KRAS基因突变高分辨率熔解曲线检测技术参数的优化

目的建立KRAS基因突变高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting,HRM)检测方法,确立最佳反应体系和反应条件,为将此技术用于临床基因突变的快速检测奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响实时荧光定量PCR(qPCR)-HRM反应体系的模板DNA、Mg2+、引物等3种主要因素进行优化。通过对SW480和MDA-MB-231细胞基因组DNA进行HRM分析检测突变,并直接测序验证,观察反应体系和反应条件的可行性。结果引物最适退火温度为60.8℃。KRAS基因突变qPCR-HRM最佳反应体系为:20μl qPCR-HRM反应体系中,引物浓度为0.5μmol/L,Mg2+为2.5mmol/L,模板DNA为40ng。优化的qPCR-HRM反应体系和反应条件能检测基因突变,和直接测序结果一致。结论采用正交实验优化的qPCR-HRM反应体系,操作简便,电泳条带清晰,熔解曲线峰型单一,特异性好,结果准确可靠,可为进一步建立HRM技术检测基因突变的临床应用提供借鉴。     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

假丝酵母SSR-PCR反应体系的优化

目的建立假丝酵母SSR-PCR反应体系,确立最佳反应条件,为将该技术用于临床假丝酵母感染的快速鉴定奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响SSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物等4种主要因素,进行优化。结果引物最适退火温度为51℃。假丝酵母最佳的SSR-PCR反应体系为：在25μl的PCR反应体系中加入Taq DNA聚合酶1.0 U、模板DNA为25 ng、dNTP为0.15 mmol.L-1、引物为0.5μmol.L-1。结论采用正交实验优化的SSR-PCR反应体系,操作简便,电泳条带清晰,多态性好,重复性强,可为进一步建立临床假丝酵母感染的快速鉴定提供借鉴。     

HLA—Cw基因测序分型的研究

目的建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究。方法对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABIPrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型。检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证。结果检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致。结论本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景。     

HLA-Cw基因测序分型的研究

目的 建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究.方法 对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABI PrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型.检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证.结果 检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致.结论 本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景.     

应用实时荧光PCR分析apoE3、4等位基因

目的 建立实时荧光PCR进行apoE单核苷酸多态性(SNP)分析法,快速检测人栽脂蛋白E(apoE)等位基因.方法 以人apoE基因中的Cys112Arg为研究对象,用荧光染料SYBR Green Ⅰ标记PCR产物,通过熔解曲线分析结果,并进行SNP分型.用高保真DNA聚合酶提高SNP测定的特异性;通过DNA测序验证荧光定量PCR对apoE基因Cys112Arg分型结果的准确性.结果 每个样品设立2个检测管,利用下游引物P2和SNP检测引物P33、P44进行定量PCR反应,30份样品各自获得2种等位基因扩增产物的熔解曲线,通过熔解曲线的Tm值判读,在30份样本中,apoE基因型3/3、3/4分别有27例和3例,与PCR-RFLP及DNA测序结果一致.结论 建立的apoE等位基因分型法操作简便,结果准确,适合人外周血apoE等位基因的定性检测.     

提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略

目的：提高乙型肝炎病毒（HBV）DNA P基因区聚合酶链反应（PCR）检测的阳性率。方法：采用优化PCR反应条件，降低退火温度以及采用3'末端碱基游移兼并引物，减少引物与模板引物结合区的错配对PCR的影响等多种方法，对常规PCR检测HBV DNA P基因区阴性的病人血清，再进行PCR检测。结果：通过降低退火温度及减少3'末端错配，PCR检测阳性率由81．7％（67／82）增加至92．7％（76／82，P＜0．05）。结论：综合采用优化PCR反应条件，降低退火温度和采用3'末端碱基游移兼并引物等方法，可提高基因高突变区PCR检测阳性率。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台的构建及初步应用

目的 构建子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为临床分析PTEN基因968delA突变与子宫内膜癌的相关性提供技术支持。方法 设计PTEN基因968delA位点的特异性硫化修饰引物,以本实验室前期构建的包含PTEN基因968delA位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,采用正交设计进行PCR条件优化,再将其优化后采用突变敏感性分子开关技术检测从南华大学附属第一医院收集的62例临床患者子宫内膜组织样本PTEN基因968delA位点突变。结果 突变敏感性分子开关技术检测PTEN基因968delA位点最佳PCR反应条件为：30个循环、模板DNA(10 ng/μL)0.3μL、引物(10μmol/L)0.5μL、退火温度61℃,灵敏度达10^-3 ng/μL。62例子宫内膜癌组织与21例正常子宫内膜组织标本均未发现PTEN基因968delA突变。结论 成功构建了子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为该技术在PTEN基因968delA的突变筛查中的应用提供了依据。     

运用HRM技术分析7个SNP位点与2型糖尿病相关性

目的采用高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)方法检测7个2型糖尿病(T2DM)患者相关易感单核苷酸多态性,并分析该多态性与2型糖尿病的相关性。方法选取202名T2DM患者和200名健康志愿者,提取外周血DNA,采用HRM技术分析其多态性,并用测序法证实。结果成功地检测T2DM患者相关易感单核苷酸多态性。HRM技术检测能准确区分各种基因型,其结果与测序法一致;研究还显示rs10811661和rs10923931位点在本研究人群中与T2DM无相关,此外rs7961581位点OR值<1,提示其在中国汉族人群,对于T2DM可能起保护作用;本研究中的rs8050136,rs10811661,rs7578597,rs864745均OR值>1,可能是疾病风险因素。结论成功地建立了采用HRM的简单、快速和精确地分析T2DM患者相关易感单核苷酸多态性的方法;推测这些易感单核苷酸多态性可能与2型糖尿病发病相关。     

基于高分辨熔解技术进行单核苷酸多态性基因分型的方法学评价

目的评价高分辨熔解（HRM）技术进行单核苷酸多态性（SNP）基因分型的检验性能。方法以SNP位点rs1205C〉T和rs4353A〉G为例,采用盲法对361例已分型确认样本进行PCR-HRM检测评价其特异性和灵敏度;通过重复试验评价其重复性和再现性。稳健性评价主要考察DNA模板量和扩增循环数对PCR-HRM检测的影响。结果 PCR-HRM法检测361例标本的rs1205C〉T和rs4353A〉G两个SNP位点,结果除5例样本的熔解曲线发生飘移接受复查外,其余标本均一次直接基因分型;所有标本的最终分型结果完全正确即灵敏度和特异性达到100%。两个位点的10次批内和3次批间重复试验均显示PCR-HRM法的重复性和再现性良好。rs1205C〉T和rs4353A〉G的野生型与纯合突变型样本熔解峰Tm值的变异系数分别为0.7%与0.8%和0.6%与0.5%;统计学分析显示每个位点的两种纯合型样本Tm值之间均存在显著性差异（P〈0.001）,即可明确区分不同纯合基因型。DNA模板量的变化（10ng、20ng、50ng和100ng）和扩增循环数的波动（38、40和42次）均对PCR-HRM法正确基因分型影响不大。结论基于小片段扩增子对rs1205C〉T和rs4353A〉G两个SNP位点进行常规化PCR-HRM法基因分型在方法学上是可靠的,值得推广;同时这一评估模式也适于其他分子诊断方法的评价。     

高分辨熔解曲线法检测骨髓增殖性肿瘤患者 JAK2V617F 基因突变简

本研究探讨高分辨率熔解曲线（High resolution melting,HRM）法检测骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者JAK2V617F基因突变的可行性.随机抽取29份2008年1月至2011年1月确诊为MPN患者的骨髓标本,应用HRM法检测JAK2V617F基因突变情况,并与等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）和测序法的检测结果比较分析.结果表明,经HRM法检测,在29份MPN患者骨髓标本中检出JAK2 V617F突变阳性11例,突变率为37.9％;与基因测序法比较,结果完全一致,符合率100％.而AS-PCR法与测序法比较,Kappa=0.179,P=0.316,一致性强度较差.结论：HRM方法具有简便、快速、特异性高等优点,可作为临床JAK2V617F基因突变的优选方法.     

胶质瘤表皮生长因子受体基因突变检测方法的对比研究

目的分析普通聚合酶链式反应(PCR)联合直接测序法与实时聚合酶链式反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术对胶质瘤表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测效果。方法用普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用χ2检验。结果普通PCR联合直接测序法与qPCR-HRM曲线分析技术对胶质瘤患者肿瘤组织EGFR突变的检测结果一致性较高,达90.91%,两者间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 qPCR-HRM曲线分析技术操作较普通PCR联合直接测序法简便,实验时间较短,降低了交叉污染的风险,通过HRM曲线分析检测结果可以实现对样品基因型的判定。     

病原真菌DNA提取方法及简单重复序列聚合酶链反应体系的优化

背景:真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位.DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果.目的:建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的最佳组合.设计、时间及地点:DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06,2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行.材料:将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28℃培养3-7 d后,选取可疑菌落进行分离、纯化.方法:比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、GeneTLE~(TM)抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4个因素,在3个水平上根据L9(3~4)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数.主要观察指标:根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定最佳反应体系.结果:Gene TLE~(TM)抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法.SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据尺值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>Taq DNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为:模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP150 μmol/L,引物0.5 μmol/L.但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.结论:Gene TLE~(TM)提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单.根据正交试验的优化结果,SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 150 μmol/L,引物0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳.     

荧光杂交探针实时聚合酶链式反应快速检测甘露聚糖结合凝集素启动子区基因变异方法的建立

目的建立用荧光杂交探针实时聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测人甘露聚糖结合凝集素（MBL）启动子区基因变异新型的基因分型法——Tm基因分型法。方法收集30例健康献血员外周抗凝全血,提取基因组DNA。通过LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度（Tm）峰值判定待测标本的基因变异类型。最后,用基因测序法检测PCR产物来验证Tm基因分型法的准确性。结果建立了新型的Tm基因分型法,且测定PCR产物的时间仅180min,检测结果与测序法完全吻合。结论Tm基因分型法检测人MBL启动子区基因变异快速、准确,重复性好,具有广泛的临床应用前景。     

高分辨率熔解曲线在ABO血型基因526位点单核苷酸多态性检测中的应用

目的建立高分辨率熔解(HRM)曲线检测ABO血型基因526位点单核苷酸多态性(SNP)的方法。方法随机提取35例待检血型标本的DNA,运用HRM曲线检测ABO血型基因526位点的SNP,通过PCR-DNA测序以及血型血清学试验验证HRM检测结果的准确性。结果 35例血型标本中,共检出526位点杂合子13例,纯合子22例。经测序分析和血清学试验验证13例G/C杂合中B型8例、AB型5例,22例CC纯合子中A型10例,O型12例。HRM法检测结果与测序结果及血清学结果相符。结论 HRM法是一种低成本、简便、准确的SNP检测技术,有望成为临床ABO血型基因分型的新方法。     

一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用

目的：探讨一管式多引物焦磷酸测序技术在人类乳头瘤病毒（HPV ）分型检测中的临床应用价值。方法设计针对7个不同 HPV亚型的高度特异性测序引物,采用一管式多引物测序法,通过半巢式聚合酶链反应（PCR）扩增获得 HPV基因片段,并进行焦磷酸测序分析。结果通过半巢式PCR扩增和一管式多引物焦磷酸测序,成功区分了7种不同的 HPV亚型,且测序结果与PCR-反向点杂交法检测结果的符合率是100％。结论一管式多引物焦磷酸测序技术是一种简便、高效、高通量、高灵敏度、高准确度的HPV分型检测方法,值得推广应用。     

应用MALDI-TOF质谱技术检测多发性骨髓瘤Jak2基因单核苷酸多态性

本研究探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI—TOFMS）检测多发性骨髓瘤（MM）jak2基因的单核苷酸多态性（SNP）的实用性。用PCR扩增出含jak2基因2个SNP（C428T和C643T）位点的DNA片段作为模板,产物纯化后利用MALDI,TOFMS检测5例MM和5例健康对照者样本的jak2基因多态性。结果表明：C428T和C643T位点基因型在多发性骨髓瘤病例与健康对照组的分布无差异,均为T／T纯合子。结论：本实验建立的基于MALDI—TOFMS与引物延伸技术检测jak2基因多态性的方法是一个快速、准确和可靠的检测方法。