特定沉默胶质瘤U251细胞株的PDGF-B基因对细胞凋亡和增殖的影响研究

目的利用RNA干扰基因治疗技术,特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板衍生生长因子B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法用血清培养液(含10%胎牛血清DMEM培养基)体外培养人U251脑胶质瘤细胞系。随机分为3组,第1组为实验组:转染siRNA的细胞,第2组为阴性对照组:转染空白质粒的细胞;第3组为空白对照组:细胞常规培养不予以干预。利用脂质体将siRNA转染进入U251细胞,在细胞内形成双链siRNA,识别并降解PDGF-B mRNA。通过RT-PCR检测U251细胞中PDGF-B基因mRNA的表达水平,Western blot检测PDGF-B的蛋白表达,MTT法检测U251细胞的增殖情况,流式细胞学对比检测3组细胞的凋亡情况。结果利用脂质体将靶向PDGF-B基因siRNA转染进入U251细胞,48 h后利用RT-PCR检测PDGF-B基因mRNA的表达,结果显示与阴性对照组和空白对照组对比,转染组PDGF-B基因mRNA表达水平明显下降;转染72 h后,Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%);MTT结果显示siRNA转染组U25细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测显示,与阴性对照组和空对照组相比,转染siRNA的细胞的实验组中,G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达,能够使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制胶质瘤细胞的增殖,并促进细胞的凋亡。结论构建靶向胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,通过体外试验观察可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,其所产生的RNA干扰效应对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长的抑制和促进凋亡作用。     

抑制IGFBP-2基因的表达对U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 RNA干扰技术沉默胰岛素生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）对胶质瘤细胞株 U251增殖、凋亡的影响,为胶质瘤的基因治疗提供一个可选择的靶点和方法。方法构建靶向 IGFBP-2基因的 RNAi表达载体;采用脂质体法将 siRNA转染U251细胞,设非特异的 siRNA阴性对照组和未转染 siRNA的阴性对照组;采用RT-PCR法半定量检测 siRNA对 IGFBP-2基因表达的抑制作用;用 MTT法测定 U251细胞增殖变化;流式细胞术检测 siRNA诱导细胞凋亡作用。结果构建的 RNAi表达载体抑制了 IGFBP-2基因的表达（P＜0．01）;RNA干扰沉默 IGFBP-2基因可抑制 U251细胞增殖,促进细胞凋亡。结论在细胞水平上,构建的靶向 IGFBP-2的 siRNA可明显抑制 IG-FBP-2基因的表达,导致胶质瘤细胞凋亡率明显上升（P＜0．01）,为进一步利用 RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

蒿甲醚对人恶性胶质瘤细胞的抑制作用

目的 探讨蒿甲醚对U251人胶质瘤细胞增殖活性、凋亡的影响及其机制.方法 将浓度为0、50、100、200、400、600及800 μmol/L的蒿甲醚孵育U251胶质瘤细胞24、48 h.利用MTT法测定细胞增殖活性.然后将利用浓度为0、200、400及800μmol/L的蒿甲醚培养U251人胶质瘤细胞48 h,利用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡.最后利用Western blot法检测胶质瘤细胞的磷酸化AKt的表达水平.结果 400 μmol/L及更高浓度的蒿甲醚培养48 h,U251细胞的增殖活性受到显著抑制,同时随着浓度升高抑制作用增强.与对照组相比,蒿甲醚显著促进U251细胞的凋亡.400 μmol/L和800 μmol/L浓度的蒿甲醚显著抑制了磷酸化Akt的表达水平.结论 蒿甲醚能够以剂量依赖的方式显著抑制U251细胞的增殖活性并促进其凋亡,该抑制作用可能与其抑制Akt信号通路有关.     

顺铂联合血管内皮抑制素对体外培养的U251人胶质瘤细胞生长的影响

目的以体外培养的U251人胶质瘤细胞作为模型,观察顺铂联合血管内皮抑制素对肿瘤细胞生长的影响。方法采用不同浓度的顺铂和血管内皮抑制素及顺铂与血管内皮抑制素的组合作用于体外培养的U251人胶质瘤细胞,以MTT比色法检测其对肿瘤细胞生长的影响。结果不同浓度的顺铂与血管内皮抑制素联合应用对体外培养的U251人胶质瘤细胞生长具有非常明显的协同抑制作用,强于单独使用顺铂或血管内皮抑制素组。结论顺铂联合血管内皮抑制素对体外培养的U251人胶质瘤细胞具有协同杀伤作用。     

芹菜素对胶质瘤细胞增殖抑制作用的研究

目的 探讨芹菜素对人胶质瘤细胞U251的增殖抑制作用.方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,检测不同浓度(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)的芹菜素作用不同时间(24h、48h、72h),对人胶质瘤细胞株U251生长的影响.结果 低剂量的芹菜素(20μmol/L)无明显抑制胶质瘤U251细胞增殖的作用,而中剂量(40μmol/L)及高剂量的芹菜素(80μmol/L)能抑制胶质瘤U251细胞增殖,且抑制作用呈剂量和时间依赖性.结论 芹菜素有抑制人胶质瘤细胞U251增殖的作用.     

儿茶素对脑胶质瘤细胞U251增殖的抑制作用及机制初探

目的:通过体外实验初步研究儿茶素对脑胶质瘤细胞U251增殖的抑制作用及其诱导凋亡的机制.方法:选取8个不同梯度浓度的儿茶素进行甲基噻唑蓝(MTT)实验,观察儿茶素的半致死浓度;倒置显微镜下观察细胞形态,台盼蓝拒染法及Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡,用流式细胞术检测儿茶素对细胞周期的影响.结果:儿茶素对U251细胞的半抑制浓度为62.25 μg/mL,儿茶素作用后U251细胞出现凋亡小体,阻滞于S期,Hoechst33342检测表明细胞凋亡明显.结论:儿茶素明显抑制U251细胞增殖,阻滞细胞周期于S期.儿茶素具有开发为治疗脑胶质瘤药物的可能性.     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

替莫唑胺对人脑胶质瘤U87细胞增殖和血管生成的抑制作用

目的:探讨替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)对人胶质瘤U87细胞体内外生长及血管生成的影响。方法:利用流式细胞分析法测定TMZ诱导的U87细胞周期进程;利用EdU法检测TMZ对U87细胞增殖活性的影响;利用CCK-8法测定TMZ对U87细胞存活性的作用;利用裸鼠成瘤实验检测TMZ在体内对U87异体移植瘤生长的作用;免疫组织化学法检测肿瘤中Ki-67,BDNF及CD31表达,利用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)模型检测TMZ对体内血管生成的影响;ELISA实验检测TMZ对U87细胞中血管生成相关蛋白VEGF,TGF-β和FGF的分泌水平的影响。结果:TMZ增加了U87细胞中G0/G1,G2期细胞的比例,降低了S期细胞的比例,抑制了U87细胞在体外的存活和增殖。TMZ治疗抑制了裸鼠移植瘤的增长及肿瘤中血管内皮标志物的表达,降低了U87细胞中血管生成相关蛋白的水平。结论:TMZ在体内外抑制了胶质瘤U87细胞增殖和血管的生成,这种抑制作用可能与降低Ki-67,BDNF,VEGF,TGF-β和FGF蛋白表达相关。     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

雷公藤内酯醇对神经胶质瘤U87细胞侵袭性抑制的体外研究

目的 研究雷公藤内酯醇（triptolide）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭性的抑制作用,并探讨其作用分子机制. 方法 使用MTT法检测雷公藤内酯醇对胶质瘤U87细胞增殖抑制作用, Transwell实验检测雷公藤内酯醇处理后细胞侵袭能力的变化,进一步通过Real-Time PCR和Western印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的组织蛋白酶B（Cathepsins B,CB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响. 结果 雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制胶质瘤细胞增殖,同时可减弱U87胶质瘤细胞的侵袭能力,下调其CB、MMP-9表达水平. 结论 在体外实验中雷公藤内酯醇抑制U87胶质瘤细胞侵袭性生长的机制与下调CB及MMP-9的表达,降低胶质瘤细胞水解细胞外基质的能力有关.     

MiR-195对人脑胶质瘤细胞 U251和 SHG-44增殖的抑制作用

目的探讨 miR-195过表达对体外培养的人脑胶质瘤细胞U251和 SHG-44增殖的影响。方法通过脂质体将miR-195 mimics转染至U251和SHG-44细胞,同时设立空白对照组和阴性对照组,实时荧光定量PCR检测转染前后miR-195的表达水平;用CCK-8法评价细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果胶质瘤细胞转染miR-195 mimics后,发现U251细胞和SHG-44细胞中miR-195的表达分别为5.93＆#177;0.43和6.43＆#177;0.48,较空白对照组和阴性对照组均增高约6倍左右。与空白对照组和阴性对照组相比,转染miR-195 mimics后的胶质瘤细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞减少。结论过表达miR-195可以阻滞胶质瘤细胞周期进展,从而抑制其增殖,为胶质瘤的基因治疗提供新的策略。     

人参皂苷Rg3对缺氧诱导的Eca-109和786-0细胞血管内皮生长因子和核因子κB表达的影响

目的 探讨人参皂苷Rg3对人食管癌细胞株Eca-109和人肾癌细胞株786-0细胞缺氧诱导的血管内皮生长因子(VEGF)和核因子KB(NF-kB)表达的影响.方法 在常氧和缺氧环境下,采用噻唑蓝(MTT)法检测Rg3对Eca-109和786-0细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测Rg3对VEGF mRNA表达的影响,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测Rg3和NF-kB抑制剂对VEGF蛋白表达的影响,蛋白质印迹(Western)检测Rg3对P65蛋白表达的影响.结果 在常氧或缺氧环境中,MTT显示Rg3都能显著抑制Eca-109和786-0细胞增殖,实时荧光定量PCR显示Rg3能显著抑制Eca-109和786-0细胞VEGF mRNA表达,ELISA显示Rg3和NF-kB抑制剂都能显著抑制VEGF蛋白的分泌,Western显示Rg3抑制P65蛋白表达.结论 Rg3可以抑制缺氧和常氧状态下的VEGF表达,其机制与抑制P65蛋白表达密切相关.     

Knockdown of TRIM47 inhibits glioma cell proliferation,migration and invasion through the inactivation of Wnt/β-catenin pathway

Tripartite motif 47 (TRIM47), a member of the TRIM protein family, plays a crucial role in tumor development and progression. However, the role of TRIM47 in glioma has not been investigated. In the present study, we investigated the expression of TRIM47 in glioma and explored the role of TRIM47 in glioma proliferation and migration both in vitro and in vivo. Our results showed that TRIM47 expression was significantly increased in glioma tissues compared to the normal brain tissues. Knockdown of TRIM47 in U87 and U251 cells inhibited cell proliferation, as well as cell migration and invasion. TRIM47 knockdown caused significant increase in E-cadherin expression and remarkable decrease in N-cadherin and vimentin expressions in both U87 and U251 cells. In vivo assay proved that knockdown of TRIM47 prevented tumor growth of glioma. Furthermore, TRIM47 silencing significantly inhibited the activation of Wnt/β-catenin pathway. Additionally, treatment with LiCl reversed the inhibitory effects of TRIM47 knockdown on cell proliferation and migration in U87 cells. In conclusion, these findings indicated that knockdown of TRIM47 suppressed cell proliferation and metastasis of glioma both in vitro and in vivo. TRIM47 exerted an oncogenic role in glioma and might be a therapeutic target for the treatment of glioma.     

慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响

目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(sh RNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响。方法:RT-q PCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的sh RNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率。实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-sh RNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-sh RNA组(慢病毒介导Cullin组)。MTT法和Brd U实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达。Cullin3-sh RNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-sh RNA组相比,Cullin3-sh RNA组Cullin3表达水平下降(P<0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期。结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

CM通路AEA对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的观察在神经酰胺(CM)通路中,大麻受体激动剂花生四烯酸乙醇胺(AEA)抑制人胶质瘤U251细胞增殖及在诱导细胞凋亡中的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)法,分别测定不同浓度的CM(5~20μmol/L)和烟曲霉毒素(FB1)(10μmol/L)预处理24h后对AEA(1~10μmol/L)抑制人胶质瘤U251细胞增殖作用的影响;流式细胞仪Annexin-V/PI双染色法定量分析FB1(10μmol/L)预处理24h后对AEA(10μmol/L)促细胞早期凋亡作用的影响。结果不同浓度的AEA对人胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用不同,且与CM具有协同作用;10μmol/L FB1预处理24h后可显著对抗AEA对人胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用;AEA(10μmol/L)可诱导人胶质瘤U251细胞发生早期凋亡,而FB1(10μmol/L)预处理24h后凋亡发生率明显下降。结论 AEA可通过CM从头合成通路,与CM呈浓度依赖性协同,从而抑制人胶质瘤U251细胞的增殖并诱导其早期凋亡。     

氯化甲基汞-L-半胱氨酸共轭物诱导恶性脑胶质瘤凋亡的体外研究

目的探讨氯化甲基汞(methylmercury chloride,MMC)-L-半胱氨酸(L-cys)共轭物体外诱导恶性脑胶质瘤U251细胞凋亡并抑制其增殖的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定不同剂量的MMC-L-cys共轭物分别作用24、48、72h后对U251胶质瘤细胞增殖的影响,并与三氧化二砷(ATO)做平行对照研究。流式细胞仪用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染检测凋亡情况。结果 MMC-L-cys共轭物抑制U251胶质瘤细胞的生长和增殖,与正常对照组相比差异显著(P<0.05),其抑制作用强于ATO组(P<0.05),抑制作用呈剂量、时间依赖性;U251胶质瘤经不同浓度的MMC-L-cys共轭物作用后,24h其凋亡率显著高于对照组(P<0.05),诱导凋亡作用具有剂量依赖关系。结论 MMC-L-cys共轭物能诱导胶质瘤细胞凋亡、抑制其增殖,呈时间剂量依赖性,为胶质瘤的治疗提供实验依据。