4-1BBL重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建4-1BBL基因重组腺病毒载体,为前列腺癌的免疫治疗奠定基础。方法以质粒pcDNA3-m4-1BBL为模板,PCR法扩增出4-1BBL cDNA,并将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV-m4-1BBL,经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,挑选同源重组质粒,PacⅠ酶切线性化后,转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达,RT-PCR和Western blot法检测4-1BBL表达。结果目的基因经酶切分析,测序鉴定正确,RT-PCR和Western blot证实4-1BBL表达。结论成功构建了含4-1BBL基因的腺病毒载体,该载体可用于前列腺癌的免疫治疗。     

腺病毒载体在肝细胞肝癌基因治疗中的应用

腺病毒载体因其独特的优势，在肝细胞肝癌(HCC)基因治疗的研究中应用广泛。HCC基因治疗包括自杀基因、免疫基因、抑癌基因、反义基因和多基因联合治疗等。本就腺病毒载体的结构、特点、构建、在HCC的基因治疗中的应用和存在的问题及解决方法作一综述。     

人骨形成蛋白－2重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建人骨形成蛋白－2（MBP－2）基因的重组腺病毒表达载体,为应用BMP－2基因治疗的研究奠定基础,方法：首先构建携带BMP－2基因的腺病毒穿梭质粒pAdCMV-BMP-2在脂质体介导下,与腺病毒基因组质粒pJM17共转染293细胞,经同源热处理 组获得重组腺病毒Ad-BMP-2结果：经限制性酶切和PCR扩增鉴定,证实为复制缺陷型BMP－2重组腺病毒,结论：成功构建了BMP－2腺病毒表达载体。     

人肝细胞生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的:利用ADEASYTM系统,构建高效而又安全的肝细胞生长因子(HGF)基因腺病毒载体(AdHGF),以研究HGF基因在心脏内的表达。方法:从人胎肝中抽提总RNA,并以该肝细胞总RNA为模版,利用合成的1对引物,采用RTPCR技术获得HGF基因的cDNA,并引入酶切位点,先转入感受态质粒,再转化大肠杆菌进行扩增,筛选阳性菌落,经酶切及测序,证实目的HGF基因已经转入,再将该基因转入pUC18质粒,pUC18质粒与AdEASY质粒进行同源重组,用PacⅠ酶切成线性化DNA,利用脂质胺转染293细胞,经3轮扩増,制备高效表达并用绿色荧光标志AdHGF。并将该载体作实验组,与HGF组作比较,观察对VEC的抗凋亡作用。结果:在荧光显微镜发现293细胞发光率为100%,AdHGF的HGFcDNA经过测序鉴定与基因库序列一致。结论:AdHGF的成功构建,为冠心病转基因治疗的基础与临床研究奠定了基础。     

p16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞的作用

研究p16基因对肝癌细胞的作用;构建pcDNA3.0/p16真核表达质粒转导到大鼠肝癌细胞CBRH-7919中,对其p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析;转染细胞p16蛋白免疫组化阳性,MTY法结果显示,50×103/cm2细胞经培养24h～96h后,每组细胞数均有不同程度的增加,但经pcDNA3.0/p16转染的CBRH-7919细胞数比对照明显减少。与空白对照比,细胞在24h,48h,72h和96h的生长抑制率分别为29％,29％,40％和52％,流式细胞仪检测细胞周期显示经pcDNA3.0/p16转染的CBRH-7919细胞有显著的细胞凋亡现象和G0/G1期阻滞。pcD-NA3.0/p16真核表达质粒转导到大鼠肝癌细胞CBRH-7919中能够抑制细胞的增殖活性,p16基因可能通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达

目的构建钙网织蛋白(CRT)基因重组腺病毒载体,并检测其在293LP细胞中的表达。方法根据Genbank中提供的CRT基因序列,设计并合成引物,以人乳腺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人CRT基因片段,测序后将CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重组穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至PacⅠ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi。结果重组穿梭载体pShuttle-CRT经EcoRI/KpnⅠ酶切鉴定连接成功。酶切穿梭载体将CRT片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT,鉴定证实Ad-CRT载体构建成功。Ad-CRT转染293LP细胞并通过Western印迹法和Real-time PCR法证实其体外表达。结论成功构建CRT重组腺病毒载体Ad-CRT并证实其在293LP细胞中表达。     

腺病毒载体介导的ICOSIg融合基因对实验性自身免疫性心肌炎作用的研究

目的探讨腺病毒载体介导的ICOSIg基因治疗对实验性自身免疫性心肌炎（EAM）的作用。方法将人ICOS胞外域与免疫球蛋白IgGFc段融合,构建ICOSIg融合基因的腺病毒表达载体P—Adeno—ICOSIg。PoeⅠ消化腺病毒载体后转染HEK293细胞,生产表达ICOSIg融合蛋白的腺病毒;构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒作为对照。皮下注射猪心肌肌球蛋白诱导Lewis大鼠EAM模型,随机分为4组,分别于免疫当天（第0天）（A组,n=15）和第14天（B组,n=15）通过股静脉注射ICOSIg重组腺病毒,观察共刺激分子融合蛋白对T细胞激活阶段和炎症阶段的作用,C组（n=10）和D组（n=10）分别在第0天和第14天注射表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒。另设E组（n=10）未接受免疫的正常对照组。免疫第28天,超声心动图检测后处死动物。HE染色检测心肌炎症浸润程度。Westernblot检测心肌ICOS、ICOSL、B7—1及B7-2蛋白表达。实时定量RT—PCR定量心肌IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA水平。结果第28天B组大鼠心功能指标（短轴缩短率：40．6±6．2比26．2±4．6,20．8±5．6,21．7±9．6）、心肌炎症程度较对照组显著改善。Western blot显示B组ICOS、ICOSL及B7—1蛋白表达显著下调,各组间B7-2蛋白表达差异未见统计学意义。B组大鼠心肌组织IFN-γ mRNA表达降低（19．8±7．9比66．6±4．5,79．6±5．9,80．9±5．1）,IL-4 mRNA表达增加（42．3±8．6比19．7±3．8,22．3±9．0,28．3±2．2）,IL-2表达各组间无显著差异,因此B组IFN-γ／IL-4比值显著低于A、C及D组（0．47±0．36比2．91±0．22,1．89±0．42,2．32±0．83）,表明Th细胞因子平衡向Th2方向偏离。结论炎症高峰期以ICOSIg阻断共刺激分子通路能够减轻EAM心肌组织炎症,改善大鼠心脏功能。其机制可能是下调心肌组织局部ICOS、ICOSL和B7—1表达及对炎症性细胞因子的抑制作用。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的: 基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达. 方法: 应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段, 将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中, 采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列; 脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERbeta瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选, 获得比较单一的转染细胞; 分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERbeta基因不同分子水平表达. 结果: 酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta构建无误; RT-PCR和Western blot分析均表明, 与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比, 转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERbeta组细胞ERbeta基因表达水平明显提高. 结论: 成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERbeta并在Caco-2细胞株中表达, 为进一步研究ERbeta如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切质粒pVAXl Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用尸盘Pac Ⅰ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Westem blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13 kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.     

hIFN-β基因重组腺病毒载体的构建

目的构建hIFN—β基因的腺病毒载体，为探索hIFN—β在肿瘤基因治疗中的作用作准备。方法从健康人外周血中提取出基因组DNA，pyrobest Taq酶PCR法扩增出hIFN—β基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD-18T载体，经蓝白筛选和PCR筛选后测序证实序列无误。酶切目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrack—CMV中，将新形成的pAdTrack—CMV—hIFN—β用限制性内切酶Pme Ⅰ线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd—hIFN-β，内切酶pacⅠ再次将重组子线性化，脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以在转染的2—3天观察到包装病毒Ad—hIFN—β产生，7—10天出现病毒斑。结果经PCR法及酶切证实各中间过程载体，且最终的包装病毒中携带有目的基因hIFN—β。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体Ad—hIFN—β，重组子能够在HEK293细胞中扩增，病毒包装的成功为进一步研究hIFN—β基因治疗肿瘤提供了一个良好的转导载体。     

弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响

目的 构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响.方法 将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP- ROP18经PCR,测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获,扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定.以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况.转染48 h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24 h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平.结果 重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达.转染48 h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24 h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05).结论 成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡.     

KAI1复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响。方法 用Ad—EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法，构建Ad—KAI1腺病毒载体，并在293细胞中包装、扩增和纯化，用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达。结果 构建的Ad—KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANCl，并检测到感染Ad-KAI1的PANCl细胞中KAI1的高表达；同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANCl的迁移。结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移，为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据。     

KAI1 复制缺陷型腺病毒载体抑制人胰腺癌细胞迁移实验研究

目的 构建携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体并初步研究其对体外肿瘤细胞迁移的影响.方法 用Ad-EasyTM系统大肠杆菌中同源重组的方法,构建Ad-KAI1腺病毒载体,并在293细胞中包装、扩增和纯化,用其感染人胰腺癌细胞并检测KAI1的表达.结果 构建的Ad-KAI1可以高效感染人胰腺癌细胞系PANC1,并检测到感染Ad-KAI1的PANC1细胞中KAI1的高表达;同时观察到Ad-KAI1可以抑制胰腺癌细胞系PANC1的迁移.结论 携带人肿瘤转移抑制基因KAI1复制缺陷型腺病毒载体可抑制人胰腺癌细胞转移,为KAI1抗胰腺癌转移基因治疗提供依据.     

人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞（HEK293）中扩增。方法将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒。采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白（GFP）追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度。结果重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符。Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加。hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合。Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合。最终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml。结论成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体。     

结缔组织生长因子腺病毒载体的构建及其对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的构建结缔组织生长因子(CTGF)腺病毒载体并观察其对血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法将CTGF基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CTGF,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒pAd-CTGF,酶切后用转染HEK293细胞包装成重组体腺病毒Ad-CTGF,扩增和纯化后PCR鉴定。应用Ad-CTGF感染VSMCs,划痕实验观察上调CT-GF表达对VSMCs迁移的影响。结果 Ad-CTGF感染HEK293细胞后,随时间增加HEK293细胞表达绿色荧光的量也增加。PCR鉴定重组腺病毒Ad-CTGF电泳结果显示,1 047 bp附近有一条带,与目的片段相符合,CTGF碱基序列经测序正确。Ad-CTGF感染VSMCs后CTGF高表达,创口愈合指数明显提高,VSMCs迁移受到明显提升。结论成功构建了携带CTGF基因的重组腺病毒载体,上调CTGF表达可以明显增加VSMCs的迁移能力。     

小鼠FGF-21 siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含FGF-21 siRNA基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法首先用BamHⅠ+HindⅢ双酶切本课题组前期构建的质粒pSi-lencer1.0-shFGF-21,得到0.3 bp的目的片段,并将目的片段亚克隆入穿梭质粒(pShuttle-shFGF-21,),用I-CeuI和I-SceI双酶切处理pAdxsi组腺病载体及pShuttle-shFGF-21,连接,转化DH5α感受态细胞,筛选、鉴定、测序后,最后在293细胞内包装扩增为重组腺病毒。结果设计并构建了小鼠FGF-21基因特异性siRNA腺病毒载体,并经酶切和测序鉴定。空斑形成实验测得腺病毒滴度为1×1010PFU/ml。结论成功构建了小鼠FGF-21基因特异性siRNA腺病毒载体。     

大鼠重组腺病毒载体RP105的构建和鉴定

目的构建和鉴定大鼠RP105重组腺病毒载体,并获得具有一定滴度的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。方法 PCR钓取目的基因RP105,连接入穿梭载体GV135(CMV-MCS-EGFP),形成连接产物。连接好的重组腺病毒载体CMV-RP105-MCS-EGFP转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆,对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。采用AdMax腺病毒包装系统,将成功构建的RP105重组腺病毒穿梭质粒与辅助包装质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,得到重组腺病毒,并进行重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定与测序证明本实验成功构建了大鼠RP105重组腺病毒载体。RP105穿梭质粒和腺病毒包装质粒共转染HEK293细胞24h后可见大量绿色荧光蛋白表达和聚集,10d后出现典型的细胞病变,说明腺病毒包装成功。再经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定,重组腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。结论本实验成功构建了携带RP105基因的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。这为下一步研究其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制奠定了实验基础。     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

大鼠胱抑素C腺病毒高效表达载体的构建在大鼠心肌成纤维细胞中的表达

目的采用Gateway~(TM)技术构建携带胱抑素C(CysC)基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠心肌成纤维细胞中的表达。方法采用RT-PCR方法从大鼠心肌组织中扩增出CysC基因,将CysC基因经BP重组反应定向克隆至pDONR221载体,获得重组质粒pDONR221-CysC,经PCR及测序验证正确的pDONR221-CysC与腺病毒载体pAd/CMV/V_5-DEST在体外进行LR重组反应,CysC取代pAd/CMV/V_5-DEST中的ccdB-Cm~R基因,获得重组腺病毒载体pAd/CMV/V_5-DEST-CysC。采用Western blot技术检测CysC蛋白在293A细胞及大鼠心肌成纤维细胞中的表达。将培养的心肌成纤维细胞随机分为实验组、空载体组和对照组。结果 CysC腺病毒高效表达载体构建成功,测得病毒滴度为5.36×10~(10)ifu/ml,用重组CysC腺病毒转染心肌成纤维细胞24 h后,实验组的转染效率最高(≥90%);与对照组和空载体组比较,实验组CysC蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论成功构建了大鼠CysC腺病毒高效表达载体,并成功包装了含有该基因的重组腺病毒,可有效转染心肌成纤维细胞。