丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成,具有丝氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶(NTPase)和螺旋酶(Helicase)的功能,在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用.非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性,是检测HCV感染的主要抗原之一.近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能.此外,NS3蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)是至今为止功能尚不明确的HCV非结构蛋白,近年来的研究表明其定位于内质网膜,与细胞内膜结构的功能有关.在体外实验中,它和NS4A一起可以抑制宿主细胞的翻译;在一定程度上可以减弱机体对抗病毒药物干扰素-α(INF-α)的反应,同时使病毒可以逃避宿主对病毒的免疫;在HCV病毒的致瘤性方面亦有重要作用.可以与NS3、NS4A、NS5A、NS5B等相互作用,对其它非结构蛋白的功能起协同、促进甚或是下调作用.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成，具有线氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶（NTPase）和螺旋酶（Helicase）的功能，在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用。非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性，是检测HCV感染的主要抗原之一。近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能。此外，NS53蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）是至今为止功能尚不明确的HCV非结构蛋白，近年来的研究表明其定位于内质网膜，与细胞内膜结构的功能有关，在体外实验中。它和NS4A一起可以抑制宿主细胞的翻译；在一定程度上可以减弱机体对抗病毒药物干扰素-α（INF-α）的反应，同时使病毒可以逃避宿主对病毒的免疫；在HCV病毒的致瘤性方面亦有重要作用。可以与NS3，NS4A，NS5A，NS5B等相互作用。对其它非结构蛋白的功能起协同，促进甚或是下调作用。     

p7蛋白--丙型肝炎病毒潜在抑制靶点

丙型肝炎（hepatitisc）是严重的慢性传染病之一，全世界病毒感染者约1．7～2亿。HCV为单链RNA病毒，一个开放读码框编码了3010个氨基酸的前体蛋白，在细胞和病毒蛋白酶共同作用下，前体蛋白被降解成结构蛋白和非结构蛋白两部分。结构蛋白包括核心蛋白（C）和膜蛋白（E1、E2）以及p7蛋白，非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSSA和NSSB。p7蛋白结构、功能仍然了解甚少。最近有研究发现p7蛋白可能是一个重要的病毒抑制靶点。     

HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展

丙型肝炎病毒感染最显著的特征是慢性化,已经成为严重的社会公共卫生问题.目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,持续疗效有限而且副作用大,因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物.HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性,在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用.因此,NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物.本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下.     

HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展

丙型肝炎病毒感染最显著的特征是慢性化，已经成为严重的社会公共卫生问题。目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用，持续疗效有限而且副作用大，因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物。HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性，在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用。因此，NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物。本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下。     

丙型肝炎病毒5'端非编码区的结构与功能研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为单股正链有包膜RNA病毒,为黄病毒科丙型肝炎病毒属成员,基因组长约9.6kb,5'端和3'端分别有一个非编码N(NCR),中间的编码区含有一个单一的长开放读码框架(ORF),转译出一条约3011个氨基酸残基的聚蛋白前体.该聚蛋白前体被宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶水解加工成为至少十种成熟的功能蛋白,其排列顺序为:NH2-核心蛋白C-包膜蛋白E1-E2/NS1-非结构蛋白P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH[1].HCV ORF的翻译是由其5'NCR指导的,该序列可作为一个内部核糖体起始位点(internal ribosome entry site,IRES),被小核糖体亚基(40S)和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3,eIF3)特异识别,允许ORF起始密码子近端与核糖体直接结合,使得病毒聚蛋白的翻译以非帽子(7-甲基鸟苷酸)依赖机制进行.由于宿主细胞mRNAs主要以帽子依赖机制起始翻译,因此IRES的功能特点使得5'NCR成为抗病毒作用研究和研制药物评价系统的理想靶位点,而5'NCR的结构及其IRES元件起始聚蛋白合成的机制也成为近年来的研究热点.本文将就这些方面的研究进展作一综述.     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒NS5A区序列与干扰素疗效的关系

目的　探讨上海地区丙型肝炎病毒 (HCV) 1b亚型慢性感染者的血清HCV非结构基因5A(NS5A)与干扰素 (IFN)疗效的关系。方法　收集上海地区 2 4例HCV1b慢性感染者在干扰素治疗前后及随访过程中的血清标本 ,定量检测治疗前血清HCVRNA ,用逆转录 聚合酶链反应方法扩增NS5A的干扰素敏感决定区 (ISDR)基因并进行测序和分析。另扩增干扰素应答类型不同的 3例患者治疗前后共 5株HCV病毒的NS5A全长序列 ,测序后作种系发生树分析及蛋白二级结构预测。结果　治疗前血清HCVRNA的定量结果显示 ,持续应答组的病毒滴度 (平均滴度 4 50× 1 0 4copies ml)明显低于复发组和无应答组 (平均滴度 1 82× 1 0 7copies ml)。 2 4例慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与抗干扰素的HCV J株比较 ,1 3例为野生型 ,1 1例为中间型 ,无突变型。 6例完全应答者 3例感染的是野生型株 ,另 3例感染的是中间型病毒株。 5株HCV病毒的NS5A全长序列种系发生树显示 ,3种不同应答类型株在种系发生上分属 3个组别 ,无应答株与抗干扰素的HCV J株关系相近被归为 1组。蛋白质二级结构预测显示 ,上述病毒株NS5A蛋白在二级结构方面基本相似 ,仅在 2 2 55～ 2 2 89范围内有明显不同 ,这一区域与PKR结合域部分重叠。结论　HCVNS5A基因     

丙型肝炎病毒蛋白酶生物学功能研究进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）为单股正链ＲＮＡ病毒,基因组含一大开放读码框架,其编码的多蛋白前体经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工成具有生物学功能的成熟蛋白。研究表明,病毒编码的蛋白酶－Ｚｎ２＋依赖性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶与ＨＣＶ非结构区的加...     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶及抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(heptitis cvirus,HCV)丝氨酸蛋白酶(serine protease)是催化病毒前体蛋白中非结构蛋白部分裂解的关键蛋白酶.对病毒复制和宿主细胞都有重要作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点.本文从丝氨酸蛋白酶结构、功能和抑制剂等三方面,介绍丝氨酸蛋白酶的研究进展,这对该酶抑制研究和丙型肝炎的治疗研究会有积极意义.     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶及抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(heptitis cvirus，HCV)丝氨酸蛋白酶(serine protease)是催化病毒前体蛋白中非结构蛋白部分裂解的关键蛋白酶。对病毒复制和宿主细胞都有重要作用，是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本文从丝氨酸蛋白酶结构、功能和抑制剂等三方面，介绍丝氨酸蛋白酶的研究进展，这对该酶抑制研究和丙型肝炎的治疗研究会有积极意义。     

HCV 5′ NCR和结构蛋白编码序列的拼接及在pLNSX中的克隆

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)5′末端非编码区(5′NCR)和结构蛋白编码基因序列逆转录病毒重组体,用于探索控制HCV感染的新途径和基因治疗。方法:对多株HCV核酸序列进行同源性比较设计引物,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增5′NCR、C、E1和E2/NS14个编码区共5个片段,分别克隆。以连接聚合酶链反应(PCR)将这5个片段拼接为一连续的长2547nt的片段,含HCV完整的5′NCR和全部的结构蛋白编码序列。将此序列插入pGEM-Zf(+)载体,与逆转病毒pLNSX载体中,转化大肠杆菌DH5a、转化菌落经酶切、PCR和Southern杂交鉴定。结果:通过RT-PCR和连接聚合酶链式反应(PCR)扩增出2547nt含HCV完整的5′NCR和全部的结构蛋白编码序列,将此序列与pGEM-Zf(+)重组得重组体pHC2547,与逆转录病毒载体pLNSX重组得pL-HC。结论:成功构建了HCV逆转病毒重组体,以利于HCV的胞内基因表达调控研究,更为探索HCV分子致病机制和转基因动物及基因治疗提供可靠的物质基础。     

破坏HCV组装病毒体的重要基因

据美国BIOCOMPARE科技新闻网（2008／4／11）报道，HCV（Hepatitis C Virion，C型肝炎病毒）是一种危害人类极严重的病毒体，全球感染率超过3％，在美国估计有400万人受到感染。美国佛罗里达州Scripps感染学院的研究人员发现，将病毒的NS5A磷酸蛋白进行突变，能够破坏病毒体的产生。研究人员表示：NS5A磷酸蛋白主要负责RNA的复制工作，一旦此蛋白被破坏，HCV就无法正常组装完成病毒体，显示此NS5A磷酸蛋白对HCV的重要性。     

黄病毒多功能酶NS3研究进展

黄病毒非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白,其N端为丝氨酸蛋白酶结构域,C端为RNA解旋酶／核苷三磷酸酶／RNA 5’三磷酸酶结构域。NS3在病毒前体蛋白的加工和病毒基因组的复制过程中发挥重要功能。对NS3的研究有助于新型疫苗和抗病毒药物的设计。本文试图对近年来NS3研究的进展情况进行一简要的回顾。     

黄病毒多功能酶NS3研究进展

黄病毒非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白,其N端为丝氨酸蛋白酶结构域,C端为RNA解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA 5′三磷酸酶结构域。NS3在病毒前体蛋白的加工和病毒基因组的复制过程中发挥重要功能。对NS3的研究有助于新型疫苗和抗病毒药物的设计。本文试图对近年来NS3研究的进展情况进行一简要的回顾。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

中国人丙型肝炎病毒CTL多表位肽诱发的细胞免疫应答

目的:观察丙型肝炎病毒(HCV)C区、E区、NS3,NS4,NS5区的CTL模拟表位所诱导的细胞免疫.方法:用计算机预测的12条多肤体外刺激外周血单个核细胞,观察其增值情况,ELLSA方法检测培养上清中IFN-γ,水平的变化.结果:(1)NS4B(1793-1801)SMMAFSAAL和NS5 A(1991-1999)VISDFKVWL刺激HCV患者外周血单核细胞后,患者PBMC出现了明显的增值;(2)培养上清中的实验组IFN-γ水平明显高于阴性对照组.结论:预测的HCV CTL表位NS4B(1793-1801)NS5A(1991-1999)能够引起一定水平的细胞免疫.     

聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达

目的 以聚合酶链反应（PCR）突变方法诱导丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶活性位点ser1165的突变，获得全长非结构基因3（NS3）／4a的表达与纯化。方法 分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物，诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物，产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物。再次PCR扩增突变模板，分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub，转化大肠杆菌BL21（DE3）pCG1，诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE－Sepharose、NTA纯化，Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用。结果 获得诱导突变的模板，Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割，部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割，纯化后的HCV NS3／4a蛋白在SDS－PAGE胶上显示为双带。结论 PCR突变方法简便、有效，获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达，NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在。