胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

褪黑素对SD大鼠胚胎中脑神经干细胞增殖和分化的影响

目的：脑内神经发生受多种病理生理因素调节，既往的研究表明褪黑素（Melatonin，MT）具有广泛的神经营养和神经保护作用，本研究观察MT对SD大鼠胚胎中脑神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法：分离培养孕13-14天SD大鼠胚胎的中脑NSCs，用MTS方法测定MT对NSCs增殖的影响；通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光方法检测MT对NSCs分化方向的调节作用；RT-PCR和Western blot方法检测NSCs上MT受体及脑源神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的表达。结果：MT（0．05、0．1和1nM）均可促进NSCs的增殖，与对照组相比具有显著性差异（P〈0．05或P〈O．01）；而且，MT明显促进中脑NSCs分化时多巴胺能神经元标志蛋白酪氨酸羟化酶（TH）表达（P〈O．05），抑制胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达；此外，MT可使NSCs内BDNF和GDNF的表达水平显著提高（P〈0．01）；同时我们还发现MT受体的两个亚型MTl和MT2在中脑NSCs均有表达，提示可能参与了对NSCs的调节作用。结论：本研究发现，MT不仅可以促进中脑NSCs的增殖，还显著提高NSCs向多巴胺能神经元方向的分化，而抑制其向星形胶质细胞的分化，这可能与MT上调BDNF和GDNF的表达有关。以上结果可为MT临床治疗某些老年性神经疾患并改善部分临床症状的作用机理提供线索。     

脑缺血大鼠脑脊液对神经干细胞存活及分化的影响

目的：探讨脑缺血大鼠脑脊液对新生大鼠海马神经干细胞生存及分化的影响。方法：将脑缺血大鼠脑脊液加入神经干细胞的培养液中，观察神经干细胞存活及贴壁细胞团的分化．并应用免疫细胞化学技术对神经干细胞分化情况进行鉴定。结果：悬浮培养细胞实验组较对照组有明显差异；贴壁培养细胞分化的细胞数量较对照组明显增多。结论：脑缺血大鼠脑脊液可促进体外培养神经干细胞存活，并且促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。     

BFGF、EGF联合应用对新生大鼠海马神干细胞分化的影响

目的:探讨EGF和bFGF联合应用后对新生大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响。方法:联合应用EGF和bFGF培养海马神经干细胞及诱导贴壁的细胞分化,并用免疫细胞化学技术研究神经干细胞的分化情况。结果:bFGF和EGF联合应用可以明显扩增海马神经干细胞,并诱导细胞向神经元和星形胶质细胞分化。结论:bFGF和EGF除了具有促神经干细胞有丝分裂作用外,还可以诱导神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化鉴定

目的建立神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术。观察神经干细胞生长、增殖特点。方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞及其分化结果。结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有巢蛋白(nestin)表达阳性细胞,显微镜下观察见典型的干细胞特征。分化为3种神经细胞类型:神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞,并经过分化鉴定确认。     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

黄芪甲苷对体外培养神经干细胞分化作用的研究

目的观察黄芪甲苷对体外培养神经干细胞分化作用的影响。方法利用无血清培养技术在体外对新生Wistar大鼠海马区与神经干细胞进行培养,观察相同接种密度条件下,不同浓度黄芪甲苷（20mg／L,40ms／L,80mg／L）对神经干细胞分化作用的影响,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其分化后细胞。结果从新生大鼠海马区分离出的神经干细胞经鉴定呈nestin阳性,且加入黄芪甲苷组所表达的神经干细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较对照组明显增多（17．60±2．85vs15．65±2．29;24．10±3．13VS21．95±2．37;P〈0．05）。结论黄芪甲苷对体外培养大鼠海马区神经干细胞的分化有促进作用。     

神经干细胞中Notch和生长因子/细胞因子信号通路间的相互作用

多能神经干细胞增殖和分化的精确控制对神经系统的正常发育是至关重要的。在哺乳动物中枢神经系统发育过程中，3种主要神经细胞来源于神经干细胞（NSCs）：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。成纤维细胞生长因子（FGF2）和表皮生长因子（EGF）参与NSCs的调控。在晚期发育中这些生长因子，特别是骨形成蛋白（BMPs）和白介素-6家族细胞因子也调节NSCs对神经胶质原信号的应答。通过Notch跨膜受体的信号则是NSCs另一个重要的调节机制。     

谱系限制性神经前体细胞的体外培养

目的 观察神经前体细胞在体外贴壁培养方式下的生长特性,为选择合适类型的细胞移植治疗脊髓损伤提供参考。方法 取孕13．5d大鼠胚胎脊髓组织．体外贴壁方法培养神经前体细胞。观察细胞生长形态学变化。培养72h后行BrdU增殖率检测，Nestin、PSA-NCAM、A2B5抗体荧光鉴定和流式细胞检测。部分细胞行血清诱导分化试验。结果 培养细胞呈散在状态生长。培养72h细胞BrdU增殖率为（9．11±1．82）％，Nestin、PSA—NCAM、A2B；抗体荧光反应均呈阳性．以NCAM、A2B5抗体表达为主（〉80％）。经血清诱导能逐渐分化成熟，表达NF-200．GFAP-Gal-C荧光抗体。结论 贴壁培养细胞以谱系限制性神经前体细胞为主（〉80％）。培养细胞经血清诱导，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

银杏叶提取物对结肠癌SW480细胞增殖的影响

目的研究银杏叶提取物（EGB）对SW480结肠癌细胞生长增殖的影响。方法体外培养人结肠癌SW480细胞后,给予不同浓度（100,200,300,400,500 mg·L^-1）银杏叶提取物干预后,采用CCK-8检测人结肠癌SW480细胞的增殖抑制率,选择最佳作用浓度;随后,在此作用浓度下观察EGB作用不同时间对人结肠癌SW480细胞增殖抑制率的影响,并通过Western blot检测人结肠癌SW480细胞内Ki67和PCNA的表达情况。结果银杏叶提取物可抑制结肠癌SW480细胞的增殖,且随着作用浓度增加和作用时间的延长其抑制作用逐渐增强;300 mg·L^-1银杏叶提取物对结肠癌SW480细胞增殖的抑制效果最明显。银杏叶提取物干预的结肠癌SW480细胞内Ki67和PCNA的表达均明显下调。结论银杏叶提取物可呈浓度和时间依赖性地抑制结肠癌SW480细胞的增殖。     

瘦素对绝经后骨质疏松病人骨髓间质干细胞定向分化后增殖的影响及相关机制研究

目的 探讨瘦素对绝经后骨质疏松病人骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖分化的影响以及相关机制研究.方法 留取20例因股骨颈骨折行股骨头置换股骨头,分离获得骨髓间质干细胞,利用成骨诱导培养液诱导培养,检测BMSCs诱导前后细胞表面抗原表达,将细胞分为5组:A组、B组、C组和D组分别加入10、1×102、1×103、1×104 μg·L-1浓度的瘦素(leptin),对照组不加入leptin.MTT法检测各组成骨样细胞增殖能力,实时荧光定量PCR检测各组细胞中ALP、OCN、RANKL和OPN基因表达.结果 相比于诱导前,诱导后细胞表面CD44和HLA-DR表达量显著增加,而CD90和CD105表达量下降(P<0.05);与24 h时相比,A组、B组、C组、D组和对照组48、72、96 h时细胞增殖能力均增强(P<0.05);与对照组相比,A组、B组和C组48、72、96 h时细胞增殖能力显著增强(P<0.05),尤其是B组促增殖能力最强,而D组各时点细胞增殖能力则降低(P<0.05);与24 h时相比,A组、B组、C组、D组和对照组48、72、96 h时细胞中ALP、OCN和OPN mRNA相对表达量和OPN/RANKL比值均升高(P<0.05),且呈现随时间推移逐渐升高趋势,而RANKL mRNA相对表达量均降低(P<0.05),且呈现随时间推移逐渐降低趋势;A组、B组、C组和D组组间相比,48、72、96 h时细胞中ALP、OCN和OPN mRNA相对表达量和OPN/RANKL比值:B组>C组>A组>D组,而RANKL mRNA相对表达量:D组>A组>C组>B组.结论 leptin可促进绝经后骨质疏松病人BMSCs定向分化后成骨样细胞增殖分化,且具有时间依赖性,但存在最宜浓度.     

Endothelial progenitor cell differentiation using cryopreserved, umbilical cord blood-derived mononuclear cells

AIM: To investigate the endothelial differentiation potentiality of umbilical cord blood (UCB), we induced the differentiation of endothelial progenitor cells (EPC) from cryopreserved UCB-derived mononuclear cells (MNC). METHODS: MNC from cryopreserved UCB and peripheral blood (PB) were cultured in M199 medium with endothelial cell growth supplements for 14 d. EPC were characterized by RT-PCR, flow cytometry, and immunocytochemistry analysis. The proliferation of differentiated EPC was studied by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay, and vascular endothelial growth factor (VEGF) concentration was measured using an ELISA kit. Characteristics of UCB-derived EPC were compared with those of PB-derived EPC. RESULTS: A number of round-shaped cells were loosely attached to the bottom after 24 h culture, and numerous spindleshaped cells began to appear from the round-shaped ones on d 7. Those cells expressed endothelial markers such as, Flt-1/VEGFR-1, ecNOS, VE-cadherin, von Willebrand factor, and secreted VEGF. The patterns of endothelial markers of EPC from PB and UCB did not show striking differences. The results of the proliferation and secretion of VEGF were also similar. CONCLUSION: We successfully cultured UCB cells stored at -196 Celsius degree into cells with the quality of endothelial cells. Those EPC could be used for angiogenic therapeutics by activating adjacent endothelial cells and enhancing angiogenesis.     

鼠神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的:观察鼠神经生长因子(mNGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。方法:4周龄健康SD大鼠60只,按随机数字表法分为治疗组(n=30)和正常对照组(n=30)。治疗组在常规培养的基础上加入浓度为0.1μg/mL mNGF作为诱导液。将培养的第3代BMSCs制成单细胞悬液,诱导后3d,观察细胞形态变化,行神经元特异性烯醇酶(NSE)免疫荧光检测,计算阳性率。结果:正常对照组细胞仅有少量NSE的表达,治疗组细胞表达NSE阳性率较对照组细胞显著增加(P<0.01)。结论:mNGF可诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化。     

复方甘草酸苷对HaCaT 细胞表达IL-2、IL-4 的影响

目的观察复方甘草酸苷(CG)对角质形成细胞株HaCaT 细胞增殖的抑制作用及其表达白细胞介素（IL）- 2、IL-4 的影响,探讨CG 治疗银屑病的作用机制。方法将培养的HaCaT 细胞分为4 组：空白对照组（不加CG）;低浓度组（1 mL 细胞培养液中加入50 μL CG）;中浓度组（1 mL 细胞培养液中加入100 μL CG）;高浓度组（1 mL 细胞培养液中加入200 μL CG）。采用噻唑蓝（MTT）方法检测24 h 后不同浓度CG 对HaCaT 细胞增殖的抑制作用;双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)分析不同浓度CG 处理后的HaCaT 细胞上清液中IL-2 及IL-4 的表达水平。结果低、中、高浓度CG 干预HaCaT 细胞24 h 后均可见到明显的增殖抑制作用。不同浓度CG 干预HaCaT 细胞24 h 后,低浓度组上清液中IL-2 的浓度与空白对照组无明显差异（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23,P＞0.05）;中、高浓度组的IL-2 浓度明显低于空白对照组及低浓度组,且高浓度组低于中浓度组（ng/L：188.99±19.22 vs 208.49±18.40, P＜ 0.05）;高浓度组培养上清液中IL-4 的浓度较其余3 组明显升高（ng/L：45.67±10.29 vs 37.62±3.90、39.68±6.08、43.85± 10.26,P＜0.05）。结论CG 可能是通过调节细胞因子IL-2 与IL-4 的分泌而抑制皮肤角质形成细胞的增殖。     

丹皮酚与顺铂联用对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:研究丹皮酚与顺铂联用对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、凋亡的影响及可能的作用机制.方法:取对数生长期MG-63细胞,分为空白对照组、顺铂组(4μmol/L)、丹皮酚组(50 mg/L)和低、中、高浓度联用组(50、100、200 mg/L丹皮酚+4μmol/L顺铂).采用CCK-8法检测经药物作用24、48、72 h...     

胎盘间充质干细胞向神经细胞诱导的实验研究

目的间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力的特点，尽管其主要来源骨髓间充质干细胞(BMSCs)已被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。但在严重感染或随着年龄的增长骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下，就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSC，有必要寻找MSC的新来源。方法消化胎盘组织、贴壁培养获得基质细胞；用流式细胞仪检测其细胞表面标志；比较叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole，BHA)、复方丹参注射液、β-巯基乙醇(BME)等对培养的基质细胞向神经细胞分化的作用；采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果胎盘组织中分离出的基质细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志，并可诱导表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolasen，NSE)、神经微丝(neurofilament，NF)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein，GFAP)。结论胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。胎盘间充质干细胞可能是一种可为临床治疗提供丰富新来源的间充质干细胞。     

木犀草素对膀胱肿瘤T24细胞的影响

目的研究木犀草素对膀胱肿瘤T24细胞体外增殖的抑制和诱导凋亡作用。方法不同浓度木犀草素作用于指数生长期膀胱肿瘤T24细胞后应用MTS比色法检测细胞增殖的抑制作用。通过DNA凝胶电泳检测细胞的凋亡情况。结果浓度为0.01～0.04mg/mL的木犀草素对体外培养的膀胱肿瘤T24细胞有明显的抑制作用。DNA凝胶电泳结果显示:空白对照组没有出现DNA"梯带";其他4组(除木犀草素0.004mg/mL组)均出现不同程度的DNA"梯带",显示出细胞凋亡的特征。结论木犀草素在浓度为0.01～0.04mg/mL时对膀胱肿瘤T24细胞有通过诱导细胞凋亡的方式抑制细胞生长的作用,可能具有治疗膀胱肿瘤的临床价值。     

来氟米特代谢物teriflunomide调节NFATc1基因抑制破骨细胞分化作用研究

目的:探讨来氟米特代谢活性物质teriflunomide对人外周血单核细胞向破骨细胞分化的抑制作用及其机制.方法:梯度离心法分离外周血单核细胞,MTT法测定teriflunomide对外周血单核细胞的毒性作用,TRAP染色鉴定其对外周血单核细胞向破骨细胞分化的抑制作用,RT-PCR法测定teriflunomide对外周血单核细胞NFA Tc1基因的表达影响.结果:Teriflunomide对外周血单核细胞的增殖无显著影响,能够显著抑制破骨细胞的分化成熟,且能够有效抑制NFATc1基因的表达.结论:Teriflunomide能够通过抑制破骨细胞分化启动基因NFATc1的表达,有效抑制外周血单核细胞向成熟破骨细胞的分化,且对正常单核细胞无毒性作用.     

沙利度胺对人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的影响研究

目的:研究沙利度胺对人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的影响。方法:将K562细胞分为对照(未加药)组和沙利度胺低、中、高剂量(0·5、1·0、2·0mmol·L-1)组,加入相应药物分别作用24、48、72、96h后,MTT法检测各组细胞生长抑制率,Wright-Giemsa染色观察各组细胞形态变化,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果:K562细胞的生长抑制率和凋亡率与沙利度胺浓度和作用时间均呈正相关;与对照组比较,沙利度胺3个剂量组作用72、96h后细胞的生长抑制率明显升高(P<0·05),4个时间点的细胞凋亡率均明显升高(P<0·01)。沙利度胺3个剂量组作用72h后,K562细胞出现细胞体积缩小等凋亡形态。结论:沙利度胺能够抑制K562细胞的增殖,呈一定的浓度和时间依赖性,并能够诱导K562细胞的凋亡。