，以MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤修复烫伤创面，观察愈合时间和收缩率等。结果：移植2周后实验组创面基本愈合，表皮角质化，真皮层毛细血管增生，6周后创面收缩到原始面积的61％。结论：含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进了烧伤创面的愈合，获得了较理想的愈合效果，为临床治疗提供了新的思路。     

表皮干细胞表型的成纤维样细胞在瘢痕中的表达

目的：探寻正常皮肤与增生性瘢痕中表皮干细胞标记物的表达,从组织学角度探讨表皮干细胞参与瘢痕增生的证据。方法：术中切取8例伤后6月增生性瘢痕患者的瘢痕组织及同例患者的正常皮肤,将其制备切片并分组,用E1iviSion二步法免疫组织化学检测表皮干细胞表面标志物β1整合素和CK19的表达,计数阳性细胞并进行统计学处理。结果：瘢痕组织真皮层中,表达阳性细胞数β1整合素和CK19较正常皮肤β1整合素和CK19明显增多（P〈0．05）,成纤维细胞数显著增多。结论：在病理性瘢痕的发生中,表皮干细胞可能在细胞因子作用下分化为成纤维细胞,从而参与瘢痕形成。     

Tooth tissue engineering: optimal dental stem cell harvest based on tooth development

Our long-term objective is to devise reliable methods to generate biological replacement teeth exhibiting the physical properties and functions of naturally formed human teeth. Previously, we demonstrated the successful use of tissue engineering approaches to generate small, bioengineered tooth crowns from harvested pig and rat postnatal dental stem cells (DSCs). To facilitate characterizations of human DSCs, we have developed a novel radiographic staging system to accurately correlate human third molar tooth developmental stage with anticipated harvested DSC yield. Our results demonstrated that DSC yields were higher in less developed teeth (Stages 1 and 2), and lower in more developed teeth (Stages 3, 4, and 5). The greatest cell yields and colony-forming units (CFUs) capability was obtained from Stages 1 and 2 tooth dental pulp. We conclude that radiographic developmental staging can be used to accurately assess the utility of harvested human teeth for future dental tissue engineering applications.