脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经干细胞神经前体细胞的研究

目的 探索脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经干细胞的可行性.方法 分别采用同种异体脑脊液和细胞生长因子为诱导剂,体外诱导人脐血源和骨髓源间充质干细胞分化为神经干细胞.从形态学、免疫组化、荧光免疫绀化法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导后间充质干细胞呈现神经干细胞改变,均可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并表现相应的特征形态结构、表型和生物学特性,细胞长势良好.而脑脊液诱导组,从形态上与细胞生长因子诱导组基本一致,但从时间上缩短神经干细胞、神经样细胞的生长周期.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导不间来源人间充质干细胞转化为神经样细胞,而脑脊液诱导组诱导时问和细胞周期均较短.     

大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脊髓神经干细胞分化的研究

[目的]观察大鼠嗅神经鞘细胞上清液对脊髓神经干细胞共培养发生的诱导分化作用。[方法]采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，分时段Mr丌法检测细胞活性，选取最佳状态细胞无血清培养后取上清液，与3代纯化后的神经干细胞共培养，观察分化过程，免疫荧光法鉴定诱导结果。[结果]MTT法分6个时段检测纯化后的嗅鞘细胞，发现9d及12d细胞活性最高。使用无血清嗅鞘细胞上清液与脊髓神经干细胞共培养发现诱导作用明显，向神经元样细胞及胶质细胞分化的比例分别达到53％和42％。[结论]嗅鞘细胞在体外培养的不同时间段活性不同，无血清的嗅鞘细胞上清有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用。     

神经干细胞定向分化调控的研究进展

神经干细胞的发现不仅改变了中枢神经系统神经组织不能再生的传统观点，还为中枢神经系统损伤和疾病的研究提供了新的思路和途径。中枢神经系统内神经组织细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种细胞，其功能主要依赖神经元及其之间的神经信息传递，不同的神经元在形态结构上基本一致，但功能却各不相同。仅仅通过神经干细胞移植以期代替各种神经元的方法并不理想，较为理想的方法是在应用前根据靶组织类型对神经干细胞进行准确的定向分化诱导。     

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

目的 建立有效的体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)分化为肝细胞样细胞的培养体系.方法 将H9 hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上,序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化:100μg/L细胞因子活化素A( activin A)诱导3d,20 μg/L骨形成蛋白4(BMP-4)和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导4d,10μg/L肝细胞生长因子(HGF)诱导5d,最后以含10 μg/L制瘤素M(OSM)及1×10-7 mol/L地塞米松(Dex)的培养液继续诱导4d.于细胞诱导分化第16天,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平;过碘酸-雪夫反应(PAS)试验和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能.结果 activin A、BMP-4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构,呈多角形或卵圆形;RT-PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子-4α(HNF4-α)、1-抗胰蛋白酶(AAT)等肝脏特异性基因;免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白;PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能.结论 体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞.     

黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞(hUMSCs)向神经细胞分化的作用。方法:体外对hUMSCs进行培养,以不同浓度黄连素(分4组：对照组即0 mg/L组、50 mg/L组、100 mg/L组和200 mg/L组)诱导其向神经样细胞分化,显微镜下观察细胞形态改变并记录,并通过细胞免疫化学及免疫荧光技术检测细胞表...     

胚胎干细胞定向分化为肝脏细胞的研究进展

胚胎干细胞可由哺乳动物的囊胚内细胞群或着床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞中分离获得,也可以由核移植克隆技术获得;胚胎干细胞向肝脏细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植的一个重要细胞来源,为肝脏疾病的细胞移植治疗奠定基础,在治疗肝脏疾病的研究领域中有着广阔的应用前景。     

胚胎干细胞定向分化为肝脏细胞的研究进展

胚胎干细胞可由哺乳动物的囊胚内细胞群或着床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞中分离获得,也可以由核移植克隆技术获得;胚胎干细胞向肝脏细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植的一个重要细胞来源,为肝脏疾病的细胞移植治疗奠定基础,在治疗肝脏疾病的研究领域中有着广阔的应用前景.     

影响神经干细胞定向分化的因素及其调控机制

神经干细胞（Neural stem cell,NSC）是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的神经前体细胞。Gage在2000年将NSC的特点具体定义为：NSC作为一种专能干细胞具有以下特点：①NSC是来源于神经系统或能产牛神经组织的细胞;②NSC具有自我更新及增殖的能力;③NSC只能产某些特定种类的细胞,而不像胚胎干细胞可分化为机体所有的细胞;     

肌源性干细胞分离培养及诱导分化为平滑肌细胞的研究

目的探讨兔肌源性干细胞分离、鉴定及诱导分化为平滑肌细胞的方法。方法取1．5个月龄新西兰兔大腿肌肉，采用Preplate技术分离培养肌源性细胞，并进行流式细胞仪（FCM）、免疫细胞化学、Western blot等确定细胞表型。采用添加血管内皮生长因子（VEGF）和与兔阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMC）共培养的方法诱导分离而得的细胞分化为平滑肌细胞并运用免疫细胞化学和Western blot检测特异性α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的表达。结果经过连续6d的差速贴壁分离得小圆形或短梭形的小体积细胞，FCM结果显示这些细胞〉80％为desmin＋，〉70％为bcl-2^＋，〉95％为CD45^-。免疫细胞化学定性结果显示desmin＋。高汇合度（〉50％）或低血清培养时容易融合形成肌管或肌细胞核链。诱导处理后分离的细胞表达α—SMA。结论采用Preplate技术能很好地分离出肌源性干细胞，并能在体外诱导分化为平滑肌细胞，为组织工程提供种子细胞。     

骨形成蛋白-2诱导脊髓神经干细胞分化的实验研究

目的：研究不同浓度的骨形成蛋白-2(bone norphogenetic protein-2，BMP-2)对脊髓源性神经干细胞(neural stem cells，NSCs)诱导分化成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)的影响。方法：取孕14d的胚胎小鼠脊髓，原代培养出脊髓NSCs。培养四代后，分别在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在与否的不同条件下，加入不同浓度的BMP-2．观察细胞的增殖、分化情况，用免疫组织化学的方法进行鉴定，并进行统计学分析：结果：低浓度的BMP-2(1～10ng／ml)与bFGF(20ng／ml)联合作用，可促进脊髓NSCs向神经元和星形胶质细胞分化，抑制其向少突胶质细胞分化。较高浓度BMP-2(100ng／ml)可抑制脊髓NSCs的增殖甚至导致细胞死亡。结论：脊髓NSCs在低浓度BMP和bFGF联合作用下能有效地分化成具有多种特性的神经样细胞，并与脊髓具有良好的同源性，可为脊髓损伤的修复研究提供良好的细胞学基础。     

氯化锂体外诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的 探讨氯化锂体外诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的可行性.方法 无菌条件下收集正常足月儿的脐带血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,贴壁法纯化,用含15%FBS的低糖DMEM培养基进行扩增培养,流式细胞仪检测表面抗原.取3代的脐血MSCs进行诱导,A组:用含15%FBS和20 ng/ml bFGF的DMEM完全培养基预诱导24 h,3 mol/L LiCI的DMEM培养基继续诱导6 d:B组:含3 mol/L LiCI的DMEM培养基诱导7 d;C组:含15%FBS的DMEM培养基正常培养7 d.光镜下观察细胞形态,用免疫组化技术检测细胞NSE、MAP2及GFAP的表达.结果 A组与B组诱导3 d后细胞即出现形态学上的改变,细胞变成不规则形,立体感增强,从胞体伸出突起.免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能表达神经元特异性标志NSE和MAP2,阳性表达率A组[分别为(73.6±7.8)%,(75.5±8.5)%]明显高于B组[分别为(31.0±4.3)%、(33.5±5.O)%],而星形胶质细胞特异性标志GFAP阳性细胞较少,A、B、C三组阳性表达率分别为(4.7 ±3.3)%、(5.1±4.6)%、(8.5±3.2)%.结论 LiCI联合生长因子bFGF体外可诱导人脐血MSCs分化为神经元样细胞.     

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.     

分层共同培养诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的 探讨体外联合HaCaT细胞共同培养诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向表皮细胞分化的可行性.方法 用聚碳酸酯细胞插入板分层后联合共同培养HaCaT细胞与MSCs,观察培养3、6、9d后的细胞形态,进行角蛋白(CK-19、CK-10)、整合素(α6、β1)染色并用流式细胞仪统计细胞阳性率.结果 共同培养后细胞形态变化明显,共培养3、6d后表皮细胞标志物CK-19、α6整合素、β1整合素免疫荧光染色阳性,细胞阳性率分别为9.3％、8.2％、11.5％和21.7％、34.1％、39.6％,CK10表达呈阴性;共培养9d后CK-19、α6整合素、β1整合素、表达较前减少,阳性率为12.2％、18.6％、16.3％,CK1O出现阳性表达,细胞阳性率为10.7％.结论 分层联合HaCaT细胞共同培养可以诱导骨髓干细胞向表皮细胞进行分化.     

共培养条件下嗅鞘细胞对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响

目的:观察体外骨髓间充质干细胞(BMSC)和嗅鞘细胞(OEC)非接触共培养时,OEC对BMSC向神经样细胞诱导分化的影响.方法:采用5～6周龄、体重100g左右的SPF级雄性Sprague Dawley (SD)品系大鼠20只,分离培养大鼠BMSC和OEC,BMSC取自双侧股骨,OEC取自嗅上皮.使用6孔0.4μm的Transwell共培养系统进行培养.将2×104/cm2的第3代OEC置于共培养系统上层,3×104/cm2的第3代BMSC置于下层.对共培养7d和14d后的BMSC行免疫组化染色,检测神经细胞特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj-1)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.流式细胞仪检测Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞的分布和所占的比例.结果:免疫组化检测显示,共培养7d和14d后BMSC均表达Nestin、Tuj-1和GFAP.流式细胞仪分析,共培养7d后Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞比例分别为46.3％、76.5％和23.2％,共培养14d后分别为27.7％、89.1％和50％.结论:非接触共培养条件下,OEC能诱导BMSC向神经样细胞分化.     

成骨细胞与血管内皮细胞体外直接共同培养生物学特性观察

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导的成骨细胞和肾血管内皮细胞直接共同培养的细胞相容性,并探索两者共同培养的合适比例.方法 成骨细胞和血管内皮细胞按1:0、3:1、2:1、1:1、0:1比例分为5组直接共同培养,观察各组细胞形态并计数细胞比较增殖能力,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,研究共同培养后成骨细胞成骨能力的改变.结果 共同培养后细胞增殖及成骨细胞ALP染色阳性率高于单一细胞培养,成骨细胞与内皮细胞按2:1比例培养优于按3:1和1:1比例培养,增殖最快,ALP阳性率最高.结论 成骨细胞和血管内皮细胞体外直接共同培养具有良好的相容性,可促进成骨细胞的增殖、分化及ALP的分泌,提高其成骨能力.两者按2:1混合是较佳比例.     

人胚神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的 探讨人胚神经干细胞（hNSC）移植治疗脊髓损伤（SCI）的可行性。方法 分离、培养和鉴定hNSC；用5溴-2脱氧尿苷嘧啶（BrdU）标记hNSC，并将其移植到14只T10半横断的Wistar大鼠损伤脊髓内（另外14只T10半横断损伤的大鼠作为对照组，仅损伤脊髓内注射DMEM／F12培养液），用BrdU的FITC免疫荧光染色检测移植细胞的存活和迁徙，用NF-200、GFAP免疫组织化学鉴定移植细胞的分化，BBB评分评定大鼠功能恢复情况。结果 （1）获得了大量的hNSC；（2）用免疫组织化学可以检测到移植的hNSC能在体内长时间存活（达2个月）并向远处迁徙，并分化为神经元和胶质细胞；（3）检测到实验组大鼠BBB得分明显高于对照组大鼠（P〈0．01），在SCI后第10周时实验组和对照组BBB得分最大差距达到2．1分。结论 hNSC移植能促进SCI大鼠后肢功能恢复，它是SCI移植治疗较有价值的细胞资源。     

人诱导性多潜能干细胞向表皮样干细胞分化的实验研究

目的 探讨人诱导性多潜能干细胞( iPSC)向表皮样干细胞分化的可能性.方法 (1)以经过灭活处理的小鼠胚胎Fb株作为滋养层,将人iPSC株接种于其上,加入胚胎干细胞完全培养液培养,Ⅳ型胶原酶消化法传代,倒置相差显微镜下观察人iPSC形态及生长状况并行碱性磷酸酶(AKP)染色.以胚胎干细胞不完全培养液悬浮培养iPSC,观察拟胚体形成能力.(2)将人iPSC接种于铺有人羊膜的6孔培养板培养,设为诱导组;另于未铺羊膜的6孔培养板上培养iPSC,作为对照组.观察2组iPSC形态,免疫细胞化学染色法检测整合素β1和细胞角蛋白19( CK19)表达.结果 (1)人iPSC在胚胎干细胞完全培养液中呈典型的干细胞克隆状生长,边界清楚,增殖旺盛;AKP染色阳性.iPSC在无滋养层条件下悬浮培养可形成拟胚体.(2)诱导组iPSC经培养4d后形成干细胞克隆,部分细胞整合素β1和CK19表达阳性.对照组细胞大量死亡,未见整合素β1和CK19表达.结论 人iPSC在羊膜诱导下可定向分化为表皮样干细胞,有望成为皮肤组织工程新的种子细胞.     

转基因神经干细胞移植治疗臂丛神经根性撕脱伤

目的 探讨利用转基因神经干细胞移植重建臂丛神经根性撕脱伤后运动功能的可行性.方法 以PGET-1 TA质粒为克隆载体体外扩增NT-3基因,以含有增强型绿色荧光蛋白基因的pLEGFP-C1质粒为表达载体将体外扩增的NT-3基因导入神经干细胞内,并将该转基因神经干细胞移植于臂丛神经根性撕脱伤动物模型的C6脊髓节段内,观察移植细胞的存活、分化及迁移等.观察实验动物的运动功能变化,利用神经电生理检测及辣根过氧化物酶逆行神经示踪技术评价周围神经再生情况.结果 NT-3基因成功导入神经干细胞内,该转基因神经干细胞移植于臂丛神经根性撕脱伤动物模型的C6脊髓节段内能够生存,并分化为神经元.实验动物的运动功能有所改善,但肌力低于3级.神经电生理检测及辣根过氧化物酶逆行神经示踪技术评价显示转基因神经干细胞移植能够促进周围神经再生.结论 利用转基因神经于细胞移植治疗臂丛神经根性撕脱伤是一种相对有效的实验性治疗方法,但尚需进一步研究以提高疗效.     

臂丛损伤神经干细胞脊髓前角移植后分化情况及对运动神经元的保护作用

目的观察臂丛根性撕脱伤后将脊髓源性神经干细胞(neuralstemcell,NSC)移植于脊髓前角后的存活、分化情况及对脊髓前角受损运动神经元的保护作用。方法取新生鼠脊髓,分离获得脊髓源性神经干细胞,体外培养、扩增、鉴定、5溴2-脱氧尿苷(BrdU)标记。取SD大鼠60只,随机分成实验组、对照组和单纯组。从后路制备C5~C7臂丛神经根性撕脱伤动物模型。实验组移植神经干细胞于C6脊髓前角,对照组移植灭活神经干细胞,单纯组不作移植。术后1、2、4、8、12周取脊髓标本进行组织学与免疫组化染色观察。结果神经干细胞移植入脊髓后能存活、分化;臂丛根性撕脱伤后脊髓前角运动神经元数目明显减少;实验组神经干细胞移植后2、4、8、12周各个时间点运动神经元的存活率均高于对照组和单纯组。结论臂丛根性撕脱伤脊髓前角神经干细胞移植后能存活并分化为神经元及星型胶质细胞,脊髓源性神经干细胞移植能明显减少前角运动神经元的继发性死亡,对脊髓前角受损运动神经元有保护作用。     

人脂肪来源的成体干细胞体外向软骨细胞诱导分化的研究

目的研究人脂肪来源的成体干细胞（ADSC）体外能否向软骨细胞成功分化，探讨其作为组织工程软骨种子细胞的可行性。方法自成人皮下取少量脂肪组织，经机械剪切及Ⅰ型胶原酶消化后获取成体干细胞，体外培养扩增；流式细胞仪鉴定细胞表型；第5代细胞采取离心管中微块法培养，培养液中加入转化生长因子（hTGF-β2）等诱导剂诱导其向软骨细胞分化；诱导14d的细胞团经消化后获得单细胞悬液，接种于玻片上行形态学观察，甲苯胺兰、免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）用以鉴定软骨细胞表型。结果从人体皮下脂肪组织中可成功分离到ADSC，细胞可于体外大量扩增；第5代细胞大多数表达CD29、CD90，而CD14、CD45抗原表达阴性；RT—PCR结果提示诱导后的细胞可表达黏多糖（GAG）及Ⅱ型胶原，诱导后的细胞块分离成单个细胞后可见其形态较诱导前发生明显变化，甲苯胺兰染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。对照组未加诱导因子的细胞则未能观察到上述变化。结论成人皮下脂肪组织中可分离到大量ADSC；ADSC可在体外成功诱导向软骨细胞分化；ADSC有望作为组织工程软骨构建中的种子细胞。