小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

人分泌型白细胞介素-16基因的克隆及其原核表达

目的:克隆人分泌型IL-6 cDNA,构建IL-16的原核表达质粒,并观察其在大肠杆菌中的表达.方法:采用PCR技术从健康成人外周血单个核细胞(PBMC)总cDNA文库中扩增人分泌型IL-16 DNA片段;PCR产物分离纯化后,将其克隆至pUC18-T载体中,经PCR、酶切鉴定及DNA测序确证后,将该基因定向插入原核表达载体pMAL-C2,获得重组质粒pMAL-IL-16,然后将其转化至E.coli DH5α,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE及Western blot法鉴定表达产物.结果:获得了编码人分泌型IL-16的cDNA,经测序证明其长度为393 bp,编码130个氨基酸;构建了IL-16原核表达载体,并应用E.coli DH5α表达,得到1个相对分子质量(Mr)约56000的IL-16重组融合蛋白,与理论大小相符,且经SDS-PAGE及Western blot法验证.表明人分泌型IL-16原核表达载体构建并表达成功.结论:本实验成功克隆了人分泌型IL-16 cDNA,构建了IL-16原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为IL-16的纯化奠定了基础.     

人白细胞介素32基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素32(hIL-32)基因,构建高效稳定的hIL-32大肠杆菌表达菌株,并对纯化的目的蛋白进行生物学活性的初步测定.方法:将人外周血单个核细胞( PBMC)经刀豆素A( Con A)刺激60 h后提取细胞的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)从刺激的PBMC中扩增出hIL-32的基因,通过基因克隆技术,构建hIL-32在pET-30 a(+)中的重组质粒pET30a-hIL32,用IPTG进行诱导,得到hIL-32的原核表达蛋白;采用Ni2+ -NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导人PBMC产生IL-6的情况.结果:序列测定表明,hIL-32基因核苷酸长度为567 bp,编码189个氨基酸.重组质粒pET30 -hIL32转化至大肠杆菌BL21( DE3),重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量(Mr)为28 000的重组蛋白,表达的重组蛋白IL-32可促进人PBMC产生IL-6,浓度达到(127±4.8)ng/L,而对照组IL-6的浓度仅为(25±2.3)ng/L.结论:成功克隆了hIL-32基因并构建了高效且稳定表达hIL-32基因的大肠杆菌菌株,且表达的目的蛋白能诱导IL-6细胞因子的产生.     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

突变型人白细胞介素18 cDNA的克隆

目的:获得人白细胞介素18 cDNA。方法:从1名健康献血者的外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过PT-PCR扩增出人白介素18(hIL-18)的cDNA,与PUCmT载体连接,构成重组质粒,进行测序及同源性分析。结果:已获得hIL-18的编码序列,且与Ushio等报道的序列相比存在3处有意义突变。结论:克隆了突变型hIL-18 cDNA。     

大鼠白介素10真核表达质粒在大鼠体内外肝细胞中的表达及影响

目的 探讨体外重组的大鼠白介素10(rIL-10)真核表达质粒能否在大鼠体内外肝细胞中表达及表达产物对肝细胞的影响.方法 通过受体介导的脂介体转染法及尾静脉大容量注射法将rIL-10真核表达质粒分别转入大鼠BRL细胞及体内大鼠肝细胞中,采用RT-PCR法、ELISA法和免疫组织化学法检测体内外肝细胞rIL-10的表达情况,MTT法及流式细胞术检测rIL-10真核表达质粒转染对BRL细胞增殖与凋亡的影响.结果 转染rIL-10真核表达质粒的BRL细胞及大鼠肝组织高表达rIL-10基因,BRL细胞培养上清与大鼠血清中rIL-10浓度分别为(12.78±0.94)ng/ml,(61.68±3.60)ng/ml.MTT法及流式细胞术显示rIL-10的表达对肝细胞有一定的保护作用.结论 rIL-10真核表达质粒可在大鼠体内外肝细胞中表达并对肝细胞有一定的保护作用.     

小鼠IL-12单链融合基因真核表达质粒构建及其肿瘤基因治疗初探

目的　构建小鼠IL 12单链融合基因 (msIL 12 ) ,进行基因治疗初探。方法　用RT PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞总RNA分别获取p4 0cDNA和p35cDNA ,2次PCR引入linker后 ,依次克隆入pcDNA3质粒 ,构建成msIL 12真核表达质粒 (pmsIL 12 ) ;用DEAE dextran法将PEG纯化的pmsIL 12转染COS 7细胞 ,用ELISA法检测其培养上清 (转染上清 )IL 12蛋白含量。皮内注射PEG纯化的pmsIL 12 ,用MTT法检测其对正常小鼠脾细胞NK活性的影响 ,观察其对荷H2 2腹水型肝癌细胞瘤小鼠生存期的影响。结果　所得p35cDNA序列与GenBank登录号M86 6 72完全一致 ;所得IL 12p4 0cDNA序列与GenBank登录号AH0 0 4 85 9报道完全相同 ,除第 10 0 0位碱基是G而不是A(但所编码氨基酸相同 ,都是丝氨酸 )外也与GenBank登录号M86 6 71报道相同。成功构建了小鼠IL 12单链融合基因真核表达质粒pmsIL 12 ,其转染COS 7细胞后的转染上清IL 12蛋白含量达 (2 .5 5± 0 .6 0 )ng ml。皮内注射pmsIL 12后 ,使正常小鼠脾细胞NK活性显著增强 (P <0 .0 1) ,使荷H2 2肝癌细胞瘤小鼠的生存期明显延长(P <0 .0 5 )。结论　构建了小鼠IL 12单链融合基因的真核表达质粒 ,可用于基因治疗研究。     

人白细胞介素33基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素33(human interleukin-33,hIL-33)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株,并对纯化的蛋白进行生物活性的初步测定.方法:采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术从人成纤维细胞总RNA中反转录并扩增得到人的成熟肽IL-33基因;采用基因克隆技术,构建PQE30-IL33重组质粒;采用Ni2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导产生的IL-4和IL-5.结果:SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的25%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,纯化后纯度达到95%以上.表达的重组蛋白IL-33促进人外周血单个核细胞产生IL-4和IL-5,浓度分别达到(106±2.6)pg/ml和(1 220±10.4)pg/ml,而未刺激对照组的浓度只有(32.2±2.3)pg/ml和(67.3±2.5)pg/ml.结论:成功构建出hIL-33的原核表达载体,诱导产生蛋白能诱导IL-4和IL-5细胞因子的产生.     

人白细胞介素13cDNA的克隆及序列测定

用反转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从中国人外周血淋巴细胞中克隆了ＩＬ－１３ｃＤＮＡ，序列测定表明克隆的ＩＬ－１３ｃＤＮＡ含成熟的ＩＬ－１３蛋白全部编码，且存在编码第９８位Ｇｌｎ的密码子ＣＡＧ，这为进一步表达ＩＬ－１３并深入探究功能奠定了基础。     

高活性的人白细胞介素-3突变体的构建与表达

目的:在大肠杆菌中构建表达高活性的人白细胞介素-3(hIL-3)突变体。方法:通过定点突变的方法构建hIL-3突变体K116V和K116W的表达载体,并实现hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达。对所得包涵体蛋白依次溶解、纯化、透析复性。用Westernblot检测hIL-3突变体的特异性。单溶液细胞增殖(MTS)测定hIL-3突变体的生物学活性。结果:hIL-3在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上,主要以包涵体的形式存在。将包涵体溶解在8mol/L脲中,经Ni-NTA-Sepharose柱纯化后纯度达90%以上。MTS法测定hIL-3突变体K116V的活性为野生型的5倍,K116W的生物学活性也有所增加。结论:获得了高活性的hIL-3突变体K116V,有望成为hIL-3的替代品,也证明了hIL-3第116位的赖氨酸残基对于hIL-3的生物学活性很重要。     

人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上，具有显著的促鼠Ｔ淋巴母细胞增殖作用     

人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达

目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆;重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-2l全长cDNA及其在大肠杆菌中表达，并进一步检测其表达产物的功能。方法：抽取外周血，分离淋巴细胞；抗CD3抗体刺激后，提取总RNA，通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242bp，3′端425bp)，重组PCR扩增出IL-21全长cDNA：DNA测序正确后，将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a( )中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定，挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达：SDS—PAGE、Western blotting鉴定，亲和层析分离纯化得到M，为18600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白。透析法重折叠复性，MTT法测定其对T细胞增殖活性。结果：成功获得人IL-21全长cDNA，并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究

目的 克隆小鼠白细胞介素－１８（ＩＬ－１８）编码区的ｃＤＮＡ,并实现在真核细胞中的表达。方法 用小鼠白细胞介素 －１８（ｍＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ核苷酸序列,设计、合成基因序列特异性引物,应用逆转录多聚酶链反应ＲＴ－ＰＣＲ,以植物血凝（ＰＨＡ）和细胞脂多糖（ＬＰＳ）刺激的小鼠非粘附性脾细胞的ｍＲＮＡ为模板,扩增获得全长ｍＩＬ－１８,转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２,并进行ＩＬ－１８生物学活性的检测。结果     

人白细胞介素18 cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

白细胞介素１８（ＩＬ－１８）是１９９５年克隆的一种新型细胞因子，又称ＩＦＮ－γ诱导因子，主要由活化的巨噬细胞产生，其相对分子质量（Ｍｒ）为１８　３００［１、２］。ＩＬ－１８可诱导ＴＨ１细胞产生ＩＦＮ－γ和ＧＭ－ＣＳＦ等细胞因子，增强ＮＫ细胞和ＣＴＬ的活性［１、２］，促进ＩＬ－２介导的Ｔ细胞增殖；增强ＴＨ１等细胞产生ＴＨ１类细胞因子［３、４］；促进免疫细胞表达ＦａｓＬ，增强Ｆａｓ介导的细胞毒作用等多种生物学功能［５］，在抗病原微生物感染﹑抗肿瘤及抗超敏反应等方面具有潜在的应用前景。因此，我们采用Ｒ…     

人白细胞介素ⅡcDNA表达载体的构建

为开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）质粒基因肿瘤疫苗的研究,将经改造的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ与真核细胞表达ｐｃＤＮＡ３重组保到表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２,该质粒转化大肠杆菌后,小量抽提获得的质凿经酶切分析显示长的６８０ｂｐ的目的ＤＮＡ（ＩＬ－２）已插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,说明成功构人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于?-淀粉样多肽的异常。  目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。 结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 ,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性     

人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究

目的：为了在大肠杆菌中高效表达ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ,获得ｈＩＬ－３蛋白,拟对天然型ｈＩＬ－３进行构建以获得新的突变体,同时进行了活性测定,以便深入了解ｈＩＬ－３的结构与功能之间的关系。方法：利用ＰＣＲ技术对天然型ｈＩＬ－３ Ｎ末端第３位蛋氨酸（Ｍｅｔ３）和Ｃ末端第１７位蛋氨酸（Ｌｙｓ１１６）进行定点突变,获得突变体ＭｈＩＬ－３和ＭＶｈＩＬ－３。结果：经Ｓｕｇｅｒ双脱氧法测序证实突变体ＭｈＩＬ－３ｃＤ