胚胎干细胞的定向心肌分化及其调控机制

胚胎干细胞是具有分化为各种类型组织细胞潜能的全能干细胞,可在体外大量扩增,细胞因子、激素、诱导剂和细胞内转录因子等可诱导和调控胚胎干细胞进行心肌细胞定向分化,这将使干细胞移植治疗心肌损伤性疾病成为可能.探讨胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化及其调控机制,进而可在体内外调控干细胞向心肌细胞的定向分化,这将为临床应用干细胞分化新生心肌细胞以治疗心肌损伤性疾病提供理想的细胞来源和可靠的理论依据.     

成熟心肌细胞诱导胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞

目的： 拟证实成熟心肌细胞对胚胎干细胞（ESCs）定向分化的诱导作用。方法：分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI（4’6-联眯-2-苯基吲哚）染核作为细胞标记。取昆明小鼠3.5-4 d的囊胚培养后分离出ESCs,以1和（或）2代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞共培养。录像动态观察ESCs向心肌细胞分化的情况;分别于共培养后3、7、14 d对ESCs行肌钙蛋白T（cTnT）免疫荧光染色检测。结果：1代或2代的ESCs和/或细胞团与心肌细胞共培养约7 d左右出现成节律搏动的心肌样细胞;最好实验批次,可计数到1/4以上的ESCs和/或ESCs细胞团出现节律性搏动。心肌细胞共培养体系中添加0.6% DMSO时,节律搏动的心肌样细胞分化率未见提高。心肌细胞诱导组,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;ESCs与心肌成纤维细胞共培养诱导组,分化的细胞cTnT蛋白荧光染阴性;0.6% DMSO诱导组约3％的细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;DMSO联合心肌细胞诱导组,结果与单纯心肌细胞诱导组相似。结论：未经建系操作的ESCs可直接诱导分化为节律搏动的心肌细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞是ESCs定向分化较强的诱导因素。     

胚胎干细胞定向分化为运动神经元

最近研究表明胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESC）在体内外均可以发育分化出运动神经元细胞,这对于了解神经发育的机制和再生细胞治疗运动神经元的疾病具有重要的意义。本文就胚胎干细胞定向分化为运动神经元基因表达特点及其应用前景作一综述。     

胚胎干细胞定向分化的研究进展

胚胎干细胞已成为组织工程、发育生物学、药物开发及基因研究的热点。本文仅就胚胎干细胞定向分化的机制、研究进展和应用前景作一综述 ,旨在进一步推动胚胎干细胞的研究工作。     

心肌干细胞的提交分化及其调控机制

心肌细胞被认为是终末分化细胞,损伤后不能再生。但最近研究发现,成人心脏中存在多能心肌干细胞(cardiacstemcell,CSC),CSC能够再生为心肌。另外,全能胚胎干细胞(ES细胞)、多能成体祖细胞(MAPC)和成体多能干细胞(aMSC)具有向心肌分化的潜力,可用于心肌损伤后的修复治疗。ES细胞和MAPC作为CSC的前体细胞,在心肌梗塞的干细胞移植治疗方面需经过向心肌谱系的提交过程。本文综述了干细胞向心肌谱系的提交、分化及其调控机制。     

胚胎干细胞定向诱导分化为心肌细胞进展

在个体发育过程中，通常把那些具有自我复制能力并能在一定条件下分化形成一种以上类型细胞的多潜能细胞称为干细胞。根据其发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于胚胎干细胞具有在体外培养下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的潜能，使之成为一种研究哺乳动物细胞分化、组织形成过程的基本体系，以及临床移植治疗的新的细胞来源。人们利用胚胎干细胞建立了各种体外分化模型，本文将概述现今对胚胎干细胞定向诱导分化为心肌细胞方面的主要进展和趋势。     

心脏特异的转录因子在胚胎干细胞分化为心肌细胞中的作用

胚胎干细胞在没有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的条件下培养时可以分化成心肌细胞,这些细胞表达一些收缩蛋白,如肌浆球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)和肌球蛋白轻链-2V(ventricular myosin light chain,MLC2V)。很多研究者进一步从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达,结果表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C,MEF2C)和NKx2.5控制着心脏相关基因的表达,它们在心脏发生进程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现多条信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外,纯化胚胎干细胞源性心肌细胞用于治疗心肌梗塞亦是一个关键问题。然而,胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机理还有待进一步研究。     

心肌干细胞的定向分化和调控

在细胞因子、激素、药物、细胞间连接和细胞内转录因子等因素的诱导和调控作用下 ,CSC向心肌进行定向分化。如何正确筛选CSC应用于干细胞的移植治疗或对体内CSC向心肌的定向分化加以调控 ,对于临床合理利用CSC治疗心肌损伤性疾病将具有重要意义。明确CSC的生物学特性 ,探讨CSC向心肌的终末分化与调控机制 ,将为临床应用CSC治疗心肌梗死提供可靠依据     

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法 收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α－肌动蛋白（α-Actin）的表达。结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。     

维持胚胎干细胞不分化的信号传导机制

ES细胞的生物学功能是由复杂而精细的信号传导网络调控，其中在维持ES细胞不分化的过程中，分化抑制因子LIF、Oct—3／4起着重要作用。本文从信号传导这一崭新的角度综述了这两个因子的相关研究进展。     

Proliferation of mouse embryonic stem cell progeny and the spontaneous contractile activity of cardiomyocytes are affected by microtopography

The niche in which stem cells reside and differentiate is a complex physicochemical microenvironment that regulates cell function. The role played by three‐dimensional physical contours was studied on cell progeny derived from mouse embryonic stem cells using microtopographies created on PDMS (poly‐dimethyl‐siloxane) membranes. While markers of differentiation were not affected, the proliferation of heterogeneous mouse embryonic stem cell‐derived progeny was attenuated by 15 μm‐, but not 5 μm‐high microprojections. This reduction was reversed by Rho kinase and myosin light chain kinase inhibition, which diminishes the tension generating ability of stress fibers. Purified cardiomyocytes derived from embryonic stem cells also showed significant blunting of proliferation and increased beating rates compared with cells grown on flat substrates. Thus, proliferation of stem cell‐derived progeny appears to be regulated by microtopography through tension‐generation of contractility in the third‐dimension. These results emphasize the importance of topographic cues in the modulation of stem cell progeny behavior. Developmental Dynamics 238:1964–1973, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:采用5-氮胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞(M SCs)为心肌样细胞,对比分析诱导细胞与正常心肌细胞表型的差异,从而分析5-aza的诱导效应。方法:分离培养大鼠骨髓M SCs,通过检测不同浓度的5-aza诱导后M SCs表面CD 45、CD 54、CD 90分子的表达并与正常心肌细胞表型进行比较,以观察5-aza对间充质干细胞体外分化诱导的影响和作用。结果:5-氮胞苷能有效地诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞,诱导后的细胞表面均表达M H C和desm in分子。浓度为10μm ol/L的5-aza诱导组细胞表型更接近于心肌细胞。结论:M SCs在体外条件下经5-aza诱导可以分化为心肌样细胞,10μm ol/L的诱导浓度为最优浓度。     

胚胎源性干细胞分化研究的现状

目前,对于胚胎源性干细胞的分化研究已成为当今医学界研究的热点,但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题,近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展。将这三种胚胎源性干细胞从其分化机制及定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述。     

人胚胎干细胞RNA的细胞质和细胞核内的定位

目的探讨人胚胎干细胞(hESCs)中RNA细胞核和细胞质内分布信息。方法分离hESCs细胞质与细胞核后提取RNA并测序,生物信息学分析核和质中RNA定位特点,并使用RT-qPCR实验技术验证RNA的定位。结果 hESCs细胞质中RNA种类及其特异定位的RNA均多于细胞核,其中特异性定位在细胞质中的RNA有2 952个,细胞核中634个。结论描绘hESCs中RNA细胞核和细胞质定位图谱,鉴定了多个特异定位在细胞核与细胞质的RNA。     

持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a(100 µg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34⁺/Sca-1⁺,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100 µg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典Wnt/β-catenin信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34⁺/Sca-1⁺细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞（humanem bryonic stem cells,hESCs）分化为神经细胞的方法。方法采用直接的方法,在1%血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞。结果细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白（nestin）,以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ（neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin,TuJ1）。实验组nestin阳性细胞数占（95.2±3.03）%,明显高于未添加诱导因子组的（31.6±4.93）%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体（embryoid body,EB）的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索

目的探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系。方法首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs)。然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs。通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果。结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Sox1+的NPCs;NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs。第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mash1、BLBP高表达。第8代NSCs免疫荧光染色显示90%以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性。结论成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代。     

Culture and differentiation of embryonic stem cells

Summary Techniques are described for the culture of murine embryonic stem cells in the absence of heterologous feeder cells and for the induction of differentiation programs. The regulatory factor differentiation inhibiting activity/ leukaemia inhibitory factor (DIA/LIF) is produced at high concentration by transient expression in Cos cells and is used to suppress stem cell differentiation by addition to the culture medium. Differentiation is then induced in a controlled manner either by withdrawal of DIA/LIF or by exposure to the chemical inducers retinoic acid or 3-methoxybenzamide.     

体外构建胚胎干细胞生长分化的三维研究模型

目的以液态胶原为支架,小鼠胚胎干细胞(ESCs)为细胞模型,构建ESCs胶-原复合体,旨在尝试建立一种能够实现干细胞生长、分化的三维培养体系。方法提取鼠尾胶原,观察ESCs在自制胶原条带内增殖的形态特征,并测定葡萄糖/乳酸活性。以ESCs源心肌细胞为目的细胞,利用免疫组化、RT-PCR及电镜技术评价胶原条带内ESCs进行自发性分化的能力。结果ESCs在胶原条带所提供的三维培养体系内生长、增殖状态良好,且彼此间能够建立细胞连接。胶原条带内部分ESCs能够自发性分化为心肌细胞。该心肌细胞均可表达心肌蛋白cTn-T,心肌转录因子NKX2.5及肌球蛋白轻链MLC-2 vmRNA,且肌小节结构发育成熟。结论以液态Ⅰ型胶原为主体的支架材料可以为ESCs提供良好的生长基质,促进其组织化发育。该实验初步明确了体外构建干细胞生长分化三维模型的可行性。