Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin (终浓度为1 000 nmol·L-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1 000 nmol·L-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。     

化瘀祛痰方对高脂血症大鼠肝脏PI3K/Akt信号通路影响研究

目的:探讨化瘀祛痰方对高脂血症大鼠肝脏PI3K/Akt信号通路的影响。方法:将50只SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,每组10只。采用高脂饲料喂养进行高脂血症模型复制后,中药低、中、高剂量组分别给予含有生药量为0.45、0.9、1.8 g/mL的化瘀祛痰方药煎剂进行治疗,正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。4周后HE染色观察各组大鼠肝脏形态变化;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量变化;WB法检测各组大鼠肝脏PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果:与正常组相比,模型组大鼠肝脏脂肪变性明显,TC、LDL-C水平显著升高(P0.05),HDL-C水平降低(P0.05),TG水平未发生显著改变(P0.05);PI3K、p-Akt蛋白表达水平上调(P0.05);与模型组相比,中药低、中、高剂量组大鼠肝脏脂肪变性呈不同程度减低,TC、LDL-C水平显著降低(P0.05),HDL-C水平升高(P0.05),TG水平未发生显著改变(P0.05);PI3K、p-Akt蛋白表达水平呈不同程度下调(P0.05)。结论:化瘀祛痰方可以通过调节PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达,从而改善高脂血症大鼠肝脏脂质损伤。     

低强度脉冲聚焦超声通过上调PGAM5蛋白表达促进软骨细胞线粒体自噬

目的 探讨低强度脉冲聚焦超声(focused low-intensity pulsed ultrasound,FLIPUS)对软骨细胞线粒体自噬活化的影响.方法 提取C57BL/6J乳鼠膝关节原代软骨细胞进行体外实验,IL-1β处理细胞模拟骨关节炎样软骨细胞损伤并进行验证.细胞分为对照组、IL-1β组和IL-1β+FLIPUS组.RT-PCR检测各组Col2α1 和MMP13 mRNA 表达;Western blot 检测各组Col2α1、MMP13、LC3B-Ⅱ、TOM20、TIM23、PGAM5、FUNDC1及p-FUNDC1(p-ser13)蛋白表达.结果 成功提取原代软骨细胞并模拟骨关节炎样软骨细胞损伤.与对照组比较,IL-1β组Col2α1 mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.01),MMP13 mRNA和蛋白表达明显增加(P＜0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+FLIPUS组Col2α1表达明显上升(P＜0.05),MMP13表达明显下降(P＜0.01).与对照组相比,IL-1β组LC3B-Ⅱ蛋白表达显著降低(P＜0.05);与IL-1β组相比,IL-1β+FLIPUS组LC3B-Ⅱ、PGAM5蛋白表达显著上升(P＜0.01),TOM20、TIM23、p-ser13蛋白表达则明显下降(P＜0.05).结论 FLIPUS可能通过上调软骨细胞PGAM5蛋白表达,使FUNDC1第13位丝氨酸去磷酸化,活化线粒体自噬.     

扶正化瘀胶囊对气虚血瘀型肝纤维化模型大鼠细胞自噬基因LC3Ⅱ和p62的干预作用

目的探讨扶正化瘀胶囊对气虚血瘀肝纤维化模型大鼠细胞自噬基因LC3Ⅱ和p62mRNA、蛋白表达水平的干预作用。方法 40只SD大鼠根据随机数字表法分正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组和扶正化瘀治疗组,每组10只。肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组、扶正化瘀治疗组大鼠采用四氯化碳(CCl_4)与橄榄油按4:6比例配40%油剂,按0.3mL/100g剂量,皮下注射制备模型,气虚血瘀型肝纤维化组大鼠在肝纤维化模型制备的基础上加用游泳疲劳试验制备气虚血瘀型肝纤维化模型。正常组、肝纤维化组、肝纤维化气虚血瘀组大鼠给予生理盐水2mL灌胃,1天1次,连续4周。扶正化瘀治疗组大鼠给予扶正化瘀胶囊混悬液,按0.5g/kg体质量灌胃,1天1次,连续4周。实验结束后处死大鼠摘取肝脏,测定肝重、肝湿重,天狼星红染色后评价肝脏纤维化程度,采用qPCR、Western blot测定肝组织LC3Ⅱ、p62 mRNA和蛋白表达水平。结果扶正化瘀治疗组大鼠体质量(375.80±24.36)g、肝湿重(11.31±1.13)g,高于气虚血瘀肝纤维化组(356.10±20.45)g、(10.34±1.13)g,P0.05;天狼星红染色显示,气虚血瘀肝纤维化组大鼠肝纤维化程度最重,扶正化瘀治疗后显著改善;气虚血瘀肝纤维化组Ishak评分(5.80±0.80)分最高,扶正化瘀治疗组(2.70±0.90)分显著下降(P0.05)。气虚血瘀肝纤维化组LC3ⅡmRNA(1.44±0.01)及蛋白(3.01±0.57)表达最高,扶正化瘀治疗组LC3ⅡmRNA(1.20±0.01)、蛋白(2.04±0.30)均显著下降(P0.05);气虚血瘀肝纤维化组p62 mRNA(0.95±0.05)、蛋白(0.19±0.12)表达最低,扶正化瘀治疗组p62 mRNA(1.12±0.01)、蛋白(0.67±0.32)显著升高(P0.05)。结论气虚血瘀型肝纤维化模型大鼠较单纯肝纤维化模型大鼠LC3Ⅱ表达量明显增加,自噬底物p62消耗明显,扶正化瘀胶囊可以显著抑制LC3Ⅱ/p62表达。     

马兜铃酸致大鼠肝脏损伤及对自噬因素的影响

目的:观察马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)致大鼠肝脏损伤的情况,并探讨其对自噬相关因素的影响。方法:雄性Wistar大鼠随机分为正常组、自噬抑制剂组、AAⅠ低剂量(20 mg/kg)组、AAⅠ高剂量(40 mg/kg)组、自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组、自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组,每组5只。自噬抑制剂干预组大鼠预先腹腔注射3-甲基腺嘌呤(3-MA,20 mg/kg);抑制剂干预1 h后,AAⅠ干预组腹腔注射给予相应剂量的AAⅠ。药物干预连续9 d。末次给药后,取血、分离肝脏。生化分化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,并计算比值;光镜和透射电镜下观察肝组织形态学变化。PCR检测肝组织Beclin 1、LC3、p53的mRNA表达水平;免疫组化检测Beclin 1、LC3、p53的蛋白表达水平。结果:(1)与正常组相比,AAⅠ低剂量组大鼠血清AST水平显著升高(P0.05),AAⅠ高、低剂量组AST/ALT比值明显升高(P0.05,P0.01);与自噬抑制剂组相比,自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组与自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组AST/ALT比值均明显升高(P0.01)。(2)HE染色观察显示,AAⅠ高、低剂量组可见肝细胞肿胀,且AAⅠ高剂量组的损伤程度更为显著;自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组出现肝细胞出血性坏死,损伤程度较AAⅠ高剂量组明显加重。透射电镜观察显示,AAⅠ高、低剂量组线粒体肿胀,AAⅠ高剂量组亦出现脂肪变性;自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组线粒体肿胀;自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组可见内质网肿胀,隐见自噬小体。(3)与正常组相比,AAⅠ高、低剂量组p53 mRNA表达量显著上调(P0.05);与自噬抑制剂组相比,自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组LC3 mRNA表达量明显下调(P0.05),自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组Beclin 1和LC3的mRNA表达量显著降低(P0.01);自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组Beclin 1、LC3、p53的mRNA表达量明显低于自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组(P0.05,P0.01)。(4)与正常组相比,AAⅠ高、低剂量组Beclin 1、LC3、p53蛋白表达均明显上调(P0.01),且AAⅠ高剂量组3种蛋白表达明显高于AAⅠ低剂量组(P0.05,P0.01);与自噬抑制剂组相比,自噬抑制剂与不同剂量AAⅠ协同作用后3种蛋白表达均明显上调(P0.01);与自噬抑制剂+AAⅠ低剂量组相比,自噬抑制剂+AAⅠ高剂量组Beclin 1、LC3蛋白表达明显降低(P0.05,P0.01),p53蛋白表达明显升高(P0.01)。结论:AAⅠ能够诱导大鼠肝脏损伤,且自噬因素可促进AAⅠ肝损伤,其作用机制可能与调节p53蛋白表达、诱导自噬相关。     

姜黄素通过AMPK/FUNDC1缓解LPS诱导的心肌细胞损伤

目的 阐明AMPK/FUNDC1在姜黄素(curcumin, Cur)减轻脂多糖诱导的心肌细胞毒性中的作用及机制。方法将分离的乳鼠心肌原代细胞(neonatal mouse cardiomyocytes, NMCMS)构建脂多糖损伤模型。以CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力、ROS检测试剂盒检测ROS生成量、ATP检测试剂盒检测线粒体ATP生成、JC-1荧光染色观察线粒体膜电位、Western blot法检测自噬标志蛋白的表达情况。结果 与Con组比较,LPS处理后显著降低心肌细胞活力且ROS水平显著增加,同时AMPK的磷酸化水平及线粒体自噬标志蛋白FUNDC1的表达显著降低。Cur处理后这种改变被显著逆转,从而保护NMCMS免受LPS诱导的心肌细胞毒性损伤。而siAMPK的加入则部分抵消Cur对心肌细胞的保护作用,此外线粒体自噬抑制剂3-MA及线粒体自噬激活剂rapamycin处理后表明,FUNDC1作为AMPK的下游的关键调控分子,参与Cur对LPS诱导的心肌损伤的保护作用。结论 Cur通过激活AMPK/FUNDC1信号通路,缓解LPS诱导的心肌细胞毒性。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白的变化

目的研究在慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠肺组织中自噬相关蛋白的变化。方法单纯烟熏法构建慢阻肺大鼠动物模型,采用Real time PCR,Western blot技术检测检测大鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的mRNA及蛋白表达,探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。用LC3B免疫组化比较COPD组与正常大鼠间自噬水平的变化。结果 Real time PCR分析结果显示,与正常组相比,慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA表达显著增高(P0.05,其中Beclin1、Atg5两组比较P0.01)。Atg7的mRNA表达在慢阻肺组与正常组之间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果显示,慢阻肺组大鼠肺组织中PI3K蛋白、p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR蛋白表达显著降低(P0.05)。自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1蛋白表达增高(P0.05,其中LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5两组比较P0.01)。P62蛋白表达显著下降(P0.01)。LC3B免疫组化显示,慢阻肺组LC3B表达高于正常组。结论烟熏12周的慢阻肺大鼠与正常组相比,自噬通路上游蛋白PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的表达降低,自噬蛋白表达增加,自噬水平增加。     

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征对大鼠海马神经细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

目的 观察阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。方法 将24只成年雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组进行OSAS模型复制，复制成功后继续饲养，按饲养时长分为2周组、4周组和6周组；对照组无特殊处理。每组6只。Western blotting检测大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白LC3（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）、p62、PINK1及Parkin蛋白相对表达量；用透射电子显微镜观察其线粒体的变化。结果 实验组大鼠模型复制前后最低血氧饱和度和平均血氧饱和度的比较，差异有统计学意义（P <0.05），即OSAS模型复制成功。与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马神经细胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于对照组，p62蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）；进一步两两比较，4周组LC3、LC3Ⅱ/LC3ⅠPINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于2周组，p62蛋白相对表达量低于2周组（P <0.05）；6周组LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于4周组，p62蛋白相对表达量低于4周组（P <0.05）。透射电镜观察，与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马区可见被双层或多层磷脂双分子层包裹的线粒体自噬体。结论 OSAS可致大鼠海马神经细胞发生线粒体自噬，其自噬程度随饲养时间延长而加重。     

刺山柑果实提取物对CCl_4诱导的小鼠肝纤维化的保护作用

目的:研究刺山柑果实提取物对四氯化碳(CCl_4)诱导的小鼠肝纤维化的保护作用及可能机制。方法:45只C57BL小鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方组(FZHY组,4 g/kg)、刺山柑低剂量组(0.93 g/kg)和高剂量组(2.80 g/kg),每组9只。除正常组外,其余各组小鼠腹腔注射10%CCl_4,每次2 ml/kg,每周3次,连续8周,诱导小鼠实验性肝纤维化模型。造模第5周起,各药物组灌胃给予相应剂量的药液,连续4周。末次给药后,采集血清和肝脏样本。试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性以及总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)水平。HE染色和天狼猩红染色后,光镜下观察肝组织形态学变化。试剂盒检测肝组织羟脯氨酸(Hyp)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性。Western blot检测肝组织自噬相关蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达水平。结果:①与模型组相比,FZHY组和刺山柑低、高剂量组小鼠的ALT、AST、ALP、TBIL水平显著降低(P0.05,P0.01),TP和ALB水平显著升高(P0.01);且刺山柑高剂量组小鼠的ALT和AST水平明显低于低剂量组(P0.05,P0.01)。②HE染色和天狼猩红染色观察显示,模型组小鼠肝细胞可见大面积出血性坏死,纤维组织广泛增生形成间隔,并将肝组织包围形成假小叶;与模型组相比,FZHY组及刺山柑低、高剂量组小鼠的肝组织形态均有不同程度改善,肝细胞坏死明显减少,同时纤维增生有所减轻,假小叶逐渐消失;且刺山柑高剂量组的改善作用优于低剂量组。半定量分析结果表明,FZHY组和刺山柑高剂量组的胶原阳性染色面积占比较模型组显著降低(P0.05)。③与模型组相比,FZHY组及刺山柑低、高剂量组小鼠肝组织Hyp含量显著降低(P0.01),SOD水平显著升高(P0.01),MDA水平显著降低(P0.05,P0.01)。④Western blot结果显示,刺山柑低、高剂量组小鼠肝组织LC3-Ⅱ蛋白表达较模型组显著上调(P0.01),但LC3-Ⅰ蛋白表达无明显变化。结论:刺山柑果实提取物可有效减轻CCl_4诱导的小鼠肝纤维化,明显改善模型小鼠的肝功能及病理损伤,其作用机制与抑制肝脏胶原纤维生成、清除氧自由基和促进线粒体自噬有关。     

前列腺素 E1减轻大鼠肺撞击伤后肺泡细胞凋亡?

目的：探讨前列腺素 E1(PGE1)对肺撞击伤后肺泡细胞凋亡的影响。方法雄性 SD大鼠分为正常对照组、伤后对照组和伤后 PGE1处理组。致伤后24 h 检测动脉氧分压、肺系数,TUNEL 染色检测肺泡细胞凋亡的整体情况。以蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测自噬相关蛋白及自噬调节蛋白 NIX 的表达情况。结果伤后24 h 肺组织可见明显结构破坏及肺水肿。与正常对照组相比,伤后对照组动脉氧分压降低(P <0.05),肺泡细胞凋亡指数增加(P <0.05),同时肺组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节蛋白 NIX 表达增加(P <0.05)。伤后 PGE1处理组动脉氧分压低于正常对照组(P <0.05),但较伤后对照组显著改善(P <0.05);肺泡细胞凋亡指数高于正常对照组,但显著低于伤后对照组(P <0.05);肺组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节蛋白 NIX 的表达虽然较正常对照组增加(P <0.05),但显著低于伤后对照组(P <0.05)。结论PGE1减轻大鼠肺撞击伤后肺泡细胞凋亡,此作用可能是通过抑制 NIX 介导的细胞自噬,以及肺泡细胞自噬性凋亡实现。     

辣椒素对体外肝细胞脂质代谢的影响研究

目的 探讨辣椒素对脂肪变肝细胞内脂质沉积的影响及自噬表达情况,为脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶点.方法 用油酸(40 μg/mL)诱导肝原代细胞LO2细胞株建立非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型.实验分为空白对照组、油酸组、辣椒素组[油酸+辣椒素(100 μmol/L)].油红O染色和三酰甘油试剂盒检测肝细胞内脂肪变程度;Western blot检测自噬体标记分子p62和LC3的表达水平并计算LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值.结果 40 μg/mL油酸处理LO2细胞24h后,油红O染色观察,油酸组肝细胞中可见大小不等的橘红色脂滴.而空白对照组无明显橘红色脂滴形成,油酸在体外成功建立NAFLD模型.与油酸组相比,辣椒素组肝细胞内三酰甘油水平显著降低(P＜0.05),脂滴明显减少,p62蛋白水平明显降低(P＜0.05),而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调(P＜0.05).结论 在体外利用油酸诱导LO2细胞株建立NAFLD模型,辣椒素刺激NAFLD细胞,上调NAFLD细胞自噬水平,减少细胞内脂质沉积,但具体机制还需进一步研究.     

尼莫地平对脑缺血大鼠自噬的影响

目的: 研究尼莫地平对大鼠脑缺血自噬的影响及治疗作用。方法: 将90只SD大鼠随机均分为大脑中动脉局灶性线栓法(MCAO)模型组(缺血模型组)、尼莫地平组、假手术组,每组30只。根据Zea Longa评分选取实验用模型鼠。制备MCAO大鼠模型,采用蛋白质印迹法检测LC3 Ⅱ、Beclin 1、m TOR／p mTOR蛋白表达。应用TTC染色观察脑组织梗死体积,HE染色观察脑组织细胞损伤状况。制备星形胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型,将细胞分为空白对照组、OGD模型组、尼莫地平组,采用蛋白质印迹法检测LC3 Ⅱ、Beclin 1、m TOR／p mTOR蛋白,CCK8实验检验星形胶质细胞活性。结果： 与假手术组相比,缺血模型组LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白以及m TOR／p mTOR蛋白表达明显增加(P均<0.05)。与缺血模型组相比,尼莫地平组LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白表达明显降低,m TOR蛋白表达明显增加(P<0.05),脑组织梗死体积和细胞死亡数明显降低(P均<0.05)。在OGD试验中,与OGD模型组相比,尼莫地平组细胞活性升高,LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白表达降低(P<0.05)。 结论： 尼莫地平可抑制脑缺血大鼠自噬发生,降低自噬对脑组织的损伤。     

黄连碱促进肝细胞自噬及胆固醇外流改善脂肪肝的脂质蓄积

目的用油酸和棕榈酸处理HepG2细胞构建脂肪肝细胞模型,观察黄连碱（COP）对脂肪肝细胞中脂质蓄积的影响及其作用机制。方法采用100 μmol/L油酸和50 μmol/L棕榈酸诱导HepG2细胞脂肪变性形成细胞内脂质蓄积,构建脂肪肝细胞模型;通过CCK8检测不同浓度的黄连碱对HepG2细胞增殖活性的影响,设置4组细胞模型:对照组、脂肪肝细胞模型组（FFA组）、COP+HepG2组以及COP+FFA组;通过RT-PCR和Western blotting检测3组细胞的自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5及胆固醇外流介导因子ABCA1 mRNA及蛋白水平的表达变化;采用油红O染色观察对照组、FFA组和COP+FFA组3组细胞的脂滴变化。结果油红O染色结果显示相较于对照组,HepG2细胞经过油酸和棕榈酸共同处理后的FFA组细胞内脂质明显增多;而COP+FFA组中细胞的脂滴明显减少。CCK8结果显示0~25 μmol/L的黄连碱对HepG2细胞活性无明显影响（P>0.05）。Western blotting与RT-PCR结果显示:相对于对照组,FFA组细胞自噬以及胆固醇外流ABCA1水平明显降低,而COP+HepG2组自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ和ATG5以及ABCA1表达水平明显升高;相对于FFA组,COP+FFA组细胞中脂质蓄积明显减少,差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）,且自噬与胆固醇外流障碍也被改善。结论黄连碱可通过促进HepG2细胞自噬及胆固醇外流,减少油酸与棕榈酸诱导形成的脂肪肝细胞中的脂质蓄积。     

自噬调节在脉冲射频治疗神经病理性疼痛中的作用

目的：观察腰5(L5)脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)致慢性疼痛大鼠接受背根神经节脉冲射频(pulse radiofrequency,PRF)治疗后痛觉行为学的变化,检测脊髓背角自噬相关基因LC3和自噬受体蛋白P62的表达情况,研 究PRF是否能通过调节脊髓背角神经元自噬水平发挥镇痛作用。方法：36只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、SNL 组(行左侧L5脊神经的暴露和结扎)和SNL+PRF组(建立SNL模型后即刻给予1次同侧背根神经节PRF治疗)。分别于手 术前1 d及术后1,3,7,14,28 d观察各组大鼠机械刺激缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)改 变,Western印迹检测自噬相关基因LC3和细胞自噬受体蛋白P62在大鼠损伤侧相应节段脊髓背角的表达改变。结果： 与Sham组相比,SNL组大鼠在术后各时点PWMT均明显下降(P<0.05);与SNL组相比,SNL+PRF组大鼠在PRF治疗术 后第1天即出现PWMT的升高,并持续28 d(P<0.05);与Sham组相比,SNL组大鼠在术后7 d脊髓背角LC3-II和P62蛋白 表达明显升高(P<0.05);与SNL组相比,SNL+PRF组大鼠在术后7 d脊髓背角LC3-II和P62蛋白表达明显下调(P<0.05)。 结论：SNL慢性疼痛大鼠接受背根神经节PRF治疗后出现疼痛行为学改善,PRF治疗可能通过上调脊髓背角神经元自 噬水平发挥镇痛作用。     

钙离子在顺铂诱导宫颈癌HeLa细胞自噬反应中的作用

目的：采用钙释放抑制剂联合化疗药物作用于宫颈癌HeLa细胞,探讨钙离子（Ca²⁺）在肿瘤细胞自噬反应中的作用,为辅助肿瘤治疗和药物研发提供依据。方法：选择处于对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞,随机分为对照组、顺铂组、2-APB组和顺铂联合2-APB组（联合组）。MTT法检测HeLa细胞生存率,钙离子荧光探针法检测HeLa细胞胞浆和线粒体中游离Ca²⁺水平,共聚焦显微镜检测HeLa细胞中自噬相关蛋白LC3和P62的共定位情况。结果：MTT法检测,与对照组比较,顺铂组和联合组HeLa细胞生存率明显降低（P<0.05）;与顺铂组比较,联合组HeLa细胞生存率明显升高（P<0.05）。钙离子荧光探针法检测,与顺铂组比较,联合组细胞株胞浆和线粒体中游离Ca²⁺水平及LC3和P62蛋白共定位荧光强度明显降低。结论：化疗药物可诱导肿瘤细胞发生自噬,联合钙释放抑制剂给药可以降低肿瘤细胞自噬水平,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

益气解毒方干预实验性结肠炎大鼠肠上皮细胞自噬功能的研究

目的:通过检测益气解毒方对结肠菌株所致实验性结肠炎大鼠肠黏膜上皮细胞自噬相关基因(ATG)16L1及微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达及黏膜核因子kappaβ(NF-κβ)活化的影响,探讨益气解毒方防治溃疡性结肠炎的作用机制。方法:构建结肠细菌菌株诱导实验性结肠炎模型,以益气解毒方治疗14 d,设以生理盐水灌胃的模型对照组及空白对照组,观察疾病活动指数(DAI),进行组织学评分(HPS)和分离ICEs并提取ICE中的总RNA,用反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ATG16L1及LC3的表达;采用免疫组织化学方法检测NF-κβ的活性情况。结果 :益气解毒组的症状、组织损害程度较模型对照组减轻,其ATG16L1、LC3的表达均高于模型对照组(P0.05);与空白对照组比较,模型组ATG16L1表达下降,差异有统计学意义(P0.05);模型对照组NF-κβ活性高于益气解毒组,两组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:结肠细菌菌株诱导实验性结肠炎大鼠可能存在肠上皮细胞自噬功能不足,益气解毒方通过促使提升上皮细胞自噬功能,进而抑制炎性因子NF-κβ的活性,并在肠道炎症中发挥作用。     

辛伐他汀对动脉粥样硬化大鼠内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达的影响

目的:探讨辛伐他汀对动脉粥样硬化(AS)大鼠内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达的影响。方法:将40只大鼠随机分为对照组、模型组、小剂量和大剂量辛伐他汀组。对照组以基础饲料喂养,余3组均以高脂高热量饲料喂养。10周后,小、大剂量辛伐他汀组分别给予2.5和5.0mg/(kg·d)辛伐他汀灌胃,4周后,酶法测定血脂并计算动脉硬化指数(AI),应用RT-PCR方法检测4组大鼠肝脏、腓肠肌及大网膜脂肪组织中内脂素、瘦素mRNA的表达。结果:模型组大鼠冠脉血管呈AS样表现,小、大剂量辛伐他汀组病理变化较模型组减轻。4组AI、内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达水平差异均有统计学意义(F=374.860,164.080,242.150,P<0.001),模型组AI、内脏脂肪组织中内脂素及瘦素mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05),2个辛伐他汀组的表达水平较模型组降低,尤其大剂量辛伐他汀组降低更明显(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。结论:辛伐他汀防治AS的作用机制可能与降低体内内脂素及瘦素的表达有关。     

Effect of an Ilex asprella root decoction on the related genes of lipid metabolism from chronic stress and hyperlipidemic fatty liver in rats

Background  The gradually increasing changes in a human hyperlipidemic diet along with chronic stress might play an important role in the increased numbers of fatty liver. This study investigated the effects of Ilex asprella root decoction on related genes of lipid metabolism in chronic stress in hyperlipidemic fatty liver in rats.

Methods  Forty-eight male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group, model control group, simvastatin group, and Ilex asprella root group. To establish chronic stress and hyperlipidemic fatty liver models in rats, the levels of serum lipids, glucose, liver index, insulin (INS), insulin resistant (IR) index, adiponectin, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-pX), glutathione (GSH), liver X receptor (LXR), and sterol responsive element binding protein (SREBP)-1c in rats were measured.

Results  When compared to the normal control group, the levels of serum lipids, glucose, liver index, INS, IR index, and GSH in the model control group significantly increased (P <0.01). The protein levels of LXRα and SREBP-1c increased (P <0.05), and the serum adiponectin and the SOD and GSH-pX decreased significantly (P <0.01). When compared to the model control group, the levels of serum lipids, glucose, liver index, INS, IR index, SOD, and GSH-pX in the simvastatin group and Ilex asprella root group increased in varying degrees (P <0.01 or 0.05); the serum adiponectin and GSH decreased (P <0.05), while the protein levels of LXRα and SREBP-1c decreased in varying degrees (P <0.01 or 0.05). When compared to the simvastatin group, the IR index and protein levels of LXRα in the Ilex asprella root group decreased (P <0.05), and the serum adiponectin and SOD increased (P <0.05).

Conclusion  The Ilex asprella root decoction has some protective effects on regulating the related genes of lipid metabolism caused by chronic stress and hyperlipidemic fatty liver in rats.

     

胡柚皮黄酮诱导自噬抑制肝细胞脂肪变性的作用研究

目的 观察胡柚皮黄酮对棕榈酸诱导的肝细胞脂肪变性的影响。方法 棕榈酸诱导HepG2细胞脂肪变性，不同浓度胡柚皮黄酮干预后，采用油红O染色法观察肝细胞脂肪变性；荧光探针法观测细胞内活性氧水平及线粒体膜电位变化；免疫印迹法检测Beclin-1、LC3及P62蛋白表达。结果 棕榈酸诱导后，HepG2细胞内脂滴和活性氧含量明显增高；胡柚皮黄酮处理后，细胞内脂滴和活性氧均明显降低，线粒体膜电位恢复，LC3和Beclin-1蛋白表达上调，P62蛋白表达下调。结论 胡柚皮黄酮能改善肝细胞脂肪变性和氧化应激反应，机制可能与其调控线粒体自噬，维持线粒体功能稳定有关。