体外共培养体系中胆管癌细胞对内皮细胞的作用

目的 在体外共培养体系中研究胆管癌细胞对内皮细胞的作用.方法 建立胆管癌QBC939细胞与内皮细胞的体外共培养体系设为共培养组,同期单独培养的内皮细胞设为内皮细胞组,同样数量的内皮细胞和胆管癌细胞分别单独培养的上清液混合液设为混合组.对内皮细胞进行光镜及扫描电镜观察,并用免疫荧光法检测内皮细胞蛋白水解酶pp125焦点激酶(pp125FAK)、基质金属蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)、人尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活物(uPA)表达的变化,明胶酶谱法测定内皮细胞MMP-2及MMP-9的活性.采用配对t检验分析其结果.结果 与内皮细胞组比较,共培养组内皮细胞之间的间隙增大.内皮细胞组ppl25FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的平均荧光强度分别为394±51、455±82、377±48、422±55,而共培养组表达增强,分别为1096 ±128、931 ±72、815 ±76、801 ±56,两组比较差异有统计学意义(t=6.53,4.32,3.61,3.45,P<0.05).混合组MMP-2、MMP-9灰度扫描值分别为240.2±15.2和2.4±0.8.共培养组的MMP-2、MMP-9分别为687.4±43.6和150.9±13.2,两组比较差异有统计学意义(t=4.89,5.43,P<0.05).结论 共培养后的内皮细胞之间缝隙增大,蛋白水解酶表达增强,它可能参与降解内皮细胞外基质,促进了胆管癌的转移.     

腺病毒载体介导的双自杀基因对人胆管癌细胞QBC939的体外杀伤实验

目的观察腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(CD/TK)双自杀基因对人胆管癌细胞 QBC939的体外杀伤作用。方法 CD/TK 克隆入穿梭载体成为 pAdtrack-CMV-CD/TK,与骨架载体 pAdeasy-1在细菌内同源重组为 pAd-CD/TK,经 PacⅠ酶切,293细胞包装、扩增、纯化后,体外转染人胆管癌细胞 QBC939,并给予前药5-FC 或 GCV,观察其体外杀伤效果。结果含 CD/TK 基因的重组腺病毒鉴定正确,扩增纯化后,病毒滴度为1×10~(11)颗粒/ml。重组腺病毒对 QBC939细胞在感染倍数(m.o.i)为100时的转染效率为90%,在 m.o.i50感染时,0.1mmool/L的5-FC 及10 μmol/L 的 GCV 对 QBC939细胞的杀伤率为80%,明显高于单用5-FC 与 GCV 的效应。结论双自杀基因以腺病毒为载体对人胆管癌细胞转染效率高,体外杀伤效应明显。腺病毒介导的双自杀基因治疗有望成为治疗胆管癌的有效方法。     

载氟尿嘧啶聚乳酸碳纳米管复合材料对胃癌细胞株的体外杀伤效应

目的制备荷载氟尿嘧啶（5-Fu）的聚乳酸（PLLA）碳纳米管（CNT）复合材料（5-FU-PLLA-CNTs）,并探讨其对人胃癌细胞株（MGC803和MNK45）的体外杀伤效应。方法以PLLA—CNTs为原料,采用超声乳化法荷载5．FU;通过扫描电子显微镜观察5-FU—PLLA—CNTs形态和结构;用紫外可见光光度仪测定不同时间5-FU．PLLA．CNTs的5-FU释放量及累计释放量,并绘制体外释放曲线;设计实验组（不同浓度的5-Fu—PuA—CNTs）及阳性（相应浓度的5-FU）和阴性对照组（不加任何药物）,用CCK8法检测不同浓度的5-Fu．PLLA-CNTs对MGC803和MNK45的增殖抑制作用;流式细胞术检测5-FU—PuIA—CNTs作用前后细胞凋亡的变化。结果成功制备5-FU．PLLA．CNTs药物深层薄膜,薄膜载药率为（4．54±0．43）％,包封率（21．56±2．36）％。体外释放实验显示,5-FU-PLLA-CNTs在24h内释放率为23．9％,呈缓慢上升趋势,至31d体外累计释放率达85．3％。CCK8实验显示,与对照组比较,5．Fu—PLLA．CNTs对两株胃癌细胞具有明显抑制作用（P〈0．01）,随着药物浓度的增加,抑制作用增强;随着作用时间的延长,呈持续抑制状态。流式细胞仪显示,经1mg／孔5-Fu-PuJA。CNTs处理的实验组MGC803和MNK45细胞凋亡率与阴性对照组比较,差异具有统计学意义（均P〈0．05）;与阳性对照组比较,差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论5-FU-PLLA-CNTs具有良好的药物缓释性能,对胃癌细胞株具有明显的杀伤和抑制增殖作用,其最佳浓度为1mg／孔。     

载5-氟尿嘧啶聚乳酸纳米微粒瘤内注射治疗胃癌

目的观察生物可降解5-氟尿嘧啶聚乳酸纳米微粒（5-Fu-NPs）注射缓释剂用于肿瘤内局部给药的抗肿瘤活性。方法36只（SCID）小鼠随机分为6组，分别瘤内注射生理盐水的对照组、瘤内注射5．Fu．NPs（包括5-Fu20mg／kg体重和5-Fu30mg／kg体重）、无载药NPs、5-Fu注射液及腹腔注射5-Fu注射液，每3d瘤内给药1次共3次。观察荷瘤鼠肿瘤生长、荷瘤鼠给药前、后血象及给药后肿瘤组织凋亡指数。结果瘤内注射5-Fu-NPs缓释剂组小鼠肿瘤生长缓慢，瘤体明显小于5-Fu（含5-Fu20mg／kg体重）腹腔注射给药组，相应的抑瘤率分别为2．93％、22．87％、27．57％、41．64％和50．43％，其中以瘤内注射5-Fu-NPs对小鼠胃癌有较高抑瘤率，呈现良好的量效关系，且对骨髓的副作用为最小。结论瘤内应用5-Fu-NPs缓释剂的抗肿瘤效果优于局部和全身单纯5-Fu给药。     

表皮生长因子受体抑制剂联合5-氟尿嘧啶对胆管癌细胞增殖与迁移、侵袭能力的影响

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对胆管癌细胞体外增殖、迁移和侵袭的影响。方法:体外培养人胆管癌QBC939细胞,分别用AG1478(10μmol/L)、5-FU(100 mg/L)以及联合两药处理24 h后,分别采用CCK-8法、划痕试验、Matrigel侵袭小室法检测细胞增殖、迁移及侵袭情况。结果:AG1478与5-FU单独作用后,QBC939细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显降低(均P0.05),而与任一单独用药比较,联合用药对细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用均明显增强(均P0.05)。结论:EGFR抑制剂与5-FU联合应用可能是抑制胆管癌细胞生长、迁移和侵袭有效方法。     

脂质体华卟啉钠的制备及其对胆管癌细胞的体外光动力杀伤效应研究

目的:探讨脂质体华卟啉钠(DVDMS-L)的制备及其对胆管癌细胞的光动力杀伤效应。方法:采用薄膜-水化法制备DVDMS-L,并检测其粒径、电位及包封率。分别用相同浓度梯度(0、0.06、0.12、0.25、0.5、1μmol/L)的DVDMS-L与游离华卟啉钠(DVDMS),光照强度10J/cm~2条件下,作用于胆管癌HICC-9810细胞4h后,用CCK8法检测两者对人胆管癌HICC-9810细胞的光动力杀伤效果。结果:所制得的DVDMS-L平均粒径为(113.7±14.2)nm,Zeta电位为-(24.5±3.2)mV,包封率为(61.74±1.49)%;在光照条件下,HICC-9810细胞在DVDMS-L与DVDMS处理后存活率均明显降低,并浓度依赖性,但相同浓度(0.12～1μmol/L)下的DVDMS-L的作用明显强于DVDMS,两者的IC_50分别为0.11、0.29μmol/L(均P0.05)。结论:成功制备DVDMS-L,其对人胆管癌细胞的体外光动力杀伤效应优于游离DVDMS。     

5-氟尿嘧啶聚乳酸载药纳米微粒对人胃癌和结肠癌细胞株的体外杀伤效应

目的探讨5-氟尿嘧啶聚乳酸载药纳米微粒(5-Fu-PLA-NP)对人胃癌和结肠癌细胞株的体外杀伤效应。方法超声乳化法制备5-Fu-PLA-NP载药纳米微粒;用噻唑蓝(MTT)比色法从1~10d连续检测1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L浓度5-Fu-PLA-NP和5-Fu对人胃癌细胞株MGC803和结肠癌细胞株SW620的体外杀伤效应,并计算出2种药物的半数抑制率浓度IC50和对肿瘤细胞的生长抑制率。结果5-Fu-PLA-NP的体外累积药物释放率在7d时为75.7%,10d时达94.3%;5-Fu的杀伤效应在1~7d时呈时间依赖关系,7d后进入平台期;5-Fu-PLA-NP则在1~10d均呈时间依赖关系;7d时两者在不同剂量的杀伤效应均呈剂量依赖关系,并且两者间差异无统计学意义。结论5-Fu-PLA-NP具有药物缓释效应,可延长药物对人胃癌与结肠癌细胞的有效作用时间;并且载药纳米微粒没有降低5-Fu成分的生物学活性。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

辛伐他汀对胆管癌细胞周期相关蛋白的作用

目的了解辛伐他汀对胆管癌细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E、CDK4及pRB的作用。方法体外实验使用辛伐他汀处理胆管癌细胞EGI-124 h和48 h后,利用CCK-8试剂盒测定肿瘤细胞增殖情况,其后实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E、CDK4及pRB的mRNA,根据结果再用Western blotting验证相应蛋白的表达水平。体内实验使用EGI-1接种于12只NOD-SCID小鼠皮下,成瘤后随机分为实验组和对照组,每组6例。实验组每天按照20 mg/kg的辛伐他汀灌胃,对照组每天喂予同剂量的药物溶剂。24 d后取出移植瘤测量体积并进行免疫组织化学染色,明确上述蛋白的体内表达水平。结果辛伐他汀处理对胆管癌细胞EGI-1有增殖抑制作用,呈现药物的浓度依赖性,其24 h及48 h的半抑制浓度数值分别为(8.27±0.77)μmol/L和(5.90±1.81)μmol/L。辛伐他汀处理48 h的EGI-1细胞内Cyclin D1、CDK4和pRB mRNA表达显著下调(P<0.05),而Cyclin E mRNA表达差异无统计学意义。相应地,EGI-1细胞内Cyclin D1、CDK4、pRB蛋白也被抑制,与mRNA的结果保持一致;同时随药物时间延长,抑制作用增强。体内实验显示,辛伐他汀可抑制小鼠移植瘤生长,免疫组织化学分析显示实验组小鼠移植瘤细胞Cyclin D1、CDK4、pRB蛋白下调(P<0.05)。结论辛伐他汀可通过下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、pRB抑制胆管癌细胞增殖。     

PTTG对胆管癌细胞生长和5-FU敏感性影响的研究

目的探讨抑制垂体瘤转化基因(PTTG)表达后胆管癌细胞体外生长的变化及其对5-FU化疗敏感性的影响。方法将反义PTTG真核表达载体pcDNA3.1-PTTGas和空白载体pcDNA3.1(+)转染入胆管癌细胞株QBC939中,筛选获得稳定表达株tQBC939(PTTG-)和tQBC939(pcDNA3.1),并设立未转染的QBC939细胞对照组,绘制细胞生长曲线,以MTT法检测细胞增殖力的变化,流式细胞仪检测细胞周期的比例变化,并采用5-FU处理细胞后,以MTT检测3组细胞的生长抑制率,计算IC50值,流式细胞仪和Hoechst染色法检测各组细胞凋亡情况。结果 tQBC939(PTTG-)组与tQBC939(pcD-NA3.1)组和QBC939组比较,前者生长较为迅速,S期细胞比例增多,G2/M期细胞比例减少(P0.05),增殖指数较高(P0.05);经5-FU处理后,tQBC939(PTTG-)的IC50值明显低于tQBC939(pcD-NA3.1)和QBC939细胞(P0.05),细胞凋亡增多。结论转染PTTG反义DNA可增强胆管癌细胞的增殖力和对5-FU化疗的敏感性。     

叶酸靶向修饰纳米粒加载5-氟尿嘧啶治疗胆管癌的实验研究

目的:探讨叶酸修饰纳米粒(药物载体)载5-氟尿嘧啶(5-FU)对胆管癌的疗效及安全性.方法:用MTT法检测无修饰和叶酸修饰纳米粒及两者加载5-FU对胆管癌QBC939细胞体外生长的影响;在荷QBC939细胞移植瘤裸鼠模型上,以生理盐水为对照,比较5-FU,载5-FU纳米粒,载5-FU叶酸修饰纳米粒对移植瘤的抑制作用;用不同浓度的叶酸修饰纳米粒孵育大鼠肝脏BRL3A细胞和肾脏NRK细胞24 h,观察其毒性作用.结果:体外实验表明,无论纳米粒修饰与否,对QBC939细胞生长均无明显影响,但两者载5-FU后对细胞生长的抑制作用均明显强于单独的5-FU作用,且载5-FU叶酸修饰纳米粒的作用更为明显(均P＜0.05);5-FU,载5-FU纳米粒,载5-FU叶酸修饰纳米粒对移植瘤生长的抑制率分别为56.0％,61.5％,74.4％,各组间差异均有统计学意义(均P＜0.05);与不同浓度叶酸修饰纳米粒孵育后,BRL3A细胞和NRK细胞的形态均无明显改变.结论:叶酸修饰的纳米载药系统具有良好的特异性、靶向性及生物安全性,叶酸修饰载5-FU纳米粒对胆管癌有良好的疗效.     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

microRNA let-7a对胆管癌细胞凋亡和周期的影响

目的:探讨microRNA(miRNA) let-7a在胆管癌组织中的表达及其意义.方法:用Real-time PCR检测let-7a在胆管癌与正常胆管组织中的表达;将胆管癌HuCCT-1细胞分为let-7a过表达组(转染let-7a mimics),阴性对照组(转染阴性对照序列)和空白对照组(无转染),分别用Real-time PCR和流式细胞仪检测各组细胞let-7a的表达,细胞凋亡和周期情况.结果:let-7a在胆管癌组织中表达较正常胆管组织明显下调(P＜0.01);与空白对照组比较,let-7a过表达组HuCCT-1细胞的let-7a表达明显升高,细胞凋亡率明显增加(均P＜0.01),而阴性对照组与空白对照组间无统计学差异(均P＞0.05);各组间细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论:胆管癌组织中let-7a表达下调,let-7a表达下调抑制了细胞凋亡,从而可能在促进胆管癌发生与发展中起了重要作用.     

奥曲肽对人胆管癌QBC939裸鼠种植瘤的抑制作用

目的:探讨奥曲肽(OCT)对人胆管癌QBC939裸鼠种植瘤的作用及其可能的机制。方法:建立人胆管癌QBC939裸鼠种植瘤模型12只,随机均分为实验组和对照组,分别皮下注射OCT[100μg/(kg.d)]和等体积生理盐水,1次/d,连续4周,最后1次给药24 h后处死裸鼠,完整剥除瘤块,测量瘤体体积和重量,计算实验组抑瘤率;采用免疫组织化学方法分别检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在两组瘤组织中的表达情况及计数微血管密度(MVD);应用TUNEL法检测两组瘤组织凋亡情况。结果:实验组的种植瘤体积和重量明显小于对照组[(1934.85±272.88)mm3 vs.(2834.63±521.86)mm3;(1.77±0.23)g vs.(2.44±0.65)g](均P<0.05),实验组抑瘤率为29.20%;实验组瘤组织中HIF-1α的表达量和MVD况均明显少于对照组[(0.2605±0.0406)vs.(0.3284±0.1008);(13.61±1.87)vs.(17.44±2.24)](均P<0.05);实验组瘤组织的凋亡指数(AI)明显大于对照组(P<0.05)。结论:OCT对人胆管癌裸鼠种植瘤生长具有抑制作用,其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成有关。     

精准外科技术在肝门部胆管癌手术治疗中的应用

目的:探讨精准外科技术在肝门部胆管癌手术治疗中的应用及治疗效果.方法:回顾性分析2007年5月-2012年12月应用精准外科技术行手术治疗的44例肝门部胆管癌患者的临床资料.结果:44例患者中行R0切除19例(43.2％),R1切除7例,R2切除5例,姑息性手术5例,活检加内/外引流8例;联合肝切除18例,联合肝固有动脉切除重建2例.手术平均用时为(5.8±1.6)h,术中平均出血量为(810±509)mL,术后发生各种并发症28例次,术后1个月内死亡1例(1/44).39例患者获得随访4～62个月,总体术后1,3,5年生存率分别为67.7％,30.8％,10.6％.R0根治性切除者术后1,3,5年生存率分别为93.3％,43.2％,13.9％.非根治性切除手术术后1,3,5年生存率分别为50.5％,26.8％,0,获R0根治性切除者生存率明显高于非根治性手术患者(x 2=4.61,p＜0.05);联合肝叶切除术后1,3,5年生存率分别为94.1％,52.7％,11.8％,未行联合肝叶切除的术后1,3,5年生存率分别为69.2％,25.4％,0,前者生存率明显高于后者(x2=15.26,P＜0.05).结论:精准外科技术在肝门部胆管癌手术治疗中的应用,可提高其根治性手术切除率,减少术后并发症的发生率,改善治疗效果.     

胆管癌干细胞研究进展

肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有干细胞特性的细胞群体,具有自我更新和分化为多种恶性肿瘤细胞能力,拥有特征性的分子标记物与信号通路。笔者就用以鉴定胆管癌干细胞的各类标志物及信号通路进行阐述,并结合胆管癌干细胞的靶向治疗方面进行讨论。     

肝门部胆管癌的手术治疗：附102例报告

目的探讨肝门部胆管癌的手术治疗方式。方法回顾性分析1990年8月-2003年8月我院收治的102例肝门部胆管癌的临床资料。结果102例肝门部胆管癌中，58例（56．9％）行手术切除，其中27例（26．5％）行根治性切除，31例（30．4％）行姑息性切除；44例（43．1％）行胆管引流术，其中行胆肠吻合内引流术20例，胆管外引流术24例。根治性切除术组1，2，3，5年生存率分别为88．89％，51．85％，37．03％，22．22％；姑息性切除术组1，2，3，5年生存率分别为51．61％，6．45％，3．22％，0％；胆肠吻合内引流术组和胆管外引流术组的1年生存率分别是29．41％和23．80％，无生存2年者。结论手术切除，特别是根治性切除治疗肝门部胆管癌可取得较好的疗效。     

肝胆管结石合并肝胆管癌的临床诊治特点

目的探讨肝胆管结石合并肝胆管癌的临床表现及诊治特点。方法回顾性分析54例肝胆管结石合并肝胆管癌的临床资料、诊断及治疗情况。结果结石伴发肝胆管癌的发生率为11．8％。由于缺乏特异性临床表现，该合并症术前诊断困难，术前能明确诊断者仅占11．1％。根治性切除率仅占51．8％，根治性切除者预后较未切除者为好（P≤0．05）。结论长期反复发作的肝胆管结石易合并胆管癌，该病早期诊断困难，疗效差，预后不良，因此，肝胆管结石，特别是反复发作的肝胆管结石应及早手术。对于术中确诊为肝胆管癌者，应争取行根治性切除，可能获得良好的预后。