1pcDNA3.1-Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达

目的构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。方法KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6,重组质粒pcDNA3.1(+/-)-Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。结果重组质粒经菌落PCR和KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。结论成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。     

正、反义VEGF基因转染对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖行为的影响

目的探讨正、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因对人增生性瘢痕成纤维细胞(HHSFb)增殖行为的影响。方法采用组织块法获取HHSFb,行细胞免疫化学鉴定。构建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正义组)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反义组)和空质粒pcDNA3.1(+)(空载体组)转染人成纤维细胞,以及未行转染处理的人成纤维细胞(对照组),共设为4组。经G418筛选获得阳性转染细胞克隆。逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)显示VEGF基因在细胞内的表达,上清行酶联免疫吸附反应(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平,MTT测定细胞体外生长情况。结果成功构建正、反义VEGF基因表达载体。经统计学分析,与对照组和空载体相比,正义组VEGF mRNA表达增强,蛋白表达增强;反义组VEGF mRNA表达明显减弱,蛋白表达明显降低。MTT结果显示,转染前后细胞体外生长速度基本一致。结论正义VEGF基因重组质粒对HHSFb内源性VEGF的表达有促进作用,反义VEGF基因重组质粒可有效抑制HHSFb内源性VEGF的表达。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

正、反义β1，4半乳糖基转移酶—I表达质粒的构建

目的：为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-1（β1,4-galactosyltransferase I, β-1,4-GalT-1）表达水平的生物学意义。方法；通过分子生物学手段，构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。设计β-1,4-GalT-I全长引物；提取小鼠脑总RNA，通过RT-PCR方法，得到全长β1,4-GalT-I基因片段，将其克隆到pGEM-T载体。再通过多克隆酶切位点，将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中。设计反义引物，以pGEM-β1,4-GalT-I质粒为模板，将P CR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果：通过酶切和测序证实，实验得到了正义、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。结论：正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建，为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础。     

小鼠Collectrin正反义真核表达载体的构建及其功能

目的:构建新基因Collectrin的正反义真核表达载体,研究其与细胞生长的关系.方法:以PCR的方法扩增Collectrin的开放阅读框序列,与载体pcDNA3.1/V5-His相连构成融合基因表达质粒.将重组后的质粒进行细菌转化,质粒扩增、纯化后,测序鉴定Collectrin的正义及反义序列.以脂质体介导的方法体外转染肾皮质集合管细胞系(M-1).以β-Gal staining的方法测定转染效率.分别行逆转录-PCR和Western blot,检测不同融合基因转染后细胞Collectrin mRNA和蛋白水平的表达变化.以四甲基偶氮唑蓝(MTF)参入法分别在第24小时、第48小时测定不同融合基因转染后细胞增殖活性.结果:M-1细胞在融合基因转染第24小时转染效率最高.Collectrin正义转染组较反义、空载体和正常对照组在核酸和蛋白水平表达量都显著增高,Collectrin反义转染组蛋白表达较其他组明显下调.反义转染组细胞较其他组明显减少.结论:成功构建了Collectrin正义及反义真核表达载体,Collectrin是维持细胞生长存活的重要元件.     

GATA-3基因表达质粒的构建及在大鼠脑细胞中的表达

[目的]构建GATA-3基因正义、反义重组质粒,为进一步研究GATA-3在T细胞发育分化中的作用提供基础.[方法]采用PCR技术扩增GATA-3基因,通过酶切、连接、转化等分子生物学技术,将该全长基因亚克隆至表达载体pCDNA3,构建质粒后转染大肠杆菌,并在大肠杆菌中扩增.同时用脂质体法感染大鼠脑细胞.[结果]从大鼠脑细胞中成功地克隆出全长1335 bp的GATA-3基因,并经序列分析筛选证实GATA-3基因以正向、反向重组转染入载体,且在大肠杆菌中得到扩增,同时用RT-PCR方法检测到反义重组体对大鼠脑细胞表达该基因具有抑制作用.[结论]通过基因克隆方法成功构建了GATA-3基因正义、反义表达质粒,并初步证实反义GATA-3具有抑制细胞正常表达作用,为深入研究GATA-3对T细胞发育分化的影响奠定了基础.     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ表达质粒的构建

目的:为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-I(β1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-1)表达水平的生物学意义.方法:通过分子生物学手段,构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.:设计β-1,4-GalT-I全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalT-I基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalT-I质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果:通过酶切和测序证实,实验得到了正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.结论:正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础.     

人类14-3-3β真核表达系统的构建

目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达.方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达.结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础.     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究(英文)

目的构建人核心蛋白聚糖(human decorin,hDCN)pcDNA3.1(+)真核表达载体,并探讨其对S180细胞在体内、体外的抗肿瘤效应及其作用机制。方法用PCR法从pPIC9K-DCN扩增hDCN核心蛋白分子编码序列的全长cDNA,与pcD-NA3.1(+)载体连接。将重组pcDNA3.1(+)-DCN质粒通过脂质体转染法转入小鼠肿瘤细胞S180中,用G418筛选出阳性克隆细胞,RT-PCR、双酶切及测序鉴定。流式细胞仪对转染了重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN、空质粒pcDNA3.1(+)的S180细胞和未转染的S180细胞进行细胞凋亡检测和细胞周期分析。分别注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180的细胞和未转染质粒的S180细胞到随机分组的小鼠腋部皮下,观察三组小鼠的肿瘤生长情况;处死三组小鼠后,分别剥离肿瘤组织做病理学检查。结果转染了DCN的S180细胞凋亡指数明显增高,G0/G1期细胞百分率明显高于其他两组,G2/M期、S期细胞百分率分别明显低于其他两组(P<0.01)。与注射pcDNA3.1(+)/S180和S180的小鼠相比,注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于其他两组(P<0.01)。结论成功构建了人核心蛋白聚糖真核表达载体。体外实验结果显示转染该表达载体的S180细胞凋亡指数明显增高,且凋亡多发生在G0/G1期;转染DCN表达载体的S180细胞在实验动物体内成瘤性降低,提示转染DCN在实验动物体内外都能表现抑瘤效应。     

人类细胞周期蛋白D3反义表达质粒的构建

目的：构建人类细胞周期蛋白D3(cyclin D3)反义表达质粒，为今后利用反义核酸阻断技术研究cyclin D3基因的功能提供基础。方法：运用DNA重组技术将人cyclin D3基因反向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，构建成cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclinD 3。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，实验成功构建了人cyclin D3反义表达质粒。结论：cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclin D3的成功构建，为进一步研究cyclin D3的生物学功能及其在肿瘤发生、发展、诊疗和预后中的作用奠定了基础。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定

目的：构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒，在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达重组质粒，并检测趋化活性。方法：用RT-PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA，克隆至pGM-T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcDNA3．1( )．HLptn；用脂质体介导其转染BIU-87细胞，用Western-blot检测转染后细胞中HLptn的表达；取转染后的上清液，采用Boyden小室法检测表达的HLptn趋化CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞的生物学活性。结果：克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同，系同义突变，构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-HLptn；转染的BIU-87细胞表达HLptn，其培养上清对CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞具有趋化活性。结论：成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中表达。     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

人纤维介素基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人纤维介素（hfgl 2）基因的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达。方法：提取人外周血单个核细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，以其为模板，PCR扩增hfgl 2 cDNA片段，将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3．1，将重组质粒转染CHO细胞并制作细胞爬片，对爬片进行免疫组化染色，显微镜下观察并摄片。结果：扩增出1．3kb的目的片段，并将其克隆至pcDNA3．1，经酶切鉴定和测序鉴定无误；重组质粒转染CHO细胞，细胞爬片免疫组化染色可见细胞质中存在明显的阳性棕染。结论：成功构建hfgl 2基因的真核表达载体，为进一步探讨其功能学和干预研究奠定了基础。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的构建人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin，hLpm)真核表达质粒，并在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中的表达重组质粒。方法用RT—PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hLpm的含编码区序列的cDNA，克隆至pGM—T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcD—NA3．1( )-hLpm，用脂质体将其转染BIU-87细胞，经G418筛选稳定表达克隆，用免疫荧光染色技术鉴定经筛选的克隆。结果克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同．系同义突变；构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-hLptn；筛选获得了稳定表达转染hLpm的BIU-87细胞株。结论成功构建的hLpm真核表述系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中稳定表达，为研究hLpm基因介导的人膀胱肿瘤特异性主动免疫治疗奠定了基础。