中长期保存的角膜内皮细胞超微结构的变化

目的 探讨角膜保存方法及保存角膜内皮细胞的超微结构变化.方法 取新鲜眼球经消毒处理后,抽空房水,前房注入optisol、likorol角膜保存液或C3F8惰性气体,全眼球置于保存液中,4℃冰箱保存.分别取保存3～7d的角膜5例(保存组),通过电子显微镜观察角膜内皮细胞的细胞膜、细胞核及线粒体结构,应用角膜内皮机检测角膜内皮细胞密度及六边形细胞比率,并与3d内保存的新鲜角膜对照(对照组).结果 保存组与对照组角膜内皮细胞的细胞膜、细胞核、线粒体之结构变化无明显差异;两组角膜内皮细胞密度及六边形细胞比率差异也无统计学意义(均P>0.05).结论 在optisol、likorol角膜保护液和C3F8气体中长期保存的角膜与新鲜角膜无明显差异.     

毛果芸香碱滴眼对兔眼角膜内皮细胞凋亡作用的影响

目的探讨长期应用毛果芸香碱对兔眼角膜内皮细胞有无影响及影响方式。方法用2%的毛果芸香碱给兔滴眼1个月和3个月后,取下兔眼球迅速固定,分离角膜内皮组织,用蛋白印迹（Western-blot）法检测兔眼角膜内皮细胞中抗凋亡基因bcl-2蛋白及凋亡基因bax蛋白的表达,流式细胞仪检测角膜内皮细胞的凋亡率,透射电镜下观察各组角膜内皮细胞的超微结构变化。结果应用毛果芸香碱1个月及3个月后,均呈现兔眼角膜内皮细胞凋亡基因bax蛋白表达增多,抗凋亡基因bcl-2蛋白表达减少,3个月组兔眼角膜内皮细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05）,透射电镜下观察可见,1个月及3个月组细胞内空泡形成,线粒体肿胀,内质网扩张,细胞核固缩,染色质固缩周边化等典型凋亡改变。结论长期应用2%的毛果芸香碱可以诱导兔眼角膜内皮细胞发生凋亡。     

射频烧灼兔眼角巩膜后超微结构的改变

目的 探讨射频烧灼对兔角膜、巩膜及晶状体、视网膜等眼组织的超微结构影响。方法 应用射频(功率15 W)烧灼24只成年新西兰兔眼角膜、巩膜10s，随机分为四组，每组6只，并分别在烧灼后2h、24h、3d、14d采集标本和用透射电镜观察烧灼组兔角膜、巩膜及晶状体、视网膜的改变，并同时观察对照组的表现。结果 射频烧灼后2h，角膜上皮细胞核染色质固缩、基质部分胶原纤维断离、内皮细胞线粒体肿胀、空泡；巩膜成纤维细胞核染色质固缩、粗面内质网扩张、线粒体肿胀；晶状体无改变；视网膜色素上皮细胞线粒体肿胀、视细胞外节紊乱、内节线粒体肿胀，外核层细胞核染色质固缩等改变。烧灼后3d，角膜上皮细胞结构较为清晰，内皮细胞个别线粒体肿胀，巩膜成纤维细胞线粒体轻度肿胀，视网膜结构基本正常。烧灼后14d，角膜、巩膜和视网膜的超微结构与对照组比较无明显差异。结论 研究结果表明射频烧灼角膜、巩膜可导致角膜和巩膜的直接损伤及视网膜的间接损伤，但其超微结构改变在烧灼后14d可基本恢复正常。     

吲哚青绿介导光动力防治后囊膜浑浊对兔角膜内皮细胞的影响

目的研究吲哚青绿介导光动力防治后囊膜浑浊对兔角膜内皮细胞的影响.方法 32只兔眼随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,分别行晶状体超声乳化皮质吸出术;低、中、高剂量组皮质吸出后前房内分别注入0.5 mL浓度为1.25 mg/mL,2.5 mg/mL,5 mg/mL的吲哚青绿(ICG)后用810 nm的半导体激光对囊膜进行低能量(50 wm/cm)照射2 min.术后3月时观察角膜内皮细胞的数量和角膜的厚度.结果术后3月,低剂量组、中剂量组、高剂量组的角膜内皮细胞数量发生减少,但是与对照组相比,差异无统计学意义;术后3月,低剂量组、中剂量组、高剂量组的角膜厚度增加,但是与对照组相比,差异无统计学意义.结论吲哚青绿介导光动力防治后囊浑浊对兔角膜内皮细胞没有影响.     

器官培养角膜保存法保存兔角膜的观察研究

目的观察器官培养角膜保存法保存角膜活性的效果,探讨该方法临床应用的可行性.方法兔角膜28只,分为两组,实验组16只眼,对照组12只眼.实验组用31℃器官培养液保存,对照组用K-液4℃保存.两组中每4只角膜分别保存3、7、14 d.实验组4只角膜保存14 d后移入运输液中培养3 d.保存前测角膜厚度,做内皮细胞形态学检查和台盼蓝染色.保存后不同时间做相同检查和茜素红染色, 并用透射电镜观察角膜内皮细胞超微结构.在取出角膜前从所有保存瓶抽取保存液样本做细菌和真菌的培养. 临床应用器官培养保存1周的角膜行穿透性角膜移植术1例.结果实验组和对照组角膜内皮细胞形态、活性率1周后差异有显著性.2组角膜厚度差异有显著性.透射电镜检查, 实验组7 d和14 d角膜内皮细胞超微结构完整.对照组7 d后线粒体肿胀,14 d可见细胞结构破坏.穿透性角膜移植术临床病例随访2年,角膜移植片基本透明.结论器官培养液保存角膜的效果确切,活性保存时间明显长于K-液保存.     

实验性家兔持续性高眼压对角膜内皮细胞损伤的观察

目的观察实验性家兔持续性高眼压对角膜内皮细胞的损伤,探讨临床上青光眼持续性高眼压对角膜内皮细胞的损伤机制。方法选择26只健康成年家兔随机分成3个实验组(高眼压持续3 d组、2周组、4周组)各7只(14眼)共42只眼,及正常对照组5只(10眼)。实验组前房注入1%甲基纤维素建立持续性高眼压家兔模型,用角膜内皮显微镜和透射电镜观察持续性高眼压兔眼角膜内皮细胞密度及超微结构的变化。结果3个实验组兔眼角膜内皮细胞平均密度较正常对照组均有不同程度下降,差异有显著性,内皮细胞超微结构出现不同程度变化。结论持续性高眼压对角膜内皮细胞造成损伤,随高眼压持续时间越长程度越重。提示临床上诊治青光眼时应早期控制眼压,减少角膜内皮细胞损伤。     

自制人血清中期角膜保存液对兔角膜的保存效果

目的 研制一种适合我国国情的人血清角膜中期保存液.方法 配制人血清浓度分别为10%(A组)、20%(B组)、30%(C组)、0%(D组)的角膜保存液保存兔角膜,用Optisol-GS角膜保存液作对照组,分别在保存第3、7、10、14天进行角膜内皮细胞活性率检测、HE染色、扫描电镜超微结构观察,并检测角膜保存液的理化性质...     

屈光性角膜切除术对兔角膜内皮细胞的影响

目的探讨ArF准分子激光对角膜内皮细胞的影响.方法运用ArF准分子激光对15只新西兰白兔(30眼)行不同深度(100、200、300μm)屈光性角膜切除术(PRK),通过扫描和透射电镜观察急性期角膜内皮细胞的形态和结构变化.结果消融深度为100μm和200μm的标本中,角膜内皮细胞的形态和结构没有变化.切削深度为300μm组中扫描电镜示术后30min可见角膜内皮细胞明显水肿,面积增大(195μm2),形态不清,内皮细胞表面微绒毛减少,其细胞间的连接也不紧密.术后3d内皮细胞水肿较前减轻(169μm2),微绒毛增多.术后7d时内皮细胞恢复至正常状态(128μm2).结论一定深度的准分子激光才会对角膜内皮细胞造成影响,且随着时间的推移这种损伤会得到修复.     

低温冷冻保存角膜的超微结构观察

应用扫描电镜和透射电镜,对经不同低温冷冻方法保存及不同保存时间的14例角膜进行了超微结构观察。结果发现,扫描电镜下,除1例为甘油法保存473天者,其角膜内皮细胞大部分被破坏外,其它标本的内皮改变程度与保存方法无明显关系;透射电镜下,观察到角膜内皮细胞的有10例,内皮细胞质膜除1例外,其它均完整,内皮细胞、基质细胞及上皮均有线粒体肿胀、内质网池扩张和胞质内空泡形成,唯有内皮细胞的改变程度较后二者更为明显。     

深低温冷冻保存角膜的实验研究

[目的 ]验证二甲基亚砜 (DMSO)是否是目前最好的角膜冷冻保护剂 ,探讨乙醇可否替代DM SA。 [方法 ]16只新鲜兔角膜随机分为DMSO组和乙醇组。将角膜于 4℃分别浸入浓度递增的两组保护液中 ,冷平衡后 ,按 1.5～ 2℃ /min的速度降温至 - 30℃后 ,再以 5℃ /min的速度降温至 -80℃ ,然后 ,将标本瓶投入液氮中冷冻保存角膜 5d。取出后置于 5 0℃流动的热水中快速复温 ,脱保护剂。每组各取 6只角膜 ,经锥兰 -茜素红染色后 ,用光学显微镜计数并计算每只角膜平均内皮细胞存活率 (ESR)。另 2只角膜 ,用 2 .5 %戊二醛溶液固定 ,分别用扫描电镜和透射电镜观察内皮细胞超微结构。 [结果 ]DMSO组和乙醇组平均ESR分别为 (96 .18± 2 .4 9) %和 (92 .5 5± 6 .2 4 ) %(P <0 .0 5 )。扫描电镜下 ,DMSO组角膜内皮细胞呈六角形 ,细胞完整似新鲜角膜 ,细胞间隙稍宽。乙醇组角膜内皮亦呈六角形 ,但细胞间隙明显增宽。透射电镜显示两组角膜内皮细胞均有线粒体肿胀 ,内质网扩张及胞质内空泡形成 ,但乙醇组改变更明显。 [结论 ]本研究提示乙醇对角膜冷冻保存有一定效果 ,但尚不如DMSO。     

猫角膜内皮细胞与人脉络膜色素瘤细胞共培养后增殖能力的变化

目的观察猫角膜内皮细胞(CEC)与人脉络膜黑色素瘤细胞(OCM-1)共培养后增殖能力及细胞周期的变化。方法将角膜内皮细胞分别与肿瘤细胞OCM-1、兔角膜基质细胞在Transwell体系中共培养,通过流式细胞术观察内皮细胞增殖能力及细胞周期的变化。结果与空白对照组角膜内皮细胞周期比较,肿瘤细胞组与基质细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例增加,G1期细胞比例下降,肿瘤组增加幅度高于基质细胞组的。肿瘤细胞组角膜内皮细胞S期细胞比例比空白对照组的平均增加近19%,增殖能力显著提高。结论与肿瘤细胞OCM-1共培养能促进角膜内皮细胞增殖。     

脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

 目的 探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）为支架,复合自体脂肪干细胞构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性。方法 兔脂肪干细胞（rabbit adipose derived stem cells,rASCs）培养至第4代接种在PLGA载体支架上,扫描电镜观察细胞在支架上生长黏附情况。体外培养7天后将rASCs-PLGA复合物回植到角膜基质缺损模型的兔角膜基质层间,术后第12周和24周取材行组织学和透射电镜超微结构观察。未接种细胞的PLGA材料移植基质层间作为对照组。结果 细胞在PLGA支架上生长增殖良好,实验组移植术后12周材料降解,角膜基本恢复透明。组织学检查显示移植后24周新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,电镜下胶原纤维直径与正常角膜基质组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂肪干细胞可作为种子细胞来源用于构建组织工程角膜基质。     

超声乳化白内障摘除术与小切口白内障摘除术对角膜内皮细胞影响的对比研究

目的 通过观察超声乳化白内障摘除手术和小切口白内障摘除术对角膜内皮细胞的数量和形态学(变异系数、六角形细胞比例)以及中央角膜厚度的变化,分析两种手术方式对角膜内皮细胞的安全性。 方法 分析2015年1—12月就诊于蚌埠医学院第一附属医院的共200例白内障患者,分为2组,所有患者均接受6周的随访。超声乳化组患者100例,接受超声乳化白内障手术;小切口组患者100例,接受小切口白内障摘除术。对比2组患者术前、术后各时期中央角膜厚度、内皮细胞密度、变异系数及六角形细胞比例变化情况。 结果 术前、术后6周2组患者中央角膜厚度变化比较差异无统计学意义(P>0.05),术后1周,小切口组患者中央角膜厚度变化与超声乳化组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术前、术后各时期,2组患者内皮细胞密度变化比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组患者各时期角膜内皮细胞面积变异系数及六角形细胞比例变化差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 2种手术方式均会造成不同程度的角膜内皮细胞丢失,但两者对角膜内皮细胞功能和形态学的影响无显著差异。而术前详细的检查,术中精细、熟练的操作以及术后精心的观察治疗,是减少白内障患者角膜内皮细胞丢失的关键。      

冬凌草甲素诱导前列腺癌PC-3细胞自噬作用的实验观察

目的 观察冬凌草甲素(ORI)诱导前列腺癌PC-3细胞自噬,探讨ORI抗前列腺癌的可能机制.方法 实验应用MTT检测细胞存活率、扫描电镜和透射电镜观察细胞超微结构变化、AO染色法观察细胞胞质中酸性泡囊(acidic vesicular organells,AVO)、Western印迹检测MAPI-LC3蛋白水平、RT-PCR技术检测自噬基因beclin 1 mRNA水平.结果 MTT结果显示ORI能有效抑制PC-3细胞增殖,并呈现显著的剂量和时间依赖效应,15 μmol/LORI作用细胞24 h,增殖抑制率达(39.95±3.05)%,48 h后达(51.28±2.91)%.浓度增加至25 μmol/L,抑制率达到(67.94±4.78)%.ORI处理细胞24 h,扫描电镜下观察到细胞缩小变圆,表面微绒毛消失.透射电镜发现细胞核固缩,染色质边集,且胞质中出现大量双层膜包裹形成的自噬体,内含细胞器或胞质.AO染色可见胞质中AVO的形成.Western印迹结果显示ORI促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,ORI处理后LC-Ⅱ蛋白水平升高,LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值下降.RT-PCR结果显示自噬抑制剂3-MA能阻止ORI引起的beclin 1 mRNA水平上调.结论 冬凌草甲素能抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,并通过上调beclin 1的mRNA水平诱导细胞发生自噬.本课题为冬凌草甲素抗肿瘤机制研究提供了新思路.     

缺血-再灌注大鼠胃黏膜毛细血管超微结构的改变

目的 探讨缺血-再灌注大鼠胃黏膜毛细血管超微结构的改变.方法 SD雄性大鼠随机分为正常对照组（CON）、单纯缺血组（ISC）、缺血再灌注1 h组（I/R1）、24 h组（I/R2）和72 h组（I/R3）,用透射电镜观察大鼠胃缺血-再灌注损伤过程中胃黏膜毛细血管超微结构的变化.结果 单纯缺血组,毛细血管内皮细胞肿胀,可见核内异染色质向核周聚集;缺血再灌注1 h时,内皮细胞肿胀明显,可见内皮细胞核固缩,管腔闭塞;再灌注24 h后,毛细血管内皮细胞损伤减轻;再灌注72 h后基本恢复正常.结论 缺血-再灌注大鼠胃黏膜毛细血管超微结构有变化,内皮细胞呈现细胞凋亡的特征,提示胃黏膜毛细血管形态的改变与胃缺血-再灌注损伤的发生发展密切相关.     

Nd：YAG激光治疗后发性白内障对角膜内皮影响的研究

目的探讨Nd：YAG激光治疗后发性白内障对角膜内皮细胞的数量及形态的影响。方法实验组：对32例（32眼）后发性白内障患者行Nd：YAG激光后囊切开术,分别于术前0．5h,术后1d、1周、1个月与3个月测定术眼角膜内皮细胞密度及六边形细胞比例;同时选取32例、32眼（Phaco＋IOL后,后囊混浊未行Nd：YAG激光后囊切开术）作为对照组。记录并分析两组内皮细胞变化趋势。诘果两组术后随访期内角膜内皮细胞密度变化差异无统计学意义,但六边形细胞的比例下降程度实验组大于对照组。结论一定能量范围的Nd：YAG激光对角膜内皮细胞的密度无明显影响,而对内皮细胞的正常形态产生影响。     

绿色荧光蛋白标记兔BMSCs体外成骨的定量能谱分析

目的观察绿色荧光蛋白( GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞( BMSCs)成骨诱导后形态学改变和体外骨生成中矿化钙结节的形成,并结合扫描电镜和X射线能谱分析技术( SEM/EDS)对矿化钙结节元素进行定量能谱分析。方法
　　用携带GFP基因的腺病毒转染兔BMSCs进行示踪标记,并诱导细胞向成骨方向分化,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察成骨诱导后细胞形态改变和矿化钙结节的形成,结合SEM/EDS技术观测矿化钙结节的表面微观结构及其元素构成。结果腺病毒介导GFP基因( Ad-GFP )转染兔 BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,经成骨诱导后细胞形态向成骨方向分化,并形成不透光的矿化钙结节,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,SEM下见矿化钙结节散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。 EDS分析显示矿化钙结节主要组成元素与正常骨组织相同,其钙磷比(Ca/P)为1.55,接近正常骨组织钙磷比1.49。结论 Ad-GFP能成功转染并标记兔BMSCs,成骨诱导后BMSCs向成骨方向分化,具备较好的骨生成能力,BMSCs体外矿质化成骨过程与体内基本相同。     

兔角膜内皮细胞移植治疗角膜内皮损伤

目的 研究兔角膜内皮细胞（CECs）移植的可行性和移植后细胞的形态和功能。方法 体外培养兔CECs并用Brdu标记后接种在Gelatin膜载体上;采用α-氰基丙烯酸脘基酯作为组织黏合剂,将接种有兔CECs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相黏合,原位缝合对21只新西兰白兔的右眼进行CECs移植;另外17只兔的右眼作为对照仅移植没有接种任何细胞的载体膜。术后1、2、4、8、12周观察兔眼角膜移植片的透明情况、眼压和植片厚度,并利用共焦显微镜进行移植细胞的形态观察和计数。观察12周后处死动物,角膜标本分别进行组织切片、免疫组织化学染色和电镜观察。结果 CECs在Gelatin膜载体上生长良好,体外培养3—5d后细胞汇合,细胞密度可以达到约2700个／mm^2。术后2周,所有植片均发生了水肿,并逐渐浑浊。CECs组植片在术后4周左右逐渐水肿减退,开始恢复透明;而对照组角膜植片则持续水肿,逐渐浑浊。术后移植细胞的密度随时间推移逐渐降低,术后12周时,移植细胞的平均密度为（2023±330）个／mm^2。Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色显示,植片上的细胞为移植细胞。结论 Gelatin膜作为内皮细胞培养载体并进行内皮细胞移植是一种可行的方法。     

丝裂霉素C抑制实验性兔角膜新生血管形态学改变的研究

采用角膜缝线方法,诱导8只家兔16只眼角膜新生血管形成。缝线后的第3d,将丝裂霉素C和生理盐水分别注射于家兔眼结膜下,观察每眼角膜新生血管生长情况及组织病理学改变,以探讨丝裂霉素C抑制角膜新生血管的作用机制、结果：丝裂霉素组新生血管的长度明显短于对照组,差异有极显著意义（P＜0．01）;光镜下见浆细胞少;电镜下见新生血管内皮细胞变性。结果表明,丝裂霉素C结膜下注射抑制角膜新生血管的作用,可能是通过控制炎症增生和破坏新生血管内皮细胞来实现的。