L—亮氨酸对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制

目的确定Ｌ－亮氨酸对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制类型，并探讨其抑制机理。方法应用分光光度法分别测定有Ｌ－Ｌｅｕ和无Ｌ－Ｌｅｕ存在下的酶活力，根据其活力变化求出酶酶的相对活力；用双倒数作图法，确定Ｌ－Ｌｅｕ对ＰＬＡＰ的抑制类型并求出其抑制常数；同时也观察了ＰＨＣ对抑制作用的影响。     

五氯酚对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制

（１）目的：探讨五氯酚（ＰＣＰ）对人类胎盘碱性碱酸酶（ＰＬＡＰ）的作用，为ＰＣＰ中毒的防治提供理论依据。（２）方法：应用比色法分别测定有ＰＣＰ和无ＰＣＰ存在下ＰＬＡＰ的酶活力，根据其活力变化求出酶的相对活力；用双倒数作图法，确定ＰＣＰ对ＰＬＡＰ的抑制类型并求其抑制常数（Ｋ１）（３）结果：ＰＣＰ的存在抑制下了酶活力，当ＰＣＰ的浓度在６ｍｍｏｌ／Ｌ之内，随其浓度的增加而酶活力逐渐降低，当ＰＣＰ的浓度为     

铅对人类胎盘碱性磷酸酶活力与构象的影响

目的研究铅对人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）的作用，以探讨铅影响胎儿发育的分子机制。②方法应用分光光度法测定不同浓度Ｐｂ（ＮＯ３）２存在下的ＰＬＡＰ活力，用荧光法检测其荧光光谱的变化；用双倒数作图法确定Ｐｂ（ＮＯ３）２对该酶的抑制类型。③结果低浓度的Ｐｂ（ＮＯ３）２（＜０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ）对酶活力无明显影响，但其内源荧光强度略有增加，发射峰位蓝移；当Ｐｂ（ＮＯ３）２的浓度为０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力及其荧光强度均迅速下降；当Ｐｂ（ＮＯ３）２浓度＞０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，随其浓度的增加，酶活力与其荧光强度逐渐降低，但发射峰位蓝移减少；当Ｐｂ（ＮＯ３）２浓度为１０．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力丧失，荧光熄灭。Ｐｂ（ＮＯ３）２是ＰＬＡＰ的反竞争性抑制剂，其抑制常数为１．４０ｍｍｏｌ／Ｌ．④结论Ｐｂ（ＮＯ３）２抑制了ＰＬＡＰ的活力，并使其构象发生了改变，这可能是铅影响胎儿发育的重要分子机制之一。     

铅对人类胎盘碱性磷酸酶活力与构象的影响

研究铅对人类胎盘性碱磷酸 的作用，以探讨铅影响台儿发育的分子机制。（２）方法应用分光光度法测定不同浓度Ｐｂ（ＮＯ３）２存在下的ＰＬＡＰ活力，用荧光法检测其荧光光谱的变化；用双倒数作图法确定Ｐｂ（ＮＯ３）２对该酶的抑制类型。     

汞对人类胎盘碱性磷酸酶活力与荧光光谱的影响

目的研究汞对人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）活力及其荧光光谱的影响,以探讨汞对ＰＬＡＰ抑制的分子机制。②方法应用分光光度法测定不同浓度ＨｇＣｌ２存在下的酶活力,用荧光法检测其荧光光谱;用双倒数作图法确定ＨｇＣｌ２对该酶的抑制类型。③结果当ＨｇＣｌ２浓度为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶活力及其荧光强度迅速下降,最大发射峰位由３４７ｎｍ蓝移至３４０ｎｍ;ＨｇＣｌ２浓度为０．２５～１．００ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶活力、荧光强度及峰位均无显著变化;当ＨｇＣｌ２浓度＞１．００ｍｍｏｌ／Ｌ时,随其浓度增加,酶活力和荧光强度又快速下降,但峰位不变;ＨｇＣｌ２浓度高达１０．００ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶仍有部分活力。ＨｇＣｌ２是ＰＬＡＰ混合性抑制剂,其抑制常数为３．６０ｍｍｏｌ／Ｌ．④结论ＨｇＣｌ２抑制了ＰＬＡＰ的活力,并使其构象发生了改变。     

小牛肠碱性磷酸酶激活与抑制的动力学观察

应用磷酸苯二钠法观察了某些羟基化合物、氨基酸对小牛肠碱性磷酸酶（ＥＣ３．１．３．１）活力的影响。结果表明，葡萄糖、蔗糖、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺是其激活剂；而丙氨酸（Ａｌａ）、羟脯氨酸（Ｈｙｐ）、丝氨酸（Ｓｅｒ）、苏氨酸（Ｔｈｒ）、谷氨酸（Ｇｌｕ）、精氨酸（Ａｒｇ）、苯丙氨酸（Ｐｈｅ）是其抑制剂。应用双倒数作图法对其抑制类型和抑制常数Ｋｉ进行了测定，同时也测定了Ｎａ２ＨＰＯ４，ＮａＨ２ＰＯ４的抑制类型和抑制常数Ｋｉ．结果表明，Ｐｈｅ为其反竞争性抑制剂；其他氨基酸均为非竞争性抑制剂；而Ｎａ２ＨＰＯ４，ＮａＨ２ＰＯ４为其竞争性抑制剂。并对其激活与抑制的机理进行了讨论。     

人类胎盘碱性磷酸酶部分性质的研究

目的探讨纯化的人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）的部分性质,为其结构与功能的研究积累资料。②方法应用分光光度法观察了温度、酸碱度及抑制剂对酶活力的影响;同时对其紫外吸收光谱进行了测定。③结果在该实验条件下,酶的最适温度为６５℃,对热稳定,－２５℃冷冻后酶的活力明显下降;最适ｐＨ为１１．０,在ｐＨ７．０～１１．５之间稳定;以对硝基酚磷酸二钠为底物,其Ｋｍ值为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ;Ｌ－苯丙氨酸是ＰＬＡＰ的反竞争性抑制剂,其抑制常数为２．３５ｍｍｏｌ／Ｌ,而ＮａＨ２ＰＯ４是ＰＬＡＰ的竞争性抑制剂,其抑制常数为０．９９ｍｍｏｌ／Ｌ;酶蛋白的最大紫外吸收波长为２８０ｎｍ．④结论了解纯化ＰＬＡＰ的上述性质,有助于其结构与功能的研究。     

吡喹酮代谢的特异抑制剂一硝苯吡啶及有关细胞色素P450同功酶的探讨

硝苯吡啶（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ，ＮＦ）在人肝徽粒体内对（－）－和（＋）－ＰＱＴ的代谢均有竞争性抑制作用，抑制原药消除的Ｋｉ分别为１．４和６．１μｍｏｌ／Ｌ有明显立体选择性，抑制（－）－ＰＱＴＭＩ生成的Ｋｉ为１．５μｍｏｌ／Ｌ；在大鼠肝微粒体内，ＮＦ对（－）－ＰＱＴ代谢的抑制作用远比在人肝微粒体内弱，其抑制（－）－和（＋）－ＰＱＴ原药消除的Ｋｉ分别为１１．６和１０μｍｌ／Ｌ，抑制（－）－ＰＱＴ代谢物生成的Ｋｉ为１０μｍｏｌ／Ｌ。然而，ＮＦ在人肝微粒体内对美多洛尔α－羟化酶和乙基吗啡Ｎ－脱甲基酶几乎无抑制作用，对７－乙氧基香豆素Ｏ－脱乙基酶仅有较弱的抑制作用，说明ＮＦ是ＰＱＴ特别是（－）－ＰＱＴ代谢的特异抑制剂。     

两面针碱对钙调蛋白依赖环核苷酸磷酸二酯酶的抑制作用

以钙调蛋白依赖环核苷酸磷酸二酯酶（ＣａＭ－ＰＤＥ）为分子模型，应用正文试验证实两面针碱（Ｎｉ－ｔｉｄｉｎｅ，Ｎｉｔ）是一种新的ＣａＭ拮抗剂。实验结果表明：①：Ｎｉｔ抑制ＣａＭ－ＰＤＥ活性ＩＣ５０为８６μｍｏｌ／Ｌ。②７５μｍｏｌ／ＬＮｉｔ对０～８０ｎｇ／ｍｌＣａＭ存在下，ＣａＭ－ＰＤＥＶｍａｘ基本不变，半激活浓度（ＡＣ５０）增大，抑制常数（Ｋｉ）为６６μｍｏｌ／Ｌ。提示Ｎｉｔ以竞争方式拮抗ＣａＭ对其靶酶（ＰＤＥ）的活化。③７５μｍｏｌ／ＬＮｉｔ对ＣａＭ－ＰＤＥ抑制动力学研究：改变底物（ｃＡＭＦ）浓度，ＣａＭ－ＰＤＥ的Ｖｍａｘ减少，米氏常数（Ｋｍ）值增大，Ｋｉ为６４μｍｏｌ／Ｌ，α＞１。提示Ｎｉｔ对ＣａＭ－ＰＤＥ的抑制作用是非竞争一竞争性混合型抑制。由此推测Ｎｉｔ可能通过与ＣａＭ竞争酶分子上的ＣａＭ结合位点从而抑制ＣａＭ－ＰＤＥ的激活活性。     

吡喹酮代谢的特异抑制剂—硝苯吡啶及有关细胞色素P450同功酶…

硝苯吡啶在人肝微粒体内对（－）－和（＋）－ＰＱＴ的代谢均有竞争性抑制作用，抑制原药消除的Ｋｉ分别为１．４和６．１μｍｏｌ／Ｌ，有明显立体选择性，抑制（－）＝ＰＱＴ ＭＩ生成的Ｋｉ迷１．５μｍｏｌ／Ｌ；大大鼠肝微粒体内，ＮＦ对（－）－ＰＱＴ代谢的抑制作用远比在人肝微粒体内弱，其抑制（－）－和（＋）－ＰＱＴ原药消除的Ｋｉ分别为１１．６和１０μｍｌ／Ｌ，抑制（－）－ＰＱＴ代谢生成的Ｋｉ为１０μｍｏｌ／Ｌ     

五氯酚对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制

①目的 探讨五氯酚(PCP)对人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的作用,为PCP中毒的防治提供理论依据。②方法 应用比色法分别测定有PCP和无PCP存在下PLAP的酶活力,根据其活力变化求出酶的相对活力;用双倒数作图法,确定PCP对PLAP的抑制类型并求其抑制常数(K_1)。③结果PCP的存在抑制了酶活力。当PCP的浓度在6mmol/L之内,随其浓度的增加而酶活力逐渐降低;当PCP的浓度为6mmol/L时,酶的相对活力为52.4%．PCP是PLAP的非竞争性抑制剂,其K_1为3.49mmol/L.④结论PCP对PLAP有抑制作。     

三乙醇胺染毒大鼠对碱性磷酸酶的抑制类型的作用

目的　实验测定三乙醇胺对大鼠碱性磷酸酶 (ALP)活性的影响。方法　按照经典酶学方法 ,观察不同浓度三乙醇胺对大鼠血清ALP的抑制作用 ,探讨三乙醇胺对溶液ALP的抑制类型 ,用Dixon和Cronish Bowden作图法分别求出Ki与Ki’。结果　三乙醇胺对溶液ALP的抑制作用属混合型抑制作用 ,其Ki=0 .0 2 4mmol L ;Ki’ =0 .0 0 65mmol L。结论　三乙醇胺对大鼠血清ALP有混合型抑制作用。     

Inhibition of Xanthine Oxidase Activity by Gnaphalium Affine Extract

Objective To evaluate the inhibitory effect of Gnaphalium affine extracts on xanthine oxidase （XO） activity in vitro and to analyze the mechanism of this effect. Methods In this in vitro study, Kinetic measurements were performed in 4 different inhibitor concentrations and 5 different xanthine concentrations （60, 100, 200, 300, 400 μmol/L）. Dixon and Lineweaver-Burk plot analysis were used to determine Ki values and the inhibition mode for the compounds isolated from Gnaphalium affine extract. Results Four potent xanthine oxidase inhibitors were found in 95% ethanolic （v/v） Gnaphalium affine extract. Among them, the flavone Eupatilin exhibited the strongest inhibitory effect on XO with a inhibition constant （Ki） of 0.37μmol/L, lower than the Ki of allopurinol （4.56 mol/L）, a known synthetic XO inhibitor. Apigenin （Ki of 0.56μmol/L, a proportion of 0.0053‰in Gnaphalium affine）, luteolin （Ki of 2.63 μmol/L, 0.0032‰ in Gnaphalium affine） and 5-hydroxy-6,7,3’,4’-tetramethoxyflavone （Ki of 3.15μmol/L, 0.0043‰ in Gnaphalium affine） also contributed to the inhibitory effect of Gnaphalium affine extract on XO activity. Conclusions These results suggest that the use of Gnaphalium affine in the treatment of gout could be attributed to its inhibitory effect on XO. This study provides a rational basis for the traditional use of Gnaphalium affine against gout.     

地骨皮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其降血糖作用机制探讨

目的:研究地骨皮提取物(CLE)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并对其降血糖的作用机制进行探讨。方法:提取大鼠小肠中α-葡萄糖苷酶,采用葡萄糖试剂盒测定酶活力;通过体外抑制实验和离体器官实验测定反应体系中葡萄糖浓度和淀粉光密度值,分别计算药物对蔗糖酶和淀粉酶的抑制率;以底物浓度的倒数作为横坐标,以反映速率的倒数作为纵坐标,双倒数作图判断CLE对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型。结果:大鼠小肠酶活力值为77.4个活力单位;与正常对照比较,CLE低、中、高剂量组对蔗糖酶的抑制率明显增加(P<0.05,P<0.05,P<0.01);与正常对照比较,CLE低、中、高剂量组对淀粉酶抑制率明显增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01);抑制曲线实验表明,最大反应速度随CLE浓度的变化而变化,但米氏常数Km不变。结论:CLE对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用。     

用4-硝基-1-萘基磷酸酯为底物测定碱性磷酸酶活性

目的：合成4-硝基-1-萘基磷酸酯 (4-nitro-1-naphthyl phosphate,NNPP)为显色底物测定牛小肠粘膜碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)。方法：4-硝基-1-萘酚(4-nitronaphthol, 4-NNP)与三氯氧磷反应,经硅胶柱纯化制得NNPP;检测产物吸收跟踪水解过程测定初速度,双倒数法测定米氏常数(Michaelis-Menten constant, Km)。结果：ALP水解NNPP产物最大差吸收峰接近460 nm,等吸收波长接近405 nm。与p-硝基苯酚相比,在pH 6.0~7.0间4-NNP消光系数为其3倍以上,在pH 7.0以上为其2倍以上。ALP对NNPP的Km约12?mol/L而p-硝基苯基磷酸酯的Km约35?mol/L,产物磷酸相对NNPP的竞争性抑制常数接近20?mol/L。ALP催化NNPP水解效率接近水解p-硝基苯基磷酸酯的40％。结论：NNPP可用于测定ALP活性, 且有望与作用于p-硝基苯酚类显色底物的其它酶联用实现单通道两种酶同步测定。     

番石榴叶水提取物对糖尿病小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响

目的 研究番石榴叶水提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用.方法 蒸馏水浸提、浓缩、干燥制备番石榴叶水提取物.昆明小鼠链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病模型,以小鼠小肠粘膜生理盐水匀浆液作为α-葡萄糖苷酶,与双糖底物孵育,比色法测定葡萄糖产量代表α-葡萄糖苷酶的活性.比较正常小鼠和糖尿病小鼠小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性,以及番石榴叶水提取物对小肠粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影响,Lineweaver-Burk作图判断水提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型.结果 番石榴叶水提取物对小肠α-葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作用,并呈剂量效应关系;对蔗糖酶和麦芽糖酶的半数抑制浓度(IC50)分别为1.0 g/L和3.0 g/L,抑制作用类型为竞争性和非竞争性混合型.结论 番石榴叶水提取物具有抑制糖尿病小鼠小肠粘膜α-葡萄糖苷酶作用.     

鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶活性检测方法的建立

 目的  建立鼠源吲哚胺2,3-双加氧酶 (mouse indoleamine 2,3-dioxygenase,mIDO) 活性检测方法。方法 利用基因工程方法表达纯化重组mIDO (recombinant mIDO,rmIDO),建立酶水平mIDO活性检测体系;构建过表达mIDO的小鼠Lewis肺癌 (Lewis lung cancer,LLC) 细胞株,建立细胞水平mIDO活性检测体系。比较L-1-甲基色氨酸 (L-1-methyl tryptophan,L-1-MT) 在酶及细胞水平上对mIDO及人源IDO （human IDO,hIDO）的抑制作用,测定抑制类型、抑制常数Ki值及半数抑制浓度 (IC50) 值。 结果 L-1-MT对mIDO和hIDO均有抑制作用,抑制类型及抑制常数Ki值相似,但IC50值在酶水平及细胞水平上均有差异。 结论 mIDO酶活性检测体系是筛选IDO抑制剂的有效工具,与hIDO酶活性检测体系联用,能反映种属差异,可更好地利用小鼠模型来替代人类进行IDO抑制剂治疗疾病的研究。     

ENZYME KINETIC STUJDIES WITH BETA-LACTAMASES AGAINST CEFOTAXIME AND OTHER CEPHALOSPORINS*

Enzyme stability and enzyme kinetic studies with plasmid.mediated and chromosome-mediated beta- lactamases against cefotaxime, cefoperazone and other cephalosporins were performed using spectro- photometry. Beta-lactamases were extracted from granvnegative organisms and identified by isoelectric focusing with the special reagent nitrocefin. The relative hydrolysis rate (%), Michaelis-Menten constant (Km), maximum velocity (Vmax) and inhibition constant (Ki) were obtained and used as indicators for comparative study of enzyme stability in six cephalosporins. The affinity of compounds bindinp; to target sites of beta-lactamases was also determined. The results show that cefotaxime is the most enzyme stable drug among the cephalosporins studied. The Vmax of TEM-1, SHV-I and P99 enzyme hydro lyzing cefotaxime was less than 0.10% as compared with cephaloridine. Cefotaxime demonstrates high affinity to the chromosmm>mediated enzyme P99, and its Ki value is 0.036 µm. Cefoperazonc exhibits less enzyme inhibitory activity and is unstable with most of the beta-lactamases used.