靶向联合阻断EGFR信号通路影响鼻咽癌细胞生长的研究

目的 本研究利用tarceva(EGFR-酪氨酸激酶拮抗剂)阻断EGFR介导的信号通路,观察其对鼻咽癌细胞株CNE-２生长的影响,并探索其机理。方法　用不同浓度的 tarceva处理鼻咽癌细胞株CNE-２,采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,流式细胞术进行细胞周期、凋亡率的分析,western bloting检测相关蛋白表达。结果　（1）tarceva呈剂量依赖性抑制CNE-2细胞生长;( 2 )处理组细胞G1期细胞比例和凋亡率明显高于对照组（P<0.05）;（3）与对照理组相比,处理组出现明显的p-EGFR表达下调。结论 tarceva通过抑制EGFR的磷酸化阻断EGFR信号通路,增加G1期阻滞,从而抑制鼻咽癌细胞生长。     

c-Met抑制剂对人鼻咽癌细胞株CNE-1的生长抑制作用

目的:探讨c-Met抑制剂PHA-665752对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用,为c-Met抑制剂在鼻咽癌中的应用提供实验依据。方法:Western blot法检测鼻咽癌细胞经HGF和(或)PHA-665752处理前后CNE-1细胞中相关信号分子的磷酸化状态变化。MTT法检测肝细胞生长因子(HGF)的促鼻咽癌细胞CNE-1的增殖作用。同时检测PHA-665752对CNE-1细胞的生长抑制作用。流式分析PHA-665752对鼻咽癌细胞CNE-1凋亡的影响。结果 :HGF可促进CNE-1细胞的增殖。而PHA-665752抑制了CNE-1细胞的增殖,并增强细胞凋亡。PHA-665752抑制c-Met磷酸化,同时降低下游信号分子Akt、Erk1/2和STAT3的磷酸化。结论:PHA-665752显著抑制鼻咽癌细胞CNE-1增殖,诱导细胞凋亡,其机制与调节下游MAPK、PI3K和STAT通路有关。     

EGCG 对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及survivin、VEGF表达的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及生存素(survivin)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:体外培养鼻咽癌细胞,以不同质量浓度EGCG处理,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,Hoechst33258染色观察凋亡细胞并计算细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞周期变化,RT-PCR检测survivin和VEGF的表达变化.结果:EGCG处理后,CNE-2细胞增殖明显受到抑制,呈时间和剂量依赖性;CNE-2细胞凋亡率显著升高;CNE-2细胞周期阻滞于G1/G0,表现为浓度依赖性;survivin和VEGF的表达明显下调,随EGCG浓度的增加有下降趋势.结论:EGCG能抑制鼻咽癌细胞增殖、促进其凋亡;机制可能与EGCG下调survivn和VEGF的表达有关.     

鼻咽癌细胞放射敏感性与Bcl-2及Bak表达的关系

目的:探讨鼻咽癌细胞株放射敏感性与Bcl-2及Bak蛋白表达的关系。方法:利用免疫荧光技术及流式细胞仪检测Bcl-2及Bak蛋白在两株鼻咽癌细胞株中的表达,并检测照射后Bcl-2、Bak的阳性表达率以及细胞凋亡率。结果:免疫荧光显示两株鼻咽癌细胞中均存在Bcl-2及Bak蛋白的表达,并主要定位于细胞浆中;照射前两株鼻咽癌细胞Bcl-2的表达率分别为CNE-1(87.6±1.2)%,CNE-2(87.7±0.8)%,Bak的表达率分别为CNE-1(11.5±0.8)%,CNE-2(13.5±0.9)%;照射后两株鼻咽癌细胞的凋亡率及Bak的表达随时间变化呈上升趋势,二者呈正相关,而Bcl-2的表达变化与细胞凋亡率的变化无明显相关。结论:在鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2中,细胞的内在放射敏感性与Bak的表达相关,而与Bcl-2的表达无明显相关。     

卡介苗对人鼻咽癌CNE-2Z细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨卡介苗(BCG)对鼻咽癌CNE-2Z细胞周期及凋亡的影响.方法 碘化丙啶染色法检测细胞周期,Annexin V-FITC检测细胞凋亡,Western blotting检测周期相关蛋白表达.结果 BCG作用不同时间后,G1期细胞百分率由未处理细胞(对照组)的(47.1±0.9)%升高至72 h作用组的(65.3±1.3)%,S期细胞百分率由对照组的(39.2±0.7)%降低至72 h作用组的(17.6±0.5)%.不同处理时间组和对照组均未检出明显细胞凋亡.CyclinD1蛋白表达随着BCG作用时间的延长逐渐减弱.结论 BCG体外诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞CyclinD1低表达,促使细胞周期发生G1/S期阻滞.     

西妥昔单抗体外增强人鼻咽癌细胞对紫杉醇化疗敏感性的实验研究

目的 观察西妥昔单抗(C225)体外增强人鼻咽癌CNE-1细胞对紫杉醇(PTX)化疗敏感性作用,并探讨可能的作用机制。方法 将人鼻咽癌CNE-1细胞株随机分为对照组、PTX组、联合用药组,PTX组采用30μg/ml PTX处理,联合用药组采用30μg/ml PTX+250μg/ml C225处理,对照组加入等体积的二甲基亚砜(DMSO)。MTT法检测细胞的PTX耐药性,取对数期的CNE-1细胞分为9组,4组分别加入浓度为0. 01μmol/L、0. 1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L的PTX;另有4组也加入PTX,同时加入C225,使C225最终浓度为250μg/ml,空白对照组中加入等体积的DMSO,培养48 h。MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布,Western blotting、RT-PCR分别检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、BCL2-相关X蛋白(Bax)蛋白水平及其基因相对表达量。结果 PTX组CNE-1细胞抑制率为(15.99±2. 13)%,联合用药组CNE-1细胞抑制率为37. 10%(37. 10±2. 48)%,差异有统计学意义(t=11.184,P=0.000)。与对照组相比,PTX组、联合用药组的细胞凋亡率、G0～G1期细胞比率均升高(P 0. 05),而S期细胞比率降低(P 0. 05)。与PTX相比,联合用药组的细胞凋亡率、G0～G1期细胞比率升高(P0. 05),S期细胞比率与M期细胞比率均明显降低(P 0. 05)。MTT检测PTX耐药性结果显示,空白对照组、C225组细胞的细胞活性随着PTX浓度增加而降低,空白对照组、C225组CNE-1细胞的PTX IC50分别为4. 179μmol/L、0. 25μmol/L。与对照组相比,PTX组、联合用药组Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平与基因相对表达量均明显降低(P 0. 05),而Bax蛋白水平与基因相对表达量均明显升高(P 0. 05)。与PTX相比,联合用药组Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平与基因相对表达量均明显降低(P 0. 05),而Bax蛋白水平与基因相对表达量均明显升高(P 0. 05)。结论 在PTX化疗的基础上增加C225处理,可以促进PTX对人鼻咽癌CNE-1细胞的增殖抑制作用以及促凋亡作用,降低细胞的CNE-1细胞的PTX IC50,增强CNE-1细胞对PTX敏感性。     

白藜芦醇对鼻咽癌细胞生长凋亡的影响及相关作用机制

目的 探讨白藜芦醇(RES)对鼻咽癌(NPC)细胞生长凋亡的影响及相关作用机制。方法 选取NPC细胞的CNE-1株与CNE-2Z株,采用CCK8比色法检测CNE-1与CNE-2Z细胞的半数抑制RES浓度(IC50),评估RES对NPC细胞活力的影响;采用ATP酶试剂盒超微量检测CNE-1与CNE-2Z细胞中总ATP酶(T-ATP)、钠钾ATP酶(Na+-K+-ATP)的变化情况,评估RES对NPC细胞ATP酶活力的影响;以免疫印迹(WB)检测CNE-1与CNE-2Z细胞中ATP蛋白与细胞核增殖抗原(PCNA)的表达情况,评估RES对调节NPC细胞生长凋亡相关基因与蛋白的影响;采用流式细胞技术检测NPC细胞的细胞周期分布与凋亡率。结果 RES对CNE-1与CNE-2Z细胞的活力表现出一定的剂量依赖性与时间依赖性,且随着RES浓度的增加,对CNE-1与CNE-2Z细胞活力抑制效果越显著(P0. 05);随着RES的浓度提高,CNE-1与CNE-2Z细胞的Na+-K+-ATP与T-ATP具有显著差异(F=45. 354,P0. 01,F=33. 209,P 0. 01; F=38. 586,P 0. 01,F=73. 706,P 0. 01);随着RES的浓度提高,对CNE-1与CNE-2Z细胞ATP酶的活力抑制越显著(P 0. 05);随着RES浓度的增加,NPC细胞的G1细胞与S细胞周期比率减少,NPC细胞增殖停滞于S期;随着RES浓度的增加,CNE-1与CNE-2Z的细胞凋亡率逐渐增加(P 0. 05),ATP与PCNA的蛋白表达量逐渐下降(P 0. 05)。结论 RES能抑制不同分化程度的NPC细胞的活性,降低细胞中ATP酶的活力,将NPC细胞阻滞与S期,下调ATP与PCNA蛋白的表达,可能是抑制NPC细胞生长增殖、诱导NPC细胞凋亡的机制之一。     

枸杞皂苷通过调控Suv39H1/JAK2/STAT3通路对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的　探究枸杞皂苷介导Suv39H1/JAK2/STAT3通路对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法　将人鼻咽癌CNE-2细胞株分为枸杞皂苷干预组（5,10,50 μmol/L枸杞皂苷）及对照组,采用CCK-8检测不同浓度枸杞皂苷作用0,24,48和72 h时CNE-2细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测枸杞皂苷干预48 h后CNE-2细胞凋亡率,Transwell小室实验检测CNE-2细胞侵袭能力,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）与蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测组蛋白甲基化酶Suv39H1的表达水平;采用qRT-PCR和Western blot分别检测Suv39H1在鼻咽癌组织和癌旁组织,以及鼻咽癌细胞系（HONE1,C666-1,CNE-1和CNE-2）和人鼻咽癌上皮细胞（NP69）中的表达差异;构建Suv39H1过表达载体（pcDNA-Suv39H1）以及针对Suv39H1的小干扰RNA（Suv39H1 siRNA）,分别转染于CNE-2细胞,检测细胞增殖、侵袭和凋亡;将pcDNA-Suv39H1载体转染于50 μmol/L枸杞皂苷干预的细胞中,分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡。Western blot检测JAK2/STAT3通路相关蛋白p-JAK2和p-STAT3的表达。结果　与对照组相比,枸杞皂苷干预鼻咽癌CNE-2细胞呈剂量依赖性降低细胞增殖（F=12.030,P=0.002 5）和侵袭（F=4.807,P=0.031 5）,增加细胞凋亡率（F=5.232,P=0.026 1）,抑制Suv39H1蛋白表达（F=14.64,P=0.001 3）;与正常组织和NP69细胞相比,鼻咽癌组织和HONE1,C666-1,CNE-1,CNE-2细胞中Suv39H1表达水平显著升高（P<0.01）;转染pcDNA-Suv39H1组细胞增殖、侵袭率增强、凋亡率降低;转染Suv39H1 siRNA组细胞增殖、侵袭率降低,凋亡率升高,差异与对照组相比具有统计学意义（P<0.01） ;与50 μmol/L枸杞皂苷干预组相比,转染pcDNA-Suv39H1组细胞增殖、侵袭率增加、凋亡率降低,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达升高（P<0.01）。结论　枸杞皂苷通过下调Suv39H1/JAK2/STAT3通路抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖、侵袭,促进凋亡。     

人参皂苷Rg1对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡、侵袭和迁移的影响

目的探究人参皂苷Rg1对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡、侵袭和迁移的影响。方法采用不同浓度的人参皂苷Rg1处理鼻咽癌CNE-2细胞,同时选择无显著细胞毒性的Rg1低浓度、中浓度、高浓度(观察组)进行后续实验,对照组不做Rg1处理。采用CCK-8检测细胞增殖倍数,使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,免疫印迹法检测相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,观察组人参皂苷Rg1浓度越高,CNE-2细胞数量越少,增殖倍数、侵袭能力及Ki-67、血管内皮生长因子的表达水平越低,Q2区凋亡细胞越多,Caspase-3蛋白表达水平越高,差异有统计学意义(P 0. 01)。划线24 h后,观察组的缝隙间距明显大于对照组,差异有统计学意义(P 0. 01)。结论人参皂苷Rg1可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡,抑制CNE-2细胞增殖、迁移和侵袭能力,为临床治疗鼻咽癌提供新思路和理论基础。     

槲皮素调控EGFR/AKT/mTOR信号通路影响人乳腺癌细胞株T47D增殖、凋亡的实验研究

目的对槲皮素调控表皮生长因子/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(EGFR/AKT/m TOR)信号通路影响人乳腺癌细胞株T47D增殖、凋亡进行分析。方法人乳腺癌细胞株T47D随机分为三组:对照组、雷帕霉素组和槲皮素组。对照组T47D细胞给予溶剂DMSO孵育,雷帕霉素组T47D细胞给予雷帕霉素(10μM)孵育,槲皮素组T47D细胞给予槲皮素(20μM)孵育。分析各组T47D细胞的凋亡蛋白及EGFR/AKT/m TOR信号通路蛋白的表达。结果与对照组相比,槲皮素组和雷帕霉素组细胞增殖受到明显地抑制(P0.05);槲皮素组和雷帕霉素组T47D细胞的促进凋亡分子Bax、Caspase3和Caspase9蛋白及mRNA水平明显高于对照组而抑制凋亡分子Bcl2蛋白及mRNA水平明显低于对照组(P0.05);槲皮素组和雷帕霉素组T47D细胞EGFR、AKT及m TOR蛋白及荧光强度均明显低于对照组(P0.05)。结论槲皮素能够通过抑制EGFR/AKT/m TOR信号通路促进人乳腺癌细胞株T47D的细胞凋亡过程。     

Exogenous growth hormone inhibits growth hormone-releasing factor-induced growth hormone secretion in normal men.

Previous studies from this laboratory and by others in rats, monkeys, and humans support the concept that growth hormone (GH) can regulate its own secretion through an autofeedback mechanism. With the availability of human growth hormone-releasing factor (GRF), the possible existence of such a mechanism was reexplored by examining the effect of exogenous GH on the GH response induced by GRF-44-NH2 in six normal men (mean age, 32.4 yr). In all subjects the plasma GH response evoked by GRF-44-NH2 (1 microgram/kg i.v. bolus) was studied before and after 5 d of placebo (1 ml normal saline i.m. every 12 h), and then before and 12 h after 5 d of biosynthetic methionyl human GH (5 U i.m. every 12 h). The GH response to GRF (maximal increment over time 0 value) was significantly inhibited after GH treatment (0-1.3 vs. 2.3-11.2 ng/ml before treatment, P = 0.05), but was not significantly affected by placebo. This impaired pituitary response to GRF persisted for at least 24 h following exogenous GH treatment in two subjects who underwent further study. Serum somatomedin-C concentrations were significantly increased after 5 d of GH treatment (2.66-5.00 vs. 0.92-1.91 U/ml before treatment, P = less than 0.01). The impaired pituitary response to GRF may be mediated indirectly through somatomedin, somatostatin, by a direct effect of GH on the pituitary somatotropes, or by all of these mechanisms. These data suggest that after GH treatment, the blunted GH response to synthetic GRF is not solely a consequence of the inhibition of hypothalamic GRF secretion.