重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL免疫毒素的构建?表达及纯化

目的:构建绿脓杆菌外毒素PE38KDEL融合全人源抗c-Met单链抗体原核表达载体,并对其产物进行变性、复性和纯化,检测其对肝癌细胞系的毒性作用.方法:以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板扩增出人源c-Met单链基因,采用基因工程原理,将扩增出的c-Met单链基因和PE38KDEL基因克隆入pBAD/GⅢA表达载体中,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确;转化大肠杆菌Top10F',左旋阿拉伯糖诱导表达,采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品,并用连续梯度透析的方法对纯化后的包涵体进行复性;采用流式细胞术鉴定复性产物与靶细胞的结合活性,MTT法检测c-Met/PE38KDEL免疫毒素对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:成功构建了免疫毒素表达载体pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL;诱导产物主要以包涵体形式存在;复性后的免疫毒素c-Met/PE38KDEL具有与靶细胞特异性结合的活性并且对SMMC7721细胞系具有较明显的杀伤作用.结论:全人源抗c-Met单链抗体与PE38KDEL重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果,为进一步肝癌的导向治疗提供依据.     

抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,并对其产物作初步纯化 ,检测其对人肝癌细胞系SMMC 772 1的毒性作用 .方法 :采用基因工程原理 ,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体 pGEX 4T 1中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ;转化大肠杆菌JM10 9后 ,受IPTG诱导表达GST融合蛋白 ,产物包涵体经变性、复性及重折叠并经GST亲合层析柱层析、凝血酶消化后 ,得到纯化的hscFv PE38融合蛋白 .采用MTT法检测hscFv PE38对SMMC772 1的杀伤作用 .结果 :实验成功构建了免疫毒素表达载体pGEX 4T 1 hscFv PE38(以下简称pGEXh PE38) ;诱导产物主要以包涵体形式存在 ,表达量为 11% ;纯化的hscFv PE38对SMMC 772 1细胞系具有较明显的杀伤作用 ,最大杀伤率为78% ,IC50 为 0 .386mg·L-1.结论 :人源化抗肝癌单链抗体与PE38重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果 ,为进一步肝癌的导向治疗提供依据     

重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1的构建及表达

目的构建人分泌型IL-2与免疫毒素Luffin P1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化.方法采用基因工程原理,将IL-2-Luffin P1的重组基因片段克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白-重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1.结果成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-hIL-2-Luffin P1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论hIL-2-Luffin P1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础.     

小干扰RNA抑制肝癌细胞株BEL7402 ICAM-1基因表达的研究

目的研究小干扰RNA（siRNA）抑制肝癌细胞系BEL7402基因ICAM-1表达的可行性。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断，构建pGenesil-1／ICAM-1表达载体，转染BEL7402细胞，实时定量PCR和免疫组织化学方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因表达抑制情况。结果该实验已成功构建了针对ICAM-1基因的pGenesil-1／ICAM-1质粒。实时定量PCR检测结果显示，BEL7402细胞经特异性siRNA作用后ICAM-1基因的表达受抑制，其Ct值由28．8降低到21．6，免疫组织化学结果显示：RNA干扰（RNAi）能特异而有效地抑制BEL7402细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pGenesil-1／ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株BEL7402中的表达，为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

IL6(23)-PE40重组毒素的表达和对肿瘤细胞的杀伤效果

目的: 以IL-6作为导向载体,PE40作为杀伤毒素,构建重组毒素对肿瘤细胞具有特异的杀伤功能. 方法: 通过构建IL6(23)-PE40重组毒素质粒,经大肠杆菌高效表达,纯化表达产物,进行细胞的毒性试验. 结果: 表达产物具有杀伤骨髓瘤细胞、急性髓样白血病细胞,胃癌细胞,肝癌细胞和喉癌细胞的毒性,当重组毒素浓度为0.6 μg *L-1时可杀伤50%的SP2/0细胞,而对其他细胞无毒性. 结论: 表达的重组毒素可特异杀伤骨髓瘤细胞等5种肿瘤细胞,而对试验中其他5种肿瘤细胞及5种正常细胞无杀伤作用.     

肝细胞癌MAGE-A9基因的克隆、表达及特性鉴定

目的：扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE—A9(melanoma antigen A9)cDNA，构建原核表达载体，制备抗MAGE—A9单抗．观察其在肝细胞癌中的表达。方法：从人肝癌组织提取总RNA，用RT—PCR从中扩增出MAGE—A9 cDNA，插入载体pMD18-T中．测序正确后，构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE—A9,转化大肠杆菌TOP10株进行表达。重组蛋白经L-Arabinose诱导表达纯化后．制备抗MAGE—A9单抗．免疫组化检测MAGE—A9在肝细胞癌中的表达和定位。结果：获得MAGE-A9cDNA，测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体，表达可溶重组蛋白，SDS—PAGE分析其相对分子质量为35kD。获得抗MAGE—A9单抗，MAGE-A9在肝细胞癌中的阳性表达率为21％(8／39)，主要表达于胞浆，未见肿瘤异质性，统计学分析MAGE—A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性。结论：有相当部分肝癌患者的肿瘤表达MAGE—A9抗原，且其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性．MAGE-A9可能成为肝癌特异性免疫治疗的靶点。     

融合蛋白EGF-TCS的纯化及体外靶向杀伤肿瘤细胞的研究

目的 在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白,观察该融合蛋白对肿瘤细胞的靶向选择性杀伤作用.方法 将重组表达质粒PQE30/EGF-TCS转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化;用流式细胞仪检测肿瘤细胞株和正常肝LO2细胞株的EGFR表达量;进行细胞杀伤实验,验证EGF-TCS的选择性杀伤能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法进一步考察EGF-TCS的靶向选择性杀伤能力,并用电镜观察细胞形态.结果 重组表达质粒PQE30/EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达,表达上清柱纯化纯度达95%以上;肝癌BEL-7402细胞表面EGFR表达量最高(72.33%),正常肝LO2细胞表面EGFR表达量最低(5.51%),重组的融合蛋白对肿瘤细胞具有较大的杀伤能力(BEL-7402、MCF-7和BGC-823的IC50分别为11.40、22.47、12.53 μg/ml),对正常细胞的杀伤能力微弱(IC50为53.19 μg/ml).结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,该融合蛋白可明显促进肿瘤细胞的凋亡.     

重组人肿瘤坏死因子α联合变异型IL-2治疗肝癌的实验研究

目的从大肠杆菌中获得高活性重组人肿瘤坏死α因子(rhTNF-α),并探索TNF-α与其它细胞因子临床治疗肝癌的合理配伍方案.方法CaCl2法转化大肠杆菌JM109,温度诱导rhTNF-α收获菌体,裂解后,Western bbt检测表达产物的特异性,薄层分析rhTNF-α表达量,MTT-短程法测定rhTNF-α对L929杀伤作用.以表达的rhTNF-α作用于肝癌细胞株BEL7402和荷瘤鼠(肝癌腹水瘤),验证其对肝癌细胞的体内外抑制作用.采用嵌套设计,MTT-短程法测定rhTNF-α与变异型IL-2对BEL7402的协同抑制作用.结果Western blot证实pAW711转化JM109后筛得的重组菌表达产物特异性良好,薄层分析表明rhTNF-α表达量可达菌体蛋白的17.8%,MTT-短程法证实表达产物具有良好生物活性,并可在体外明显杀伤肝癌细胞,其杀瘤活性优于标准对照.体内实验证实rhTNF-α可使人肝癌腹水瘤荷瘤鼠生命延长率达31.5%.rhTNF-α与变异型IL-2具有协同抑癌作用,其协同作用具有特殊的剂量依赖性.结论在大肠杆菌中可获得高活性rhTNF-α,rhTNF-α在体内外均可明显抑制肝癌细胞,变异型IL-2对此有协同作用.     

重组人肿瘤坏死因子α联合变异型IL—2治疗肝癌的实验研究

目的：从大肠杆菌中获得高活性重组人肿瘤坏死α因子（rhTNF-α）,并探索TNF-α与其它细胞因子临床治疗肝癌的合理配伍方案。方法：CaCl2法转化大肠杆菌JM109,温度诱导rhTNF-α,收获菌体,裂解后,Western blot检测表达产物的特异性,薄层分析rhTNF-α表达量,MTT-短程法测定rhTNF-α对L929杀伤作用,以表达的rhTNF-α作用于肝癌细胞株BEL7402和荷瘤鼠（肝癌腹水瘤）,验证其对肝癌细胞的体内外抑制作用。采用嵌套设计,MTT-短程法测定rhTNF-α与变异型IL-2对BEL7402的协同抑制作用。结果：Western blot证实pAW711转化JM109后筛得的重组菌表达产物特异性良好,薄层分析表明rhTNF-α表达量可达菌体蛋白的17.8%,MTT-短程法证实表达产物具有良好生物活性,并可在体外明显杀伤肝癌细胞,其杀瘤活性优于标准对照,体内实验证实rhTNF-α可使人肝癌腹水瘤荷瘤鼠生命延长率达31.5%,rhTNF-α与变异型IL-2具有协同抑癌作用,其协同作用具有特殊的剂量依赖性。结论：在大肠杆菌中可获得高活性rhTNF-α,rhTNF-α在体内外均可明显抑制肝癌细胞,变异型IL-2对此有协同作用。     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。     

经络腧穴理论的形成与发展

从<脉书·十一脉><黄帝内经>等文献人手,梳理了血气、经络、腧穴理论的形成与发展,简要介绍了四肢部的基本腧穴、躯体部要穴,以及腧穴配伍的基本要义.     

心肾不交与基因/蛋白质失联之相关性及其临床意义

根据DNA与蛋白质相互作用原理,以及DNA-蛋白质与中医心肾关系的认识,通过分析中西医临床研究,发现中医"心肾不交"与"基因-蛋白质失联"有诸多吻合之处。认为两者相互印证、互补长短、相得益彰的深入研究,将会使中医交通心肾方法与方药得到更多的开发与推广应用。     

Exosomes与肾脏生理及疾病

胞外体（exosomes）是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中直径30～100nm的膜性小囊泡,内含来源细胞的mRNA、miRNA和蛋白质等成分,能反映来源细胞的生物学信息,可能成为潜在的生物学标志物。Exosomes在信号转导、诱导机体抗肿瘤和免疫耐受等方面的作用是近年来研究的热点,并已成为一种新型治疗手段。尿液exosomes与肾脏生理功能及疾病之间有着密切的关系,但其研究尚处于初期阶段。文章就exosomes的生物学特性、生理功能、分离纯化及其在肾脏疾病方面的标志物作用和治疗价值的研究进展作一综述。     

浅谈梅毒的流行与防治

本文报告了梅毒的流行、预防和各期的治疗及胎传梅毒的治疗。     

大鼠/小鼠证候及辨证论治方法学的探索与发展

从大鼠/小鼠四诊和辨证方法的提出与创建,大鼠/小鼠计量化辨证方法的建立,荷瘤小鼠证候发生和演变的揭示,大鼠/小鼠异病同证、同病异证的研究,荷瘤小鼠个体化辨证论治及计量化疗效评价,以及不同证候荷瘤小鼠神经—内分泌—免疫网络基因转录与剪接的特征等方面,总结项目组长期以来所提出的系列假说及开展的大量研发工作,对所解决的学术问题,以及该领域存在问题、前沿和发展趋势做了评述。     

疟疾知信行现状和影响因素

疟疾是世界范围内的重要公共卫生问题。疟疾相关知识、态度和行为的调查有助于了解当地居民对疾病的认知水平,为制定有效的防控措施提供重要依据。本文综述了疟疾相关知信行调查研究现状及其影响因素。     

经络学说与切诊

结合古典文献研究,从对体表循经按压产生的经络反应,腧穴反应,切脉诊反应,切脉诊络、切脉诊络,辨证归纳,辨位归经几个方面论述了经络学说与中医临床诊断的密切关系,从而为中医临床各科的辅助诊断提供依据。