新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤增殖的影响

目的构建人CyclinE建新靶点的干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤U251细胞,观察CyclinE表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的增殖能力的变化,为进一步研究CyclinE表达受抑制后对人脑胶质瘤细胞质和细胞核蛋白组学的影响及人脑胶质瘤发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法①构建4个新靶点Cyclin E干扰RNA的真核表达载体后,用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否。②用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤U251细胞株,通过RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量,选出干扰效果最好的1个。③用塞唑蓝（MTT）法检测CyclinE沉默后细胞增殖能力的变化。结果①成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体,即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。②CyclinE mRNA表达明显受到抑制,并获得效果最好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。③PCyclinE-1-U251组细胞与两对照组相比增殖能力减弱。结论成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体,与对照组比增殖能力削弱。     

稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系。方法用Lipofectamine^TM 2000法将已构建好的特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒P^Genesil-1-CDK2转染入HepG2细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞株，并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白，利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA的表达。结果倒置荧光显微镜观察与KT-PCR检测，结果显示获得重组质粒P^Genesil-1-CDK2稳定转染的细胞克隆。结论建立了可稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系，为进一步研究细胞周期调控蛋白激酶对肝细胞癌的治疗与开发新的特异性药物提供了实验依据。     

核干细胞因子的RNA干扰对胶质瘤U251细胞的影响

目的探讨U251细胞株中NS基因表达及被干扰后,U251细胞株在mRNA、蛋白表达水平及细胞增殖变化情况。方法考察U251细胞NS-mRNA和NS-protein的表达水平;合成人类NS基因siRNA片段;转染至U251细胞中,RT-PCR和Westernblot检测转染前后U251细胞中mRNA及蛋白表达水平;MTT检测细胞增殖率。结果 U251细胞NS-mRNA和NS-protein的表达分别为178.91%和97.55%;siRNA转染U251细胞后NS-mRNA抑制率60.79%,NS-protein抑制率94.00%;MTT结果显示干扰72h后细胞增殖抑制率为31.3%。结论 NS基因siRNA片段转染U251细胞后,NS基因表达被特异性沉默,细胞增殖受到抑制。     

氯乙烯对肝细胞周期G1/S关卡相关蛋白表达影响

目的 探讨氯乙烯(VCM)对细胞周期G₁/S关卡功能影响及可能的机制。方法 将人正常肝细胞HL-7702暴露于VCM气体(体积分数为0.8%、2.5%、7.5%、15.0%和30.0%)和空气(对照组)48 h后用流式细胞仪检测HL-7702细胞周期;Western blot测定细胞中G₁/S关卡相关蛋白表达水平。结果 染毒48 h后,在<7.5%剂量时,HL-7702细胞G₀/G₁期细胞百分数随染毒剂量增加呈上升趋势,与对照组[(73.35±1.56)%]比较,7.5%剂量组G₀/G₁期细胞百分比[(78.52±4.46)%]升高,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组[(12.85±0.02)%]比较,2.5%剂量组S期细胞百分比[(10.97±0.17)%]下降,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4)和P16蛋白表达量均呈上升趋势,与对照组比较,7.5%剂量组HL-7702细胞CDK4、P16表达[分别为(1.43±0.51)、(0.80±0.30)]均升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 低剂量VCM染毒可使肝细胞发生G₁期阻滞,高剂量时G₁期阻滞作用消失;其机制主要与上调P16、CDK4蛋白表达有关。     

应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达

目的探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPOR mRNA的表达情况。 方法选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象。利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择最佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率。 结果①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×10¹⁴TU/L。②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量最高,MOI值为1的荧光蛋白表达量最低。③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69%,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制。 结论成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础。     

CyclinE干扰RNA对大鼠PC12细胞增值的影响

目的利用脂质体法转染CyclinE的干扰RNA真核表达载体,然后检测细胞的增值速率,探讨CyclinE在神经细胞中的作用,为帕金森病的研究提供有价值的资料。方法 1.利用脂质体法转染CyclinE的干扰RNA真核表达载体,用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达量。2.利用MTT法检测转染后细胞的增值速率。结果 1.倒置荧光显微镜观察显示,成功的转染了CyclinE的干扰RNA真核表达载体。2.MTT法检测显示,转染组细胞的增值速率明显低于未转染组和阴性对照组。结论 RNA干扰CyclinE后使得PC12细胞的增值速率减慢。     

胶质瘤治疗的新靶点:TGF-β2

胶质瘤是原发于颅内预后较差的肿瘤,尤其是胶质母细胞瘤,其中位生存期不到1年半。目前针对于胶质瘤的治疗包括手术治疗、放射治疗、化疗,新兴的免疫治疗也逐渐获得临床医生的认可。转化生长因子-β2在胶质瘤的免疫过程中起到了非常重要的作用。本文主要阐述TGF-β2在胶质瘤中的作用及未来治疗策略,从而为治疗胶质瘤提供新的治疗途径。     

应用RNA干扰沉默NOB1基因对卵巢癌HEY细胞增殖和周期的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制NOB1基因的表达,并在卵巢癌HEY细胞上观察NOB1下调对细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:NOB1特异性siRNA构建于慢病毒载体,感染卵巢癌HEY细胞后,Real-time PCR和Western验证NOB1的抑制效率,MTT、Brdu实验观察NOB1基因沉默对HEY细胞增殖的作用,PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:shRNA慢病毒感染HEY细胞能够将NOB1基因mRNA表达抑制82.2%,蛋白表达也显著降低,MTT和Brdu实验显示细胞增殖水平显著变弱,流式细胞仪检测证实细胞出现G1期阻滞。结论:应用RNA干扰技术能在HEY细胞上有效沉默NOB1基因,并降低卵巢癌细胞的增殖能力,使细胞阻滞在G1期。     

CD147对LNCaP-AI细胞生长影响

目的 观察RNA干扰白细胞分化抗原147（CD147）基因对雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI细胞增殖、细胞周期和凋亡影响。方法 脂质体2000转染靶向CD147基因的shRNA质粒到LNCaP-AI细胞中,通过G418筛选获得稳定低表达CD147细胞株。利用溴化四氮唑蓝法和流式细胞术检测CD147基因沉默后对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果 与对照组比较,沉默CD147表达后明显抑制LNCaP-AI细胞增殖（P<0.05）;细胞周期出现在G₀/G₁期细胞百分率从（69.76±3.83）%增加到（79.40±4.02）%,差异有统计学意义（P<0.05）;S期和G₂/M期细胞百分率分别从（23.51±2.58）%、（6.73±0.70）%减少到（17.03±2.02）%和（3.57±0.21）%,差异有统计学意义（P<0.05）,呈现G₀/G₁期细胞阻滞;但不引起细胞凋亡。结论 RNA干扰CD147基因能够抑制LNCaP-AI细胞增殖,诱导细胞周期异常。     

长链非编码RNA AGAP2-AS1在胶质瘤增殖过程中作用机制的研究

目的 探究长链非编码RNA AGAP2-AS1在胶质瘤增殖过程中的作用机制.方法 选取2018年12月—2019年11月期间的30例胶质瘤患者为观察组,同时期的30例脑外伤患者为对照组.比较两组的组织AGAP2-AS1 mRNA表达量、Ras及ERK1/2蛋白表达情况,并比较观察组中不同分级胶质瘤的AGAP2-AS1 ...     

RNA干扰对疱疹病毒的抑制作用

疱疹病毒是儿童感染性疾病的常见病原体,可表现为潜伏感染和持续感染,甚至引起肿瘤的发生,严重威胁儿童健康。抗病毒药物作为目前疱疹病毒感染性疾病首选的治疗方法,其应用越来越受到药物毒副作用以及耐药问题的限制。RNA干扰(RNAi)作为一种新型的基因阻断技术与传统的基因敲除技术及反义技术相比,具有效能高、特异强、毒性低、作用迅速、操作简便等优点,因此它作为一种新型的抗病毒疗法被寄予厚望。此文就RNAi对疱疹病毒抑制作用的研究进展作了综述。     

人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制

目的构建人神经病靶标酯酶（NTE）双链RNA的稳定表达载体。方法用SpeI和XhoI将pSUPER质粒中的H1 RNA聚合酶Ⅲ启动子及多克隆位点部分切下替换pcDNA3．1（＋）载体中的巨嗜细胞病毒（CMV）启动子及其多克隆位点，构建了适合在哺乳动物细胞中表达具有干涉作用的小RNA的载体pSUPER／neo，进而将针对NTE表达的双链DNA插入到Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切的载体pSUPER／neo中构建NTE的双链RNA表达载体pSUPER/neo-NTE，后者被转染到COS7和SH-SYSY细胞中，采用蛋白质杂交和酶活力测定的方法，检测其表达效率并验证载体构建的TF确性。结果构建了适合在真核细胞用抗生素筛选的NTE双链RNA表达载体pSUPER／neo-NTE。蛋白质杂交检测显示，转染细胞能有效抑制外源性NTE的表达；酶活力测定则显示其能有效地抑制内源性NTE的表达．结论采用启动子替换的策略，成功构建了NTE双链RNA的表达载体并在哺乳动物细胞内有效抑制NTE的表达。     

RNA干扰在神经退行性疾病发病机制研究和治疗方面的进展

神经退行性疾病是一类适用于RNA干扰疗法的疾病,其发病机制的复杂性又使RNA干扰成为探讨其发病机制的有效工具。本文针对RNA干扰在神经退行性疾病发病机制研究和治疗方面的应用进展进行了综述。通过小RNA干扰技术,在神经退行性疾病的模式动物中找到一批RNA的基因,创建模式动物中RNA组数据库,发现或/和揭示与一些重要生命现象和神经退行性疾病相关的RNA,建立一些以RNA为靶标的预防和治疗技术。     

赛莱西布对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡影响

目的探讨选择性环氧合酶-2（cox-2）抑制剂赛莱西布（celecoxib）对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度的赛来西布处理HepG2细胞，分别应用四甲基偶氮噻唑蓝试验、DNA梯度电泳法、放射免疫法检测赛亚西布对HepG2细胞增殖和凋亡及其COX-2活性的影响；应用免疫印迹法和比色法检测赛莱西布对HepG2细胞胱氨酸蛋白酶3（clasepase-3）蛋白质的表达及活性的影响。结果12．5，25，50μmol／L的赛莱西布作用于HepG2细胞后，HepG2细胞增殖受抑制，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；赛莱西布干预组HepG2细胞DNA明显降解，可见细胞凋亡特征性梯状DNA条带；干预组HepG2细胞caspase3蛋白表达及活性均明显升高。与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；赛莱西布明显抑制HepG2细胞cox-2活性。与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论赛莱西布可通过cox-2通路和easpase3通路抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。     

RNA干扰技术在德国小蠊功能基因研究中的应用

德国小蠊是我国蜚蠊的优势种,在医学与经济方面的重要性和危害性,以及作为多种科学问题的重要研究模型决定了其在生物科学研究领域的重要地位,而在后基因组时代对功能基因的研究成为生物学研究的基础。RNA干扰是外源性或内源性双链RNA诱发的在mRNA水平上进行的基因沉默现象,从而阻止某一基因功能在细胞或整体水平上的表达,具有高效性和特异性等优势。鉴于蜚蠊重要研究价值与RNA干扰表现出的技术优势,该文简要介绍RNA干扰技术分子机制,重点对德国小蠊功能基因的最新研究结果进行综述。