家兔阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙检测方法的对比研究

目的　通过对家兔阴茎海绵体平滑肌细胞 (PCSMC)内游离Ca2 检测方法的对比 ,以选择更适宜的方法来研究阴茎海绵体平滑肌的舒张机制。方法　采用新型Ca2 荧光探针Fluo 3/AM标记家兔PCSMC胞浆内游离Ca2 ,应用显微分光光度计 (MSP)、流式细胞仪 (FCM)和激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)分别观察硝苯吡啶 (NIF)对高K 诱发家兔PCSMC内 [Ca2 ]i 变化的影响。结果　MSP和FCM检测发现 ,10 μmol/LNIF能明显减弱高K (4 0mmol/L)诱发细胞内荧光强度的升高 ,抑制率为 (6 5 .5± 4 .4 ) %和 (6 9.3± 5 .2 ) %。LSCM可见细胞胞浆内游离Ca2 分布 ,不同细胞胞浆内的基础荧光强度有差别 ,NIF能明显抑制高K 诱发的细胞内 [Ca2 ]i 升高 ,抑制率为 (71.5±6 .8) %。结论　LSCM能直观地看到单细胞内Ca2 的分布 ,并能动态观察胞浆内 [Ca2 ]i 的变化 ,为研究不同药物对PCSMC的影响提供了良好的实验方法。     

川芎嗪对离体兔阴茎海绵体平滑肌条收缩的影响

目的 初步探讨川芎嗪(Ligustrazine)对离体兔阴茎海绵体平滑肌条的舒张作用及其机制。方法 离体家兔阴茎海绵体平滑肌实验方法,观察川芎嗪对阴茎海绵体平滑肌的舒张效应,测定去氧肾上腺素(PE)和氯化钾(Ka)的浓度-效应曲线。结果 川芎嗪浓度依赖性地舒张PE诱发的阴茎海绵体平滑肌收缩作用,最大舒张效应为(74.1±6.2)％[对照组为(21.9±5.6)％,P<0.01]。不同浓度的川芎嗪可使PE和KCL的浓度-效应曲线右移,最大收缩反应降低,高浓度(0.8g/L)时抑制收缩作用更显著。结论 川芎嗪有明显的舒张阴茎海绵体平滑肌作用,并呈剂量依赖性。川芎嗪舒张阴茎海绵体平滑肌机制可能与抑制细胞外钙内流有关。     

粉防己碱对新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨粉防己碱(Tet)松弛阴茎海绵体平滑肌的作用机制。方法体外培养的第3～4代新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞,经钙荧光指示剂Fluo-2/AM负载后,用荧光离子数字成像系统观察Tet对平滑肌细胞内[Ca~(2 )]i的影响。结果Tet对平滑肌细胞内静息[Ca~(2 )]i无明显影响(P>0.05)。在细胞外钙浓度为2.5 mmol/L时,1、10和100μmol/LTet对高钾和去氧肾上腺素(PE)引起的细胞内[ca~(2 )]i升高有浓度依赖性地抑制作用。对40 mmol/L KCl引起的细胞内[Ca~(2 )]i升高的抑制率分别为22.0%、41.0%和73.0%(P<0.05)。对10μmol/L PE引起的细胞内[ca~(2 )]i升高的抑制率分别为15.0%、26.4%和46.6%(P<0.05)。在无细胞外钙时,1μmol/L和10μmol/L Tet对PE引起的细胞内[Ca~(2 )]i升高,无明显影响(P>0.05);而100μmol/L Tet能明显抑制PE引起的细胞内[ca~(2 )]i升高,抑制率为28.2%(P<0.05)。结论Tet可能通过阻滞电压依赖性钙通道、α1受体依赖性钙通道和抑制细胞内钙库释放,降低阴茎海绵体平滑肌细胞内[Ca~(2 )]i水平,这是Tet松弛阴茎海绵体平滑肌的作用机制之一。     

家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法对比研究

目的　探索更好、更方便的家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法。方法　分别采用组织块法、酶消化法、组织块 酶消化法对家兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行培养 ,在倒置显微镜下对培养过程的细胞分别作了生长情况及形态学观察。用HE染色、MTT法分别描绘原代培养细胞的生长曲线、细胞分裂指数曲线 ;用倒置显微镜观察活细胞的贴壁过程 ,计数法测定细胞贴壁率。结果　组织块法及酶消化法培养的细胞其生长状况和形态学各有自己的特点。组织块法的细胞生长慢 ,培养时间相对较长 ,纯度相对较高 ,原代培养细胞生长速度快 ,但由于该法消化时间不易掌握 ,常影响其成功率 ,多数细胞呈梭形 ,细胞的密度高 ,原代培养时间为 7～ 10d。结论　每种培养方法都有各自的优缺点。我们可根据实验的需要而选择不同的方法或联合培养     

钙通道阻滞剂舒张阴茎海绵体平滑肌的研究进展

钙通道广泛存在于心肌、骨骼肌、平滑肌及神经元细胞膜上 ,钙通道阻滞剂因其舒张血管平滑肌而广泛应用于心血管疾病的治疗。本文综述了钙通道阻滞剂舒张阴茎海绵体平滑肌的实验研究的最新进展 ,能否应用于阴茎勃起功能障碍的诊断和治疗尚有待进一步研究和探讨     

阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展

阴茎海绵体平滑肌细胞是组成阴茎海绵体的主要功能成分,其表型转化是平滑肌细胞增殖和迁移的关键性起始步骤。因此,探讨平滑肌细胞表型转化的机制及其影响因子在阴茎勃起功能障碍的防治过程中具有重要意义。目前通常将平滑肌细胞分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型、增殖型或去分化型)两种类型,并发现L转化生长因子(TGF-β)、转录因子E2F1、基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)、胰岛素等因素可能影响平滑肌细胞表型转化。本文就近年来阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展作一简要综述。     

低氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨低氧和SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)凋亡的关系。方法:体外培养CCSMC,免疫组化鉴定细胞;低氧(1%O2浓度)干预12、24、48、72 h,常规氧浓度作为对照,流式细胞术测定细胞周期变化和凋亡情况。结果:体外培养的CCSMC生长良好,抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化DAB法染色阳性。流式细胞术检测CCSMC G0/G1期在48 h内细胞比例逐渐增加,后下降;S期细胞比例与G0/G1期呈相反趋势;G2/M期细胞比例无明显规律。结论:CCSMC在低氧环境下,随时间的延长凋亡程度加重,48 h达到最大值,进一步延长时间细胞裂解,不能加重凋亡。     

维拉帕米对离体家兔阴茎海绵体平滑肌舒张作用的实验研究

目的　初步探讨维拉帕米 (VP)对离体兔阴茎海绵体平滑肌的舒张作用及其机制。方法　离体家兔阴茎海绵体平滑肌条实验方法 ,观察VP对阴茎海绵体平滑肌的舒张效应。结果　VP可舒张去氧肾上腺素 (PE)诱导的阴茎海绵体平滑肌收缩作用 ,最大舒张效应为 (4 6 .3± 2 .1) % (P <0 .0 1) ,且呈浓度依赖性。 10 -6mol·L-1,10 -5mol·L-1和 10 -4mol·L-1VP均可使PE引起的浓度 -效应曲线右移 ,最大收缩反应降低 ,10 -4mol·L-1VP拮抗作用更显著。结论　VP有明显的舒张阴茎海绵体平滑肌作用 ,并呈浓度依赖性。     

硝苯吡啶体外对家兔阴茎海绵体平滑肌的舒张作用

阴茎海绵体平滑肌可表达L型电压依赖性钙通道，钙拮抗剂通过选择性作用于钙通道，阻滞细胞的外钙内流而舒张阴茎海绵体平滑肌，在犬阴茎海绵体内注射维拉帕米能诱发阴茎勃起。本实验旨在观察硝苯吡啶（NIF）对高K^＋诱发的离体家兔阴茎海绵体平滑肌条收缩的影响，并探讨其舒张效应和机制。     

阴茎海绵体平滑肌细胞的鉴定分析进展

勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是一种多因素引起的男科难治性疾病[1],严重影响患者的整体健康和生活质量[2].阴茎海绵体平滑肌细胞(CSMC)是组成阴茎海绵体的主要功能成分,约占整个阴茎组织成分的40%～50%,是阴茎神经调控的主要效应器部位[3,4],因此也成为调节阴茎勃起及维持勃起的重要因素.从这意义上来讲,CSMC的研究显得尤为重要,而CSMC的培养和鉴定是这研究的基础,因此CSMC纯化鉴定在细胞水平上研究ED的机制颇受到关注,本文就体外培养的CMSC鉴定分析做一综述.     

P物质对体外培养的胃癌细胞内游离钙浓度的影响

目的研究P物质（substance P，SP）对体外培养的人低分化胃癌细胞MKN45内游离钙浓度的影响。方法在RPMI1640培养液中培养人胃癌细胞系MKN45，应用钙特异性荧光指示剂Furu-3／AM负载细胞，用ASN-1377642（NK-1受体拮抗剂）、尼卡地平和不同浓度的SP作用于人胃癌细胞MKN45，采用激光扫描共聚焦显微镜观测胃癌细胞内游离钙浓度的变化。结果在Hanks液（含钙离子）中加入10、50及100nmol／LSP可以显著升高胃癌细胞内钙离子浓度（P〈0．05），并且呈剂量依赖性（P〈0．05）；在无外钙时，SP引起细胞内钙离子浓度升高的幅度低于有外钙时（P〈0．05）；在Hanks液中加入NK-1受体拮抗剂ASN-1377642和钙通道阻滞剂尼卡地平孵育后，SP引起胃癌细胞内钙离子浓度升高的幅度显著降低，与Hanks液组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论SP可以显著升高胃癌细胞内钙离子浓度，细胞内钙离子浓度的升高源于内钙释放和外钙内流。     

小干扰RNA抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43的表达

目的:利用小干扰RNA(siRNA)抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43(Cx43)的表达和检测细胞间间隙连接通讯功能,探讨该技术在阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接和阴茎勃起功能研究中的应用。方法:利用Ambion公司设计软件,构建靶向人Cx43基因的siRNA重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测Cx43基因和蛋白的相对表达水平、划痕标记荧光染料传输技术检测细胞间间隙通讯功能,并分别与siRNA阴性对照、空白对照组比较。结果:酶切和测序证实siRNA真核表达载体构建成功。siRNA重组质粒转染细胞后的Cx43 mRNA和蛋白相对表达水平分别为(0.45±0.08)%、(0.56±0.06)%,与siRNA阴性对照组(0.72±0.04)%、(0.80±0.08)%和空白对照组(0.74±0.09)%、(0.77±0.11)%相比,差异均有显著性(P(0.05);转染后的细胞间间隙连接通讯功能也显著降低。结论:siRNA能有效抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞Cx43的表达和阻断间隙连接介导的间隙连接通讯功能。     

Effects of Carvedilol Alone and in the Presence of Cyclosporine A on the DNA Synthesis of Cultured Vascular Smooth Muscle Cells

Purpose. There is still no reliable method of preventing or treating chronic rejection or transplant vascular sclerosis. A recent in vitro cell culture study showed that carvedilol significantly inhibited the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs); however, the effect of carvedilol in the presence of cyclosporine (CsA) has not yet been reported. Using in vitro cultured VSMCs, we measured the antiproliferative activity of carvedilol alone and in combination with CsA. Methods. Growth-arrested cultured VSMCs from the thoracic aorta of Sprague-Dawley rats were exposed to platelet-derived growth factor (PDGF)-BB, endothelin (ET)-I, and angiotensin (ANG)-II. Carvedilol (1 and 10 μM) and/or CsA (100 nM) were added as test drugs. DNA synthesis was assessed by measuring the incorporated [³H]thymidine activity, and the percentage of inhibition in the presence of the test drugs was determined. Results. Compared with the PDGF-stimulated control, DNA synthesis decreased significantly to 60.3% ± 10.4% and 18.3% ± 5.9% in the presence of 1 and 10 μM of carvedilol, respectively (P < 0.05, each). Carvedilol significantly inhibited the activity of VSMCs stimulated by ET-1 and ANG-II. The IC₅₀ of carvedilol was 1–10 μM. CsA only inhibited VSMCs significantly in the PDGF-stimulated subgroup. The addition of CsA in the presence of carvedilol did not affect the inhibitory activity of carvedilol. The pattern of inhibition in the combined group was uniform and similar to that of the carvedilol alone group, regardless of the stimulator used. Conclusion. Carvedilol significantly inhibited the DNA synthesis of VSMCs regardless of the kind of stimulators examined, even in the presence of CsA. These results indicate that carvedilol has the unique potential to inhibit the development of transplant vascular sclerosis in hypertensive transplant recipients under CsA-based immunosuppression. Received: November 27, 2000 / Accepted: September 11, 2001     

Fas—配体在移植物动态硬化血管平滑肌细胞中的表达

目的：为探讨移植物动脉硬化形成过程中,血管内膜和外膜增生的平滑肌细胞中是否有Fas-配体（Fas-L)表达。方法：健康纯系Wistar大白鼠为供者,306只;SD大白鼠为受者,162只,根据受者血管移植后有无明显排斥反应分为3组。急性排斥组：受者90只,分别于术后14天、28天、56天处死,每次处死30只;免疫耐受组;受者72只,分别于术后28天、56天、84天处死,每次处死24只;对照组：供者和受者均为Wistar大白鼠,受者72只,处死方法同免疫耐受组。采用同种异体大鼠胸主动脉腹腔移植模型。切取标本经处理后进行Masson染色和免疫组织化学染色,比较移植术后不同时间Fas-L在增生外膜和内膜平滑肌细胞上的表达水平。结果：术后14天、28天、56天急性排斥组外膜Fas-L的表达程度逐渐增高（P＜0．01）,其在外膜增生的平滑肌细胞中表达比内膜更早且广泛。Fas-L在急性排斥组的表达程度和范围亦比免疫耐受组和对照组明显增高和广泛（P＜0．05）。结论：在移植动物硬化形成过程中,Fas-L在增生平滑肌细胞中高度表达,其参与移植物动脉硬化的发生和发展。     

成人及家兔阴茎海绵体平滑肌细胞培养和鉴定

目的 :探索阴茎海绵体平滑肌细胞 (CCSM)体外培养及鉴定方法。　方法 :采用勃起功能正常的成年男子及新西兰家兔的新鲜阴茎标本 ,经处理后采用原代细胞培养法 ,对阴茎海绵体组织块进行培养 ,获得CCSM后用光镜、透射电镜和免疫组化等多种方法从细胞形态学及CCSM生长特性等不同侧面对培养的人及新西兰家兔的CCSM进行鉴定 ,并测定CCSM在体外培养时的细胞增殖情况。　结果 :经 2 4h潜伏期 ,体外培养的CCSM进入指数增长期 ,维持约 96h后进入平台期 ;从接种组织块至长成单层细胞约需 15～ 2 0d ,传代后约 4～ 7d后长成单层 ;传代后的细胞增殖旺盛 ,成束状生长 ,并呈现层叠排列及“峰 谷”现象 ;CCSM在体外可稳定传 7～ 12代 ,传代期间其形态及增殖活性变化不明显 ;各种检测鉴定均证实所获细胞为CCSM。　结论 :CCSM原代细胞培养法简便、稳定、可靠 ,对研究阴茎的勃起机制及勃起功能障碍的发生、发展、调控及其治疗药物筛选有重要理论及现实意义。     

番泻甙对小肠平滑肌细胞收缩功能的影响

目的:探讨大黄的主要有效成分番泻甙对小肠平滑肌细胞收缩的影响。方法:酶解法获取大鼠小肠环行平滑肌细胞,图像分析仪检测不同浓度的番泻甙对小肠环行平滑肌细胞的收缩作用,激光扫描共聚焦显微镜测定番泻甙对细胞内游离钙离子浓度[Ca2 ]i的影响,然后测定番泻甙对Ach刺激的小肠环行平滑肌细胞收缩反应和细胞内[Ca2 ]i变化的影响作用,通过免疫荧光实验检测番泻甙对RhoA的活化和空间转位的影响。结果:不同浓度的番泻甙对小肠环行平滑肌细胞没有直接收缩作用,对环行平滑肌细胞的[Ca2 ]i也没有升高作用,但经番泻甙作用后,Ach引起的小肠环行平滑肌细胞的收缩剂量-反应曲线明显左移(P<0.05)。番泻甙可以促使RhoA的活化,从胞浆转位至胞膜,提高平滑肌细胞收缩的钙敏感性。结论:番泻甙没有直接收缩小肠平滑肌的作用,但可通过活化RhoA,提高小肠环行平滑肌的钙敏感性,与其他激动剂协同增强小肠的运动功能。     

腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响

目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性。方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平。结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1106.3±10.8、1121.3±10.2、1058.5±12.1和空白对照组的1076.6±9.7、1133.4±11.2、1104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的体外培养及其生物学特性

目的 :研究体外培养的新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞的生物学特性。　方法 :采用组织块培养法 ,对兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行活细胞观察 ,并测定其细胞生长曲线、贴壁率、细胞分裂指数。　结果 :①兔阴茎海绵体平滑肌细胞为梭形 ,呈长轴平行排列 ,具有明显的方向性 ;②体外贴壁快 ,生长迅速 ,体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞在合适的传代条件和比例下能够生存并保持其稳定的生物学特性。　结论 :体外培养的兔阴茎海绵体平滑肌细胞模型可用于检测某些药物对阴茎勃起的影响。